مجهر 4Pi

يُعدّ مجهر 4Pi مجهرًا فلوريًا ماسحًا بالليزر يتميز بدقة محورية محسّنة. وباستخدامه ، يمكن تحسين النطاق النموذجي للدقة المحورية من 500-700 نانومتر إلى 100-150 نانومتر، وهو ما يتوافق مع بقعة بؤرية كروية تقريبًا بحجم أصغر بمقدار 5-7 مرات من حجم بقعة المجهر البؤري القياسي . ^{[ 1 ]}  

يُحسَّن وضوح الصورة باستخدام عدستين موضوعيتين متقابلتين، تُركَّز كلتاهما على نفس الموقع الهندسي. كما يُضبط فرق طول المسار البصري عبر كل عدسة من العدستين الموضوعيتين بدقة ليكون في حده الأدنى. بهذه الطريقة، يمكن إضاءة الجزيئات الموجودة في منطقة التركيز المشتركة للعدستين بشكل متماسك من كلا الجانبين، ويمكن أيضًا جمع الضوء المنعكس أو المنبعث بشكل متماسك، أي أن التراكب المتماسك للضوء المنبعث على الكاشف ممكن. الزاوية المجسمة$أوميغا$تزداد الطاقة المستخدمة للإضاءة والكشف حتى تقترب من أقصى قيمة لها. في هذه الحالة، تتم إضاءة العينة والكشف عنها من جميع الجوانب في آن واحد.

يوضح الشكل طريقة تشغيل مجهر 4Pi. يُقسّم ضوء الليزر بواسطة مُقسّم شعاع ، ثم يُوجّه بواسطة مرايا نحو العدستين الشيئيتين المتقابلتين. عند نقطة التركيز المشتركة، يحدث تراكب لشعاعي الضوء المُركّزين. تُصدر الجزيئات المُثارة في هذه النقطة ضوءًا فلوريًا، والذي تجمعه العدستان الشيئيتان، ثم يُدمج بواسطة مُقسّم الشعاع نفسه، ويُحوّل بواسطة مرآة ثنائية اللون إلى كاشف. هناك، يمكن أن يحدث تراكب لمساري الضوء المنبعثين مرة أخرى.

في الحالة المثالية، يمكن لكل عدسة موضوعية أن تجمع الضوء من زاوية مجسمة من${\displaystyle \Omega =2\pi }$باستخدام عدستين موضوعيتين، يمكن جمع البيانات من جميع الاتجاهات (الزاوية المجسمة).${\displaystyle \Omega =4\pi }$يُشتق اسم هذا النوع من المجهر من أقصى زاوية مجسمة ممكنة للإثارة والكشف. عمليًا، لا يمكن تحقيق سوى زوايا فتحة تبلغ حوالي 140 درجة للعدسة الشيئية، وهو ما يتوافق مع${\displaystyle \Omega \approx 1.3\pi }$.

يمكن تشغيل المجهر بثلاث طرق مختلفة: في مجهر 4Pi من النوع A، يُستخدم التراكب المتماسك لضوء الإثارة لتوليد دقة أعلى. يُكتشف ضوء الانبعاث إما من جانب واحد فقط أو بتراكب غير متماسك من كلا الجانبين. في مجهر 4Pi من النوع B، يتداخل ضوء الانبعاث فقط. عند التشغيل في الوضع C، يُسمح لكل من ضوء الإثارة وضوء الانبعاث بالتداخل، مما يؤدي إلى أعلى زيادة ممكنة في الدقة (حوالي 7 أضعاف على طول المحور البصري مقارنةً بالمجهر متحد البؤر).

في المجهر الحقيقي رباعي الفوتون، لا يمكن توجيه الضوء أو تجميعه من جميع الاتجاهات بالتساوي، مما يؤدي إلى ظهور ما يُسمى بالفصوص الجانبية في دالة انتشار النقطة . عادةً (ولكن ليس دائمًا) يُستخدم مجهر الإثارة ثنائي الفوتون في المجهر رباعي الفوتون مع فتحة انبعاث دقيقة لتقليل هذه الفصوص الجانبية إلى مستوى مقبول.

في عام 1971، اقترح كريستوف كريمر وتوماس كريمر إنشاء صورة ثلاثية الأبعاد مثالية ، أي صورة تحمل معلومات المجال الكاملة لانبعاث مصدر نقطي في جميع الاتجاهات، وهو ما يسمى${\displaystyle 4\pi }$الهولوغرام. ^{[ 2 ] [ 3 ]} مع ذلك، فقد توصل المنشور الصادر عام 1978 ^{[ 4 ]} إلى استنتاج فيزيائي غير صحيح (أي بقعة ضوئية نقطية) وأغفل تمامًا الزيادة في الدقة المحورية باعتبارها الفائدة الحقيقية لإضافة الجانب الآخر من الزاوية المجسمة. ^{[ 5 ]} أول وصف لنظام عملي لمجهر 4Pi، أي الإعداد الذي يحتوي على عدستين متقابلتين متداخلتين، ابتكره ستيفان هيل عام 1991. ^{[ 6 ]} وقد أثبت ذلك تجريبيًا عام 1994. ^{[ 7 ]}

في السنوات اللاحقة، ازداد عدد تطبيقات هذا المجهر. فعلى سبيل المثال، أدى الجمع بين الإثارة والكشف المتوازيين مع 64 نقطة في العينة في وقت واحد، بالإضافة إلى تحسين الدقة المكانية، إلى تسجيل ديناميكيات الميتوكوندريا في خلايا الخميرة بنجاح باستخدام مجهر 4Pi في عام 2002. ^{[ 8 ]} أطلقت شركة Leica Microsystems ، المتخصصة في تصنيع المجاهر، نسخة تجارية منه في عام 2004 ^{[ 9 ]} ، ثم توقف إنتاجها لاحقًا.

حتى الآن، كانت أفضل جودة في مجهر 4Pi تُحقق بالاقتران مع تقنيات فائقة الدقة مثل مبدأ استنزاف الانبعاث المحفز (STED). ^{[ 10 ]} باستخدام مجهر 4Pi مع حزم إثارة وإزالة إثارة مناسبة، أمكن إنشاء  بقعة موحدة بحجم 50 نانومتر، وهو ما يُعادل انخفاضًا في حجم البؤرة مقارنةً بالمجهر متحد البؤر بمعامل 150-200 في الخلايا المثبتة. مع الجمع بين مجهر 4Pi ومجهر RESOLFT مع بروتينات قابلة للتبديل، أصبح من الممكن الآن التقاط صور للخلايا الحية في مستويات إضاءة منخفضة بدقة متساوية الأبعاد أقل من 40  نانومتر. ^{[ 11 ]}

• مجهر استنزاف الانبعاث المحفز (STED)
• المجهر متعدد البؤر (MUM)