مكتبة الحمض النووي التكميلي (cDNA)

📅 آخر تحديث: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 1 صور
الموسوعة الحرة

مكتبة الحمض النووي التكميلي (cDNA ) هي مجموعة من أجزاء الحمض النووي التكميلي (cDNA ) المستنسخة، تُدمج في مجموعة من الخلايا المضيفة، والتي تُشكل جزءًا من النسخ الجيني للكائن الحي، وتُخزن على شكل " مكتبة ". يُنتج الحمض النووي التكميلي (cDNA) من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المُستنسخ بالكامل الموجود في النواة ، وبالتالي لا يحتوي إلا على الجينات المُعبر عنها في الكائن الحي. وبالمثل، يمكن إنتاج مكتبات الحمض النووي التكميلي (cDNA) الخاصة بالأنسجة. في الخلايا حقيقية النواة ، يكون الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الناضج قد خضع لعملية التضفير ؛ لذا، يفتقر الحمض النووي التكميلي (cDNA) الناتج إلى الإنترونات ، ويمكن التعبير عنه بسهولة في الخلية البكتيرية. [ 1 ] على الرغم من أن المعلومات الموجودة في مكتبات الحمض النووي التكميلي (cDNA) تُعد أداة قوية ومفيدة نظرًا لسهولة تحديد منتجات الجينات، إلا أن هذه المكتبات تفتقر إلى معلومات حول المُعززات والإنترونات والعناصر التنظيمية الأخرى الموجودة في مكتبة الحمض النووي الجينومي . [ 2 ]

بناء مكتبة الحمض النووي التكميلي (cDNA)

تكوين مكتبة cDNA.

يُصنع الحمض النووي التكميلي (cDNA) من الحمض النووي الريبوزي الرسول الناضج (mRNA ) من خلية حقيقية النواة باستخدام إنزيم النسخ العكسي . في حقيقيات النوى، يميز ذيل متعدد الأدينين (poly-A) (المكون من سلسلة طويلة من نيوكليوتيدات الأدينين) الحمض النووي الريبوزي الرسول عن الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA ) والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) ، وبالتالي يمكن استخدامه كموقع بدء للنسخ العكسي. لكن تكمن المشكلة في أن بعض النسخ، مثل تلك الخاصة بالهيستون ، لا تحتوي على ذيل متعدد الأدينين . [ 3 ] [ 4 ]

استخلاص الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)

أولًا، يجب عزل قالب mRNA لإنشاء مكتبات cDNA. ولأن mRNA لا يحتوي إلا على إكسونات، يجب مراعاة سلامة mRNA المعزول لضمان إمكانية إنتاج البروتين المُشفَّر. يتراوح طول mRNA المعزول عادةً بين 500 زوج قاعدي و8 كيلوبايت. [ 5 ] توجد عدة طرق لتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA)، مثل استخلاص التريزول والتنقية العمودية . يمكن إجراء التنقية العمودية باستخدام راتنجات مغلفة بنوكليوتيدات dT قليلة الوحدات، ويمكن استغلال خصائص mRNA، مثل وجود ذيل متعدد الأدينين، حيث ترتبط فقط تسلسلات mRNA التي تحتوي على هذه الخاصية. ثم يُستخلص mRNA المطلوب المرتبط بالعمود .

بناء الحمض النووي التكميلي (cDNA)

بعد تنقية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، يرتبط بادئ أوليغو-dT (سلسلة قصيرة من نيوكليوتيدات ديوكسي ثيميدين) بذيل عديد الأدينين (poly-A) للحمض النووي الريبوزي. هذا البادئ ضروري لبدء عملية تخليق الحمض النووي (DNA) بواسطة إنزيم النسخ العكسي . ينتج عن ذلك تكوين هجائن RNA-DNA، حيث يرتبط شريط واحد من الحمض النووي التكميلي بشريط من الحمض النووي الريبوزي الرسول. [ 6 ] لإزالة الحمض النووي الريبوزي الرسول، يُستخدم إنزيم RNAse H لقطع هيكل الحمض النووي الريبوزي الرسول وتكوين مجموعات 3'-OH حرة، وهو أمر مهم لاستبدال الحمض النووي الريبوزي الرسول بالحمض النووي. [ 5 ] ثم يُضاف بوليميراز الحمض النووي I، حيث يعمل الحمض النووي الريبوزي المقطوع كبادئ يمكن لبوليميراز الحمض النووي I التعرف عليه وبدء استبدال نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبوزي بنيوكليوتيدات الحمض النووي. [ 5 ] يتم توفير ذلك بواسطة الحمض النووي أحادي السلسلة (sscDNA) نفسه عن طريق الالتفاف على نفسه عند الطرف 3'، مما يُشكل حلقة دبوسية . يقوم إنزيم البوليميراز بتمديد الطرف 3'-OH، ثم تُفتح الحلقة عند الطرف 3' بفعل إنزيم النيوكلياز S1 . بعد ذلك ، تُستخدم إنزيمات القطع المحددة وإنزيم ربط الحمض النووي لاستنساخ التسلسلات في بلازميدات بكتيرية .

ثم يتم اختيار البكتيريا المستنسخة، عادةً باستخدام المضادات الحيوية. بعد الاختيار، يتم إنشاء مخزون من البكتيريا يمكن زراعته لاحقًا وتسلسله لإنشاء مكتبة الحمض النووي التكميلي (cDNA).

تستخدم مكتبة cDNA

تُستخدم مكتبات الحمض النووي التكميلي (cDNA) بشكل شائع عند استنساخ الجينومات حقيقية النواة، حيث يتم تقليل كمية المعلومات بإزالة العدد الكبير من المناطق غير المشفرة من المكتبة. تُستخدم مكتبات cDNA للتعبير عن جينات حقيقية النواة في بدائيات النوى. لا تحتوي بدائيات النوى على إنترونات في حمضها النووي، وبالتالي لا تمتلك أي إنزيمات قادرة على قطعها أثناء عملية النسخ. لا يحتوي الحمض النووي التكميلي (cDNA) على إنترونات، ولذلك يمكن التعبير عنه في خلايا بدائيات النوى. تُعد مكتبات cDNA مفيدة للغاية في علم الوراثة العكسي ، حيث تكون المعلومات الجينومية الإضافية أقل فائدة. بالإضافة إلى ذلك، تُستخدم مكتبات cDNA بشكل متكرر في الاستنساخ الوظيفي لتحديد الجينات بناءً على وظيفة البروتين المُشفّر. عند دراسة الحمض النووي حقيقي النواة، يتم إنشاء مكتبات التعبير باستخدام الحمض النووي التكميلي (cDNA) للمساعدة في ضمان أن الجزء المُدخل هو جين حقيقي. [ 6 ]

مكتبة الحمض النووي التكميلي مقابل مكتبة الحمض النووي الجينومي

تفتقر مكتبة الحمض النووي التكميلي (cDNA) إلى العناصر غير المشفرة والتنظيمية الموجودة في الحمض النووي الجينومي. توفر مكتبات الحمض النووي الجينومي معلومات أكثر تفصيلاً عن الكائن الحي، ولكنها تتطلب موارد أكثر لإنتاجها وحفظها.

استنساخ الحمض النووي التكميلي

يمكن استنساخ جزيئات الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام روابط مواقع التقييد. هذه الروابط عبارة عن قطع قصيرة مزدوجة السلاسل من الحمض النووي ( أوليغوديوكسي ريبونوكليوتيد ) يتراوح طولها بين 8 و12 زوجًا من النيوكليوتيدات، وتحتوي على موقع قطع بواسطة إنزيم تقييد داخلي، مثل BamHI. لكل من الحمض النووي التكميلي والرابط نهايات غير لاصقة، والتي يمكن ربطها معًا باستخدام تركيز عالٍ من إنزيم T4 DNA ligase. بعد ذلك، تُنتج نهايات لاصقة في جزيء الحمض النووي التكميلي عن طريق قطع نهايات الحمض النووي التكميلي (التي تحتوي الآن على روابط مع موقع مُدمج) باستخدام الإنزيم الداخلي المناسب. ثم يُقطع ناقل الاستنساخ ( البلازميد ) أيضًا باستخدام الإنزيم الداخلي المناسب. بعد ربط " النهايات اللاصقة " للقطعة المُدخلة في الناقل، يُنقل جزيء الحمض النووي المُعاد تركيبه الناتج إلى خلية مضيفة من نوع الإشريكية القولونية (E. coli) للاستنساخ.

انظر أيضاً

مراجع

  1. ↑ يينغ، شاو-ياو (2003). توليد مكتبات الحمض النووي التكميلي: الطرق والبروتوكولات . طرق في البيولوجيا الجزيئية. توتوا، نيوجيرسي: دار هومانا للنشر. ISBN 978-1-58829-066-3.
  2. ↑ "نظرة عامة على مكتبة الحمض النووي التكميلي وتطبيقاتها - كرييتيف بيوجين" . www.creative-biogene.com . تم الاطلاع عليه بتاريخ 17-10-2024 .
  3. ↑ مكتبة الحمض النووي التكميلي (cDNA) || كيف تُبنى مكتبة الحمض النووي التكميلي؟ || ما هي استخدامات مكتبات الحمض النووي؟، ٢٧ أغسطس ٢٠١٩ ، تاريخ الاطلاع : ١٩ فبراير ٢٠٢٤
  4. ↑ تامانغ، سانجو (30 يونيو 2024). "مكتبة الحمض النووي (الجينومي، الحمض النووي التكميلي): الأنواع، التحضير، الاستخدامات" . microbenotes.com . تم الاطلاع عليه بتاريخ 17 أكتوبر 2024 .
  5. 1 2 3 يينغ، شاو ياو (2004). "مكتبات الحمض النووي التكميلي: نظرة عامة". التكنولوجيا الحيوية الجزيئية . 27 (3): 245-252 . doi : 10.1385/MB:27:3:245 . PMID 15247497 . 
  6. 1 2 P.، كلارك، ديفيد (2009). التكنولوجيا الحيوية : تطبيق الثورة الجينية . بازديرنيك، نانيت جان. أمستردام: أكاديميك برس/إلسيفير. ISBN  9780121755522. OCLC 226038060 . {{cite book}}: صيانة CS1: أسماء متعددة: قائمة المؤلفين ( رابط )