انتقادات للمروجين

يُعدّ اختبار تأثير المحفز تقنيةً تُستخدم في البيولوجيا الجزيئية لتحديد كيفية تأثير مناطق معينة من شريط الحمض النووي ، والتي تُعرف عادةً بالمحفزات ، على نسخ الجينات اللاحقة. في الظروف الطبيعية، ترتبط البروتينات بالمحفز وتُنشّط أو تُثبّط عملية النسخ. في اختبار تأثير المحفز ، تُجرى طفرات نقطية أو حذف في مناطق محددة من المحفز، ثم يُقاس نسخ الجين. يُمكن ملاحظة مساهمة منطقة معينة من المحفز من خلال مستوى النسخ. إذا غيّرت طفرة أو حذف مستوى النسخ، فمن المعروف أن تلك المنطقة من المحفز قد تكون موقع ارتباط أو عنصرًا تنظيميًا آخر. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]}

غالبًا ما يتم اختبار قدرة المحفز على التعبير الجيني عن طريق حذف أجزاء من طرفي 5' أو 3' لسلسلة الحمض النووي؛ ويُعد هذا الاختبار أسهل بناءً على الهضم المتكرر باستخدام إنزيمات القطع وتنقية الشظايا ذات الأحجام المحددة باستخدام الهلام. غالبًا ما يكون من الأسهل ربط المحفز بالجين المُبلغ، ثم إنتاج كمية كبيرة من هذا الجين باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو زراعته في البكتيريا، ثم إجراء عمليات هضم متسلسلة باستخدام إنزيمات القطع على هذه العينة. يمكن بسهولة اختبار قدرة المحفزات الموجودة في اتجاه 5' عن طريق إزالة أجزاء من الطرف 5'، وينطبق الأمر نفسه على الطرف 3' لسلسلة المحفزات الموجودة في اتجاه 3'. ^{[ 4 ]}

نظرًا لأن المحفزات تحتوي عادةً على تسلسلات ارتباط للبروتينات التي تنظم عملية النسخ، فإن هذه البروتينات ضرورية أيضًا عند تقييم وظيفة المحفز. يمكن تحديد البروتينات المرتبطة بالمحفز باستخدام اختبار إزاحة الهجرة الكهربية (EMSA)، ويمكن تقييم تأثيرات تضمين أو استبعاد البروتينات مع المحفزات المُطفرة في هذا الاختبار. يتيح ذلك استخدام تقنية "التأثير على المحفز" ليس فقط لاكتشاف الموقع على شريط الحمض النووي الذي يؤثر على النسخ، ولكن أيضًا البروتينات التي تؤثر على هذا الشريط. كما يمكن أيضًا تقييم تأثيرات تفاعلات البروتينات مع بعضها البعض، بالإضافة إلى مواقع الارتباط، بهذه الطريقة؛ أما البروتينات المرشحة، فيجب تحديدها عن طريق اختبارات تفاعل البروتين/البروتين بدلًا من اختبار إزاحة الهجرة الكهربية (EMSA). ^{[ 5 ]}

هذا مثال على إجراء اختبار تحطيم المحفز، مقتبس من بولين وآخرون : ^{[ 6 ]}

1. استنسخ منطقة الحمض النووي التي يُعتقد أنها تعمل كمحفز. يُعدّ الاستنساخ ضروريًا لإجراء التحليل لأنه يضمن أن المحفز هو العامل الوحيد المؤثر على التعبير الجيني. غالبًا ما تتضمن هذه الخطوة استخلاص الحمض النووي من الكائن الحي الذي يوجد فيه، ثم تضخيمه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) .
2. قم بتسلسل المنطقة. يُعد تسلسل الحمض النووي ضروريًا لتحديد الاختلافات في المحفزات المتحولة عن المحفز الأصلي، ولربط هذه الاختلافات بالاختلافات في التعبير الجيني. بالإضافة إلى ذلك، فهو يُسهّل عملية الهضم الإنزيمي للمنطقة.
3. يُهضم الحمض النووي باستخدام إنزيمات القطع المناسبة. يمكن هضم المنطقة لإزالة العناصر التي يُعتقد أنها ليست جزءًا من المحفز. بالإضافة إلى ذلك، يجب إدخال جين المؤشر على مسافة محددة من المحفز في معظم المحفزات. في بعض طرق هضم المحفزات، تُستخدم عمليات هضم متعددة باستخدام إنزيمات القطع لإزالة عناصر المحفزات بشكل منهجي، مما يضمن عدم مساهمة المناطق المُزالة من المحفز في التعبير عن جين المؤشر .
4. إحداث طفرات في المحفز. يُعدّ إحداث الطفرات في المحفز ضروريًا في حال عدم استخدام طريقة إزالة جزء منه باستخدام الهضم الإنزيمي. يمكن توليد العديد من السلاسل المتحولة، ثم تسلسل هذه السلاسل وقياس نشاط المحفزات. غالبًا ما يكون هذا ضروريًا لأنه لا يمكن ضمان تعطيل موقع الارتباط بطفرة واحدة. يمكن أيضًا استخدام الطفرات غير الموجهة القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؛ حيث يمكن تعديل معايير تفاعل PCR المُحدث للطفرات لإدخال عدد معقول من الطفرات. مع ذلك، تتطلب الطبيعة العشوائية لتفاعل PCR فحص المزيد من السلاسل بعد هذه الخطوة.
5. ربط المحفزات المراد فحصها بجين مُخبِر لقياس مستويات التعبير الجيني. يجب أن يكون جين المُخبِر على مسافة كافية من المحفز بحيث يؤثر المحفز عليه كما يؤثر المحفز الطبيعي على الجين. يمكن التحقق من ذلك باستخدام عنصر التحكم الإيجابي (المحفز الكامل).
6. يتم تحويل الخلايا المستهدفة باستخدام تركيبات المحفز:المراسل المختلفة. يجب ربط تركيبات المحفز والمراسل في بلازميد، ثم تحويلها إلى خلايا يمكن فيها التعبير عن هذا البلازميد لقياس نشاط كل تسلسل محفز. كما يجب إضافة البروتينات التي تؤثر على المحفز إلى هذه الخلايا - وغالبًا ما توضع هذه البروتينات على نفس البلازميد أو على بلازميد مختلف تحت تنظيم محفز نشط بشكل دائم.
7. قياس معدلات نسخ الجين المُبلِّغ. يتم فحص نواتج الجينات وقياس معدلات نسخ الجين المُبلِّغ.

من خلال البيانات المُستقاة من تحليل المحفزات المختلفة، يُمكن تحديد تأثيرات أجزاء المحفز المختلفة. مع ذلك، قد لا تكون البيانات كافية، ما يستدعي إعادة التحليل باستخدام منطقة محفز مختلفة و/أو طفرات مختلفة.

• الطفرات الموجهة للموقع
• ملخص التقييد
• بصمة الحمض النووي