تقنية البوابة
طريقة استنساخ Gateway هي طريقة استنساخ جزيئي ابتكرتها شركة Invitrogen وسوّقتها تجاريًا منذ أواخر التسعينيات، وتعتمد على تفاعلات إعادة التركيب التكاملية والاستئصالية التي تحدث عند إصابة البكتيريا بواسطة عاثية لامدا . توفر هذه التقنية طريقة سريعة وفعالة للغاية لنقل تسلسلات الحمض النووي إلى أنظمة متعددة النواقل لإجراء التحليل الوظيفي والتعبير البروتيني باستخدام مواقع att الخاصة بـ Gateway ومزيجين إنزيميين خاصين هما BP Clonase وLR Clonase. في الجسم الحي ، تُسهّل هذه التفاعلات من خلال إعادة تركيب مواقع الارتباط من كروموسوم لامدا/العاثية (attP) والبكتيريا (attB). نتيجةً لإعادة التركيب بين موقعي attP وattB، تندمج العاثية في الجينوم البكتيري محاطةً بموقعي إعادة تركيب جديدين (attLeft وattRight). يمكن أن ينتج كل من إزالة العاثية من الكروموسوم البكتيري وتجديد مواقع attP و attB عن إعادة تركيب مواقع attL و attR في ظل ظروف معينة.
تُضاف تسلسلات الحمض النووي المطلوبة إلى نسخ مُعدّلة من مواقع Gateway Att الخاصة. يحدث تفاعلان إنزيميان، هما BP Clonase وLR Clonase. يحدث تفاعل BP Clonase بين مواقع attB المحيطة بالقطعة المُدخلة ومواقع attP في ناقل المُعطي. يُحفّز هذا التفاعل بواسطة مزيج إنزيم BP Clonase، وينتج عنه مُستنسخ الدخول الذي يحتوي على الحمض النووي المطلوب مُحاطًا بنطاقات attL. وكنتيجة ثانوية للتفاعل، يُستأصل جين ccdB القاتل من ناقل المُعطي. يحدث تفاعل LR Clonase بين مناطق attL في مُستنسخ الدخول الناتج ومناطق attR في ناقل الهدف، ويُحفّز بواسطة مزيج إنزيم LR Clonase. ونتيجةً لذلك، يُنتج مُستنسخ تعبير يحتوي على الحمض النووي المطلوب مُحاطًا بمناطق attB. وكما في تفاعل BP، يُقطع تسلسل الحمض النووي الذي يحتوي على جين ccdB من ناقل الهدف.
تم استنساخ أرشيفات ضخمة من نسخ Gateway Entry، التي تحتوي على الغالبية العظمى من إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) البشرية والفأرية والجرذية، من مكتبات cDNA البشرية أو تصنيعها كيميائيًا لدعم مجتمع البحث العلمي بتمويل من معاهد الصحة الوطنية ( NIH ) (مثل مجموعة جينات الثدييات، http://mgc.nci.nih.gov/ ، مؤرشفة في 25 فبراير 2015 على Wayback Machine ). يُسهّل توفر هذه الكاسيتات الجينية في بلازميد استنساخ Gateway القياسي على الباحثين نقلها بسرعة إلى بلازميدات تُسهّل تحليل وظائف الجينات. صحيح أن استنساخ Gateway يستغرق وقتًا أطول في الإعداد الأولي، وهو أغلى من طرق الاستنساخ التقليدية القائمة على إنزيمات التقييد والربط ، إلا أنه يوفر الوقت ويُقدّم استنساخًا أبسط وأكثر كفاءة للتطبيقات اللاحقة.
وقد تم اعتماد هذه التقنية على نطاق واسع من قبل مجتمع أبحاث علوم الحياة، وخاصة للتطبيقات التي تتطلب نقل آلاف من أجزاء الحمض النووي إلى نوع واحد من البلازميد (على سبيل المثال، بلازميد يحتوي على محفز CMV للتعبير عن البروتين في الخلايا الثديية)، أو لنقل جزء واحد من الحمض النووي إلى العديد من أنواع البلازميدات المختلفة (على سبيل المثال، للتعبير عن البروتين البكتيري والحشري والثديي).
الإجراء الأساسي
تتمثل الخطوة الأولى في استنساخ بوابة Gateway في إعداد نسخة من مدخل البوابة. وهناك عدة طرق مختلفة لإنشاء هذه النسخة.
- تُضاف متواليات Gateway attB1 و attB2 إلى طرفي 5' و 3' لجزء من الجين، على التوالي، باستخدام بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الخاصة بالجين وتضخيم PCR. ثم تُخلط نواتج تضخيم PCR مع مزيج خاص من البلازميدات يُسمى "ناقلات Gateway المانحة" (مصطلحات Invitrogen) وإنزيمات "BP Clonase" الخاصة. يحفز مزيج الإنزيمات إعادة التركيب وإدخال ناتج PCR الذي يحتوي على متوالية attB في مواقع إعادة التركيب attP في ناقل Gateway المانح. عندما تكون الكاسيتة جزءًا من البلازميد المستهدف، يُشار إليها باسم "نسخة الإدخال" في تسمية Gateway، وتُسمى متواليات إعادة التركيب بنوع Gateway "attL".
- تتم إضافة طرف قصير يحتوي على attL باستخدام طريقة TOPO، وهي تقنية يتم فيها استنساخ أجزاء الحمض النووي في نواقل محددة دون الحاجة إلى إنزيمات ربط الحمض النووي.
- يمكن استنساخ تسلسل الحمض النووي المطلوب في موقع استنساخ متعدد يحتوي على attL باستخدام إنزيم التقييد .
الخطوة الثانية في استنساخ Gateway هي تحضير ناقل Gateway Destination. من المهم اختيار الناقل المستهدف الأنسب لهدفك عند تحضير نسخة التعبير. بعد ذلك، يمكن نقل كاسيت الجين الموجود في نسخة Gateway Entry بسهولة وكفاءة إلى أي ناقل Gateway Destination (وهو مصطلح تستخدمه Invitrogen لأي بلازميد Gateway يحتوي على تسلسلات إعادة التركيب "attR" وعناصر مثل المحفزات وعلامات الإبيتوب، ولكن ليس إطارات القراءة المفتوحة ) باستخدام مزيج الإنزيمات الخاص "LR Clonase". تم إنتاج آلاف من بلازميدات Gateway Destination وهي متاحة مجانًا للباحثين حول العالم. تشبه نواقل Gateway Destination نواقل التعبير التقليدية التي تحتوي على مواقع استنساخ متعددة، حيث يتم إدخال الجين المطلوب قبل ذلك، باستخدام هضم إنزيمات التقييد والربط. تتوفر نواقل Gateway Destination تجاريًا من Invitrogen وEMD ( Novagen ) وCovalys.
الخطوة الثالثة في استنساخ Gateway هي تحضير نسخة التعبير الجيني. تأكد من استخدام التسلسل أو الهضم الإنزيمي للتحقق من سلامة نسخة التعبير. بمجرد أن تعمل النسخة، يمكنك تحويل أو نقل الجينات إلى الخلايا التي تنوي استخدامها في أبحاثك.
بما أن تقنية الاستنساخ Gateway تستخدم تسلسلات إعادة التركيب الحاصلة على براءة اختراع، ومزيجات إنزيمية خاصة متوفرة فقط من Invitrogen، فإن هذه التقنية لا تسمح للباحثين بتغيير الموردين وتساهم في تأثير التقييد لجميع هذه الإجراءات الحاصلة على براءة اختراع.
باختصار، الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها استنساخ بوابة الإنترنت:
- تفاعل بوابة BP: ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع مواقع attB المجاورة (يمكن استخدام طرق أخرى لعزل الحمض النووي في هذه الخطوة، مثل الهضم بالإنزيمات القاطعة) + ناقل مانح يحتوي على مواقع attP + إنزيم BP clonase => مستنسخ بوابة الدخول، يحتوي على مواقع attL، ويحيط بالجين المستهدف.
- تفاعل بوابة LR: مستنسخ الدخول الذي يحتوي على مواقع attL + ناقل الوجهة الذي يحتوي على مواقع attR، والمحفزات والعلامات + إنزيم LR clonase => مستنسخ التعبير الذي يحتوي على مواقع attB، ويحيط بالجين محل الاهتمام، وجاهز للتعبير الجيني .
المزايا
- المرونة : يمكن نقل تسلسل الحمض النووي الذي يهمك عبر أي نظام تعبير في خطوة إعادة تركيب واحدة فقط عند إنشاء نسخة الإدخال المستنسخة به.
- السرعة : بدلاً من استغراق يومين أو أكثر في عملية الاستنساخ التقليدية باستخدام التقييد والربط، تتيح تقنية Gateway إنشاء بنية التعبير في يوم واحد فقط. كما يمكن استنساخ نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل attB-PCR مباشرةً في النواقل المستهدفة بإجراء تفاعلي BP وLR في نفس الأنبوب. لا تتطلب عملية الاستنساخ أي إجراءات للتقييد أو الربط أو تنقية الهلام.
- استنساخ أجزاء متعددة : يمكن استخدام تقنية استنساخ Gateway لإدخال عدة قطع من الحمض النووي في وقت واحد في العديد من النواقل داخل أنبوب واحد. ولإنشاء نسخة التعبير المطلوبة، يمكن استنساخ ما يصل إلى أربعة أجزاء من الحمض النووي في ناقل Gateway واحد بترتيب واتجاه دقيقين داخل أنبوب واحد. تصميم نواقل Gateway هو ما يُمكّن من ذلك.
- كفاءة عالية : تستخدم طريقة الاستنساخ البوابية علامات اختيار إيجابية وسلبية لزيادة فرص نجاح استنساخ الجين. وهذا يعني أن العملية أكثر كفاءة، وبالتالي تزيد احتمالية الحصول على نتائج ناجحة.
- الشمولية : يمكن استنساخ جميع أنواع شظايا الحمض النووي باستخدام تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتوفر الاستنساخ لأنواع عديدة من الكائنات الحية، من الثدييات إلى البكتيريا.
انظر أيضاً
مراجع
- "الاستنساخ البوابي" . أساسيات الاستنساخ الجزيئي . شركة ثيرمو فيشر العلمية.
- هارتلي جيه إل، تمبل جي إف، براش إم إيه (نوفمبر 2000). " استنساخ الحمض النووي باستخدام إعادة التركيب الموضعي في المختبر" . أبحاث الجينوم . 10 (11): 1788-1795 . doi : 10.1101/gr.143000 . PMC 310948. PMID 11076863 .
- كاتزن ، ف. (أبريل 2007). "استنساخ إعادة التركيب باستخدام بوابة (Gateway®): نظام تشغيل بيولوجي". مجلة آراء الخبراء في اكتشاف الأدوية . 2 (4): 571-589 . doi : 10.1517/17460441.2.4.571 . PMID 23484762. S2CID 22606399 .
- فرويلر إف، ستيتلر تي، مايرهوفر إم، ليدر إل، ماير إل إم (يونيو 2008). "تطوير نظام ناقل جديد قائم على بوابة Gateway للتعبير الفعال والمتعدد المتوازي عن البروتينات في الإشريكية القولونية". Protein Expr. Purif . 59 (2): 232–41 . doi : 10.1016/j.pep.2008.02.003 . PMID 18375142 .
- هارتلي، جيه إل (فبراير 2003). "استخدام نظام البوابة للتعبير البروتيني في مضيفات متعددة". بروتوكولات علم البروتين الحالية . الفصل 5: 5.17.1-10. doi : 10.1002/0471140864.ps0517s30 . PMID 18429245 .
- بتاشن، م. (1992). مفتاح جيني: العاثيات (لامدا) والكائنات الحية العليا . كامبريدج، ماساتشوستس: سيل برس. ISBN 0-86542-209-5. OCLC 25713934 .
- البيولوجيا الجزيئية