التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة

التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة ( LAMP ) هو تقنية أحادية الأنبوب لتضخيم الحمض النووي ( DNA ) ^{[ 2 ]} لأغراض التشخيص، ويُعد بديلاً منخفض التكلفة للكشف عن بعض الأمراض. ^{[ 3 ]} تقنية LAMP هي تقنية تضخيم متساوي الحرارة للأحماض النووية . على عكس تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، حيث يُجرى التفاعل بسلسلة من خطوات أو دورات درجة الحرارة المتناوبة، يُجرى التضخيم المتساوي الحرارة عند درجة حرارة ثابتة، ولا يتطلب جهاز تدوير حراري . ابتكرت شركة إيكن كيميكال في طوكيو تقنية LAMP عام 1998. ^{[ 1 ]} يجمع التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة بالنسخ العكسي (RT-LAMP) بين تقنية LAMP وخطوة النسخ العكسي للكشف عن الحمض النووي الريبوزي (RNA).

في تقنية LAMP، يتم تضخيم التسلسل المستهدف عند درجة حرارة ثابتة تتراوح بين 60 و65 درجة مئوية (140-149 درجة فهرنهايت) باستخدام مجموعتين أو ثلاث مجموعات من البادئات وإنزيم بوليميراز مثل جزء Bst Klenow ذي نشاط إزاحة سلسلة عالٍ بالإضافة إلى نشاط التضاعف. عادةً، تُستخدم أربع بادئات مختلفة لتضخيم ست مناطق متميزة على الجين المستهدف، مما يزيد من الخصوصية. ويمكن لزوج إضافي من "بادئات الحلقة" تسريع التفاعل بشكل أكبر. ^{[ 4 ]} كمية الحمض النووي المُنتَج في تقنية LAMP أعلى بكثير من التضخيم القائم ^على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) . ^{[ 1 ]} يمكن تصميم البادئات باستخدام العديد من البرامج، مثل PrimerExplorer و MorphoCatcher [ ^{5 ]} وأداة NEB LAMP Primer Design Tool . بالنسبة لفحص تعدد أشكال النوكليوتيدات المحافظة والخاصة بالأنواع، فإن الجمع بين PrimerExplorer و MorphoCatcher مفيد للغاية في معظم تطبيقات التشخيص، لأنه يسمح بتحديد موقع النوكليوتيدات الخاصة بالأنواع في نهايات 3' للبادئات لتعزيز خصوصية التفاعلات.  

يمكن الكشف عن ناتج التضخيم باستخدام قياس الضوء ، وذلك بقياس العكارة الناتجة عن ترسب بيروفوسفات المغنيسيوم في المحلول كمنتج ثانوي للتضخيم. ^{[ 7 ]} يتيح ذلك رؤيته بسهولة بالعين المجردة أو باستخدام طرق كشف ضوئي بسيطة للأحجام الصغيرة. يمكن متابعة التفاعل في الوقت الحقيقي إما بقياس العكارة ^{[ 8 ]} أو باستخدام التألق الفلوري بواسطة أصباغ متداخلة مثل SYTO 9. ^{[ 9 ]}

يمكن استخدام الأصباغ، مثل صبغة SYBR الخضراء ، لإحداث تغيير لوني مرئي بالعين المجردة دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن، أو للحصول على استجابة يمكن قياسها بدقة أكبر باستخدام أجهزة متخصصة. تتداخل جزيئات الصبغة مع الحمض النووي أو تُعلّمه مباشرةً، ويمكن ربطها بعدد النسخ الموجودة في البداية. لذا، يمكن أن تكون تقنية LAMP كمية أيضًا. يُمكن الكشف عن تضخيم الحمض النووي بتقنية LAMP داخل الأنبوب باستخدام الكالسئين المحمّل بالمنغنيز ، والذي يبدأ بالتألق عند ارتباط المنغنيز بالبيروفوسفات أثناء تخليق الحمض النووي في المختبر. ^{[ 10 ]} تعتمد طريقة أخرى للكشف البصري عن نواتج تضخيم LAMP بالعين المجردة على قدرتها على التهجين مع الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) المرتبط بجزيئات الذهب النانوية (AuNP)، وبالتالي منع التغير اللوني الطبيعي من الأحمر إلى الأزرق البنفسجي الذي يحدث عادةً أثناء تكتل جزيئات الذهب بفعل الأملاح. لذا، فإن طريقة LAMP المقترنة بالكشف عن المُضخَّم بواسطة جسيمات الذهب النانوية (AuNP) قد تتميز عن الطرق الأخرى من حيث تقليل وقت التحليل، وتأكيد المُضخَّم عن طريق التهجين، واستخدام معدات أبسط (أي، لا حاجة إلى جهاز تدوير حراري، أو جهاز رحلان كهربائي، أو جهاز إضاءة فوق بنفسجية). ^{[ 11 ] [ 12 ]}

تُحدث مؤشرات الصبغة المعتمدة على الرقم الهيدروجيني، مثل الفينول الأحمر، تغيرًا في اللون من الوردي إلى الأصفر عند انخفاض قيمة الرقم الهيدروجيني للتفاعل أثناء تضخيم الحمض النووي. ^{[ 13 ]} ونظرًا لتغير اللون الواضح، تُعد هذه الطريقة الأكثر شيوعًا في قراءة نتائج فحوصات RT-LAMP. ^{[ 13 ]} مع ذلك، تتطلب هذه القراءة المعتمدة على تغير الرقم الهيدروجيني محلول تفاعل ضعيف التنظيم، مما يُشكل تحديًا كبيرًا عند استخدام عينات خام ذات رقم هيدروجيني متغير. ^{[ 13 ]} يستخدم فحص قياس الألوان الثاني مؤشرات أيونات المعادن ، مثل هيدروكسي نافثول الأزرق (HNB)، الذي يتغير لونه من البنفسجي إلى الأزرق عند انخفاض تركيز أيونات المغنيسيوم الحرة (Mg²⁺) ^، والتي تُشكل راسب بيروفوسفات المغنيسيوم أثناء تضخيم الحمض النووي. ^{[ 13 ]}

تقنية LAMP هي تقنية حديثة نسبيًا لتضخيم الحمض النووي، وتتميز ببساطتها ومتانتها وانخفاض تكلفتها، مما يوفر مزايا كبيرة. تتمتع LAMP بإمكانية استخدامها كفحص بسيط في الميدان أو عند نقطة تقديم الرعاية الصحية من قبل الأطباء. ^{[ 14 ]} ولأن LAMP تقنية متساوية الحرارة، مما يُغني عن الحاجة إلى أجهزة التدوير الحراري باهظة الثمن المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR)، فقد تكون طريقة مفيدة بشكل خاص لتشخيص الأمراض المعدية في البلدان ذات الدخل المنخفض والمتوسط. ^{[ 15 ]} تُجرى دراسات واسعة النطاق على LAMP للكشف عن أمراض معدية مثل داء الفيلاريات ، ^{[ 16 ]} وفيروس زيكا، ^{[ 17 ]} والسل، ^{[ 18 ]} والملاريا، ^{[ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]} ومرض النوم، ^{[ 22 ]} وفيروس SARS-CoV-2 . ^{[ 23 ] [ 24 ]} أما في المناطق النامية، فلم يتم التحقق من صحتها بشكل شامل بعد للكشف عن مسببات الأمراض الشائعة الأخرى ^{. [ 14 ]}

لوحظ أن تقنية LAMP أقل حساسية (أكثر مقاومة) من تقنية PCR للمثبطات في العينات المعقدة كالدم، ويرجع ذلك على الأرجح إلى استخدام بوليميراز DNA مختلف (عادةً بوليميراز Bst - Bacillus stearothermophilus - DNA بدلاً من بوليميراز Taq المستخدم في PCR). وتصف عدة تقارير نجاح الكشف عن مسببات الأمراض من عينات معالجة بشكل طفيف، مثل الدم المعالج حرارياً، ^{[ 25 ] [ 26 ]} أو في وجود مصفوفات العينات السريرية. ^{[ 27 ]} قد تكون هذه الميزة لتقنية LAMP مفيدة في البيئات ذات الموارد المحدودة أو الميدانية حيث قد يكون استخلاص DNA أو RNA بالطريقة التقليدية قبل الاختبارات التشخيصية غير عملي.

استُخدمت تقنية LAMP أيضًا في المساعدة على تحديد سوائل الجسم. وبفضل بساطتها، يتمكن الباحثون من فحص عينة واحدة أو أكثر في وقت قصير، مما يُسهم في تقليل الوقت اللازم للحصول على النتائج. كما تمكن الباحثون من إضافة عوامل لتسهيل عملية التحديد، مثل صبغة مؤشر المعادن والفينول الأحمر، مما يسمح باستخدام الهاتف الذكي والعين المجردة على التوالي لتحليل النتائج. ^{[ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]}

تُعدّ تقنية LAMP أقل تنوعًا من تقنية PCR، وهي التقنية الأكثر شيوعًا لتضخيم الأحماض النووية. تُستخدم LAMP بشكل أساسي كتقنية تشخيصية أو كاشفة، ولكنها غير مناسبة للاستنساخ أو العديد من تطبيقات البيولوجيا الجزيئية الأخرى التي تُتيحها تقنية PCR. نظرًا لأن LAMP تستخدم 4 (أو 6) بادئات تستهدف 6 (أو 8) مناطق ضمن جزء صغير نسبيًا من الجينوم، ولأن تصميم البادئات يخضع للعديد من القيود، فمن الصعب تصميم مجموعات البادئات لتقنية LAMP بشكل عشوائي. تُستخدم عادةً حزم برامج مجانية مفتوحة المصدر ^{[ 31 ]} أو تجارية للمساعدة في تصميم بادئات LAMP، على الرغم من أن قيود تصميم البادئات تعني وجود حرية أقل في اختيار الموقع المستهدف مقارنةً بتقنية PCR.

في التطبيقات التشخيصية، يجب الموازنة بين ذلك وبين ضرورة اختيار هدف مناسب (مثل موقع محفوظ في جينوم فيروسي شديد التباين، أو هدف خاص بسلالة معينة من مسببات الأمراض). قد يتطلب الأمر استخدام تسلسلات متدهورة متعددة لتغطية السلالات المتغيرة المختلفة لنفس النوع. ومن نتائج استخدام هذا المزيج من البادئات حدوث تضخيم غير نوعي في المراحل المتأخرة من عملية التضخيم.

تُعدّ تقنيات التعدد في تفاعل التضخيم المتساوي الحرارة (LAMP) أقل تطورًا من تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يزيد العدد الأكبر من البادئات لكل هدف في LAMP من احتمالية تفاعل البادئات مع بعضها البعض في مجموعات الأهداف المتعددة. ينتج عن LAMP سلسلة من التكرارات المتكررة للمنطقة المستهدفة، مما يُؤدي إلى ظهور نمط "سلمي" أو نمط حزم مميز على الهلام، بدلًا من حزمة واحدة كما هو الحال في PCR. على الرغم من أن هذا لا يُشكّل مشكلة عند الكشف عن أهداف مفردة باستخدام LAMP، إلا أن تطبيقات PCR المتعددة "التقليدية" (نقطة النهاية) التي يتم فيها تأكيد هوية الهدف من خلال حجم الحزمة على الهلام غير ممكنة مع LAMP. وقد تم تحقيق التعدد في LAMP عن طريق اختيار منطقة مستهدفة تحتوي على موقع تقييد، وهضمها قبل فصلها على الهلام، بحيث يُنتج كل ناتج قطعة ذات حجم مميز، ^{[ 32 ]} على الرغم من أن هذه الطريقة تُضيف تعقيدًا إلى تصميم التجربة وبروتوكولها.

إن استخدام بوليميراز الحمض النووي المُزيح للسلسلة في تقنية تضخيم الحمض النووي المتساوي الحرارة (LAMP) يمنع أيضًا استخدام مجسات التحلل المائي، مثل مجسات TaqMan ، التي تعتمد على نشاط الإكسونوكلياز 5'-3' لبوليميراز Taq . وقد تم الإبلاغ عن نهج بديل للتعدد في الوقت الحقيقي يعتمد على مثبطات التألق. ^{[ 33 ]}

يمكن إضافة صبغة SYBR الخضراء لمراقبة تفاعل LAMP في الوقت الحقيقي. مع ذلك، في المراحل المتأخرة من التضخيم، قد يُسهم تضخيم ثنائي البادئ في ظهور إشارة إيجابية خاطئة. يسمح استخدام إنزيم البيروفوسفاتاز غير العضوي في مزيج تفاعل SYBR باستخدام تحليل الذوبان لتمييز التضخيم الصحيح ^{[ 34 ].}

على الرغم من اقتراح استراتيجيات مختلفة للتخفيف من النتائج الإيجابية الكاذبة في التحليلات القائمة على هذه الطريقة، إلا أن التضخيم غير النوعي الناتج عن عوامل متعددة، بما في ذلك غياب آليات التحكم الحراري، يُعد أحد أبرز عيوب التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة. ^{[ 35 ] [ 36 ]}

أخيرًا، نظرًا لأن تقنية LAMP تتطلب درجات حرارة حضانة مرتفعة وثابتة (60-65  درجة مئوية)، فإنها تحتاج إلى نوع من آليات التسخين، أو منظم حرارة، أو عازل (وإن لم يكن بالضرورة جهاز تدوير حراري). هذا الشرط يجعل تقنية LAMP أقل ملاءمة للتشخيص الميداني السريع، الذي يُفترض أن يعمل في درجة حرارة الغرفة.

تدمج تقنية التضخيم بمساعدة التهجين باستخدام إنزيم RNase (RHAM) تقنية LAMP مع الإبلاغ الفلوري بوساطة إنزيم RNase HII . تستخدم هذه الطريقة مجموعة بادئات LAMP تقليدية لتضخيم التسلسل المستهدف بشكل أُسّي، يليها تهجين مسبار فلوري يحتوي على نيوكليوتيدات ريبية مع ناتج التضخيم. ثم يقوم إنزيم RNase HII بفصل المسبار، مُطلقًا إشارة فلورية قابلة للكشف. ^{[ 37 ] [ 38 ]}