التسلسل في الوقت الحقيقي لجزيء واحد

لإعداد المكتبة، يتم وضع شظايا الحمض النووي في شكل دائري باستخدام ربط محولات الدبوس الشعري. ^{[ 3 ]}

لكل قاعدة من قواعد النيوكليوتيدات جزيء صبغة فلورية مُقابل، يُمكّن الكاشف من تحديد القاعدة التي يُدمجها إنزيم بوليميراز الحمض النووي أثناء عملية تخليق الحمض النووي . يرتبط جزيء الصبغة الفلورية بسلسلة الفوسفات في النيوكليوتيد. عند دمج النيوكليوتيد بواسطة إنزيم بوليميراز الحمض النووي، تنفصل الصبغة الفلورية مع سلسلة الفوسفات كجزء من عملية تخليق الحمض النووي الطبيعية ، حيث تتكون رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر لإطالة سلسلة الحمض النووي. ثم ينتشر جزيء الصبغة الفلورية المنفصل خارج نطاق الكشف، فلا يعود بالإمكان رصد الإشارة الفلورية. ^{[ 4 ]}

الموجه ذو النمط الصفري (ZMW) هو بنية حصر نانوفوتونية تتكون من ثقب دائري في طبقة تغليف من الألومنيوم مترسبة على ركيزة من السيليكا الشفافة. ^{[ 5 ]}

 يبلغ قطر فتحات ZMW حوالي 70 نانومترًا  وعمقها حوالي 100 نانومتر. ونظرًا لسلوك الضوء عند مروره عبر فتحة صغيرة، يتلاشى المجال البصري بشكل أُسّي داخل الحجرة. ^{[ 6 ] [ 7 ]}

يبلغ حجم الملاحظة داخل جهاز ZMW المُضاء حوالي 20 زيبتولتر (20 × 10⁻²¹ ^لترًا ). وبفضل هذا الحجم الصغير، يتم التخلص من التألق الخلفي الناتج عن النيوكليوتيدات الفلورية الحرة غير المدمجة الموجودة في المحلول. ضمن هذا الحجم، يمكن بسهولة رصد نشاط بوليميراز الحمض النووي الذي يدمج نيوكليوتيدًا واحدًا، حيث يُمثل كل نيوكليوتيد بلون منفصل. ^{[ 4 ] [ 8 ]}

عند بدء التسويق، كان طول القراءة يتبع التوزيع الطبيعي بمتوسط ​​حوالي 1100 قاعدة. وقد أدى إصدار مجموعة كيميائية جديدة في أوائل عام 2012 إلى زيادة طول القراءة لجهاز التسلسل؛ حيث ذكر أحد أوائل عملاء هذه المجموعة الكيميائية أن متوسط ​​أطوال القراءة يتراوح بين 2500 و2900 قاعدة. ^{[ 13 ]}

أدت مجموعة أدوات الكيمياء XL التي تم إصدارها في أواخر عام 2012 إلى زيادة متوسط ​​طول القراءة إلى أكثر من 4300 قاعدة. ^{[ 14 ] [ 15 ]}

في 21 أغسطس 2013، أصدرت شركة PacBio مجموعة ربط بوليميراز الحمض النووي الجديدة P4. يتميز إنزيم P4 هذا بمتوسط ​​طول قراءة يزيد عن 4300 قاعدة عند استخدامه مع تقنية التسلسل C2، وأكثر من 5000 قاعدة عند استخدامه مع تقنية XL. ^{[ 16 ]} تتشابه دقة الإنزيم مع دقة C2، حيث تصل إلى QV50 عند تغطية تتراوح بين 30 و40 ضعفًا. وقد وفرت خصائص P4 الناتجة تجميعات عالية الجودة باستخدام عدد أقل من خلايا SMRT مع تحسين تحديد المتغيرات. ^{[ 16 ]} عند استخدامه مع اختيار حجم الحمض النووي المدخل (باستخدام جهاز الفصل الكهربائي مثل BluePippin)، ينتج عنه متوسط ​​طول قراءة يزيد عن 7 كيلوبايت. ^{[ 17 ]}

في 3 أكتوبر 2013، أصدرت شركة PacBio تركيبة جديدة من الكواشف لإنزيم PacBio RS II، وهو بوليميراز الحمض النووي P5 بتقنية C3 (P5-C3). تعمل هذه التركيبة معًا على زيادة طول قراءات التسلسل إلى متوسط ​​8500 قاعدة تقريبًا، مع تجاوز أطول القراءات 30000 قاعدة. ^{[ 18 ]} ويبلغ معدل الإنتاجية لكل خلية SMRT حوالي 500 مليون قاعدة، كما يتضح من نتائج التسلسل من خط خلايا CHM1. ^{[ 19 ]}

في 15 أكتوبر 2014، أعلنت شركة PacBio عن إطلاق تقنية P6-C4 الجديدة لنظام RS II، والتي تمثل الجيل السادس من البوليميراز والجيل الرابع من تقنيات التسلسل، مما يزيد متوسط ​​طول القراءة إلى 10,000 - 15,000 قاعدة، مع تجاوز أطول قراءات 40,000 قاعدة. وقُدِّر معدل الإنتاجية باستخدام هذه التقنية الجديدة بين 500 مليون إلى مليار قاعدة لكل خلية SMRT، وذلك بحسب العينة المراد تسلسلها. ^{[ 20 ] [ 21 ]} وكانت هذه النسخة الأخيرة من التقنية المُتاحة لجهاز RS.

يتأثر معدل الإنتاجية لكل تجربة في هذه التقنية بطول قراءة جزيئات الحمض النووي المتسلسلة، بالإضافة إلى إجمالي تعدد الإرسال لخلية SMRT. احتوى النموذج الأولي لخلية SMRT على حوالي 3000 ثقب ZMW، مما أتاح تسلسل الحمض النووي بالتوازي. عند طرحها تجاريًا، زُوّدت كل خلية من خلايا SMRT بـ 150,000 ثقب ZMW، تُقرأ على مجموعتين من 75,000 ثقب. ^{[ 22 ]} في أبريل 2013، أصدرت الشركة نسخة جديدة من جهاز التسلسل تُسمى "PacBio RS II"، تستخدم جميع ثقوب ZMW البالغ عددها 150,000 ثقبًا في وقت واحد، مما يضاعف معدل الإنتاجية لكل تجربة. ^{[ 23 ] [ 24 ]} في نوفمبر 2013، حقق أعلى معدل إنتاجية باستخدام تقنية ربط P5، وكيمياء C3، واختيار حجم BluePippin، وجهاز PacBio RS II، إنتاجية رسمية بلغت 350 مليون قاعدة لكل خلية SMRT، على الرغم من أن مجموعة بيانات بشرية جديدة نُشرت باستخدام نفس الكيمياء حققت متوسط ​​500 مليون قاعدة لكل خلية SMRT. وتختلف الإنتاجية باختلاف نوع العينة المراد تسلسلها. ^{[ 25 ]} مع إدخال كيمياء P6-C4، ارتفع معدل الإنتاجية النموذجي لكل خلية SMRT إلى ما بين 500 مليون ومليار قاعدة.

في سبتمبر 2015، أعلنت الشركة عن إطلاق جهاز تسلسل جديد، وهو نظام Sequel، الذي زاد من السعة إلى مليون ثقب ZMW. ^{[ 26 ] [ 27 ]}

كانت أطوال القراءة الأولية لجهاز Sequel مماثلة لجهاز RS، ثم أدت الإصدارات الكيميائية اللاحقة إلى زيادة طول القراءة.

في 23 يناير 2017، تم إصدار النسخة الثانية من تقنية V2. وقد زادت متوسط ​​أطوال القراءة إلى ما بين 10000 و 18000 قاعدة. ^{[ 28 ]}

في 8 مارس 2018، تم إصدار تقنية 2.1. وقد زادت هذه التقنية متوسط ​​طول القراءة إلى 20,000 قاعدة، ونصف القراءات التي يزيد طولها عن 30,000 قاعدة. كما زاد إنتاج كل خلية SMRT إلى 10 أو 20 مليار قاعدة، وذلك بالنسبة لمكتبات الإدخالات الكبيرة أو مكتبات الإدخالات القصيرة (مثل مكتبات الأمبليكون ) على التوالي. ^{[ 29 ]}

في 19 سبتمبر 2018، أعلنت الشركة عن تقنية Sequel 6.0، حيث زاد متوسط ​​طول القراءة إلى 100,000 قاعدة للمكتبات ذات الإدخالات القصيرة، و30,000 قاعدة للمكتبات ذات الإدخالات الطويلة. كما زاد إنتاج خلايا SMRT إلى 50 مليار قاعدة للمكتبات ذات الإدخالات القصيرة. ^{[ 10 ]}

في أبريل 2019، أطلقت الشركة خلية SMRT جديدة بثمانية ملايين ZMW، ^{[ 30 ]} مما زاد الإنتاجية المتوقعة لكل خلية SMRT بمقدار ثمانية أضعاف. ^{[ 31 ]} أفاد عملاء الوصول المبكر في مارس 2019 عن إنتاجية بلغت 250 جيجابايت من الناتج الخام لكل خلية مع قوالب بطول 15 كيلوبايت تقريبًا، و67.4 جيجابايت لكل خلية مع قوالب لجزيئات ذات وزن جزيئي أعلى، وذلك في أكثر من 58 خلية تشغيلية. ^{[ 32 ]} يُبلغ الآن عن أداء النظام إما بقراءات طويلة متواصلة ذات وزن جزيئي عالٍ أو بقراءات HiFi المصححة مسبقًا (المعروفة أيضًا باسم تسلسل التوافق الدائري (CCS)). بالنسبة للقراءات ذات الوزن الجزيئي العالي، يبلغ طول نصف القراءات تقريبًا أكثر من 50 كيلوبايت.

تتضمن تقنية HiFi قواعد مصححة بجودة أعلى من درجة Phred Q20، باستخدام عمليات تضخيم متكررة للتصحيح. وتستوعب هذه التقنية تضخيمات يصل طولها إلى 20 كيلوبايت.