ثنائي ديوكسي نيوكليوتيد

📅 آخر تحديث: ٢٦ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٦ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 3 صور
الموسوعة الحرة
التركيب الجزيئي لـ 2'،3'-ديديوكسي أدينوزين ثلاثي الفوسفات (ddATP)

تُعدّ ثنائيات ديوكسي نيوكليوتيدات مثبطات لإطالة سلسلة بوليميراز الحمض النووي ، وتُستخدم في طريقة سانجر لتسلسل الحمض النووي . [ 1 ] تُعرف أيضًا باسم 2'،3' لأن كلا الموضعين 2' و3' على الريبوز يفتقران إلى مجموعات الهيدروكسيل ، ويُختصر اسمها إلى ddNTPs (ddGTP، ddATP، ddTTP، وddCTP). [ 2 ]

دورها في طريقة سانجر

تثبيط الهجوم النيوكليوفيلي بسبب غياب مجموعة 3'-OH

تُستخدم طريقة سانجر لتضخيم جزء مستهدف من الحمض النووي، مما يسمح بتحديد تسلسل الحمض النووي بدقة. يُستخدم إدخال ثنائي ديوكسي نيوكليوتيدات النيوكليوتيدات (ddNTPs) في صمامات التفاعل ببساطة لإنهاء تخليق سلسلة الحمض النووي النامية، مما ينتج عنه شظايا حمض نووي مُضاعفة جزئيًا. وذلك لأن بوليميراز الحمض النووي يحتاج إلى مجموعة الهيدروكسيل 3' للسلسلة النامية ومجموعة الفوسفات 5' للنيوكليوتيد الداخل لتكوين رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر . [ 2 ] في بعض الأحيان، يُدخل بوليميراز الحمض النووي ثنائي ديوكسي نيوكليوتيد، ويؤدي غياب مجموعة الهيدروكسيل 3' إلى إيقاف تفاعل التكثيف بين مجموعة الفوسفات 5' (بعد انقسام البيروفوسفات ) للنيوكليوتيد الداخل ومجموعة الهيدروكسيل 3' للنيوكليوتيد السابق على السلسلة النامية. يحدث تفاعل التكثيف هذا عادةً عند إدخال بوليميراز الحمض النووي لنيوكليوتيد غير مُعدل. ببساطة، يؤدي الهجوم النيوكليوفيلي لمجموعة الهيدروكسيل 3' إلى إضافة نيوكليوتيد إلى سلسلة متنامية. ويمنع غياب مجموعة الهيدروكسيل 3' حدوث هذا الهجوم النيوكليوفيلي، مما يعطل قدرة بوليميراز الحمض النووي على مواصلة وظيفته. [ 2 ]

أدى هذا الاكتشاف إلى تسميتها المناسبة "النيوكليوتيدات المُنهية للسلسلة". [ 2 ] لا تحتوي النيوكليوتيدات ثنائية الديوكسي ريبونوكليوتيدات على مجموعة هيدروكسيل في الطرف 3'، وبالتالي لا يمكن أن يحدث استطالة إضافية للسلسلة بمجرد وجود هذه النيوكليوتيدة ثنائية الديوكسي على السلسلة. وهذا بدوره يؤدي إلى إنهاء تسلسل الحمض النووي. وهكذا، تُشكل هذه الجزيئات أساس طريقة إنهاء سلسلة ثنائي الديوكسي لتسلسل الحمض النووي ، والتي نشرها فريدريك سانجر وفريقه عام 1977 [ 3 ] كامتداد لأعمال سابقة. [ 4 ] وُصفت طريقة سانجر عام 2001 بأنها إحدى الطريقتين الأساسيتين لتسلسل أجزاء الحمض النووي [ 1 ] (والأخرى هي طريقة ماكسام - جيلبرت [ 5 ] )، إلا أن طريقة سانجر هي "الأكثر استخدامًا والأكثر شيوعًا في معظم أجهزة تسلسل الحمض النووي الآلية". [ 1 ] فاز سانجر بجائزة نوبل الثانية في الكيمياء عام 1980، وتقاسمها مع والتر جيلبرت ("لمساهماتهما في تحديد تسلسل القواعد في الأحماض النووية") ومع بول بيرج ("لدراساته الأساسية في الكيمياء الحيوية للأحماض النووية، مع التركيز بشكل خاص على الحمض النووي المؤتلف ")، [ 6 ] وناقش استخدام ثنائي ديوكسي نيوكليوتيدات في محاضرته عند استلام جائزة نوبل. [ 7 ]

تسلسل الحمض النووي

تُستخدم ثنائيات ديوكسي نيوكليوتيدات في تسلسل الحمض النووي DNA بالتزامن مع الرحلان الكهربائي . عند إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR ) على عينة DNA في مزيج يحتوي على جميع ثنائيات ديوكسي نيوكليوتيدات الأربعة وثنائي ديوكسي نيوكليوتيد واحد، ينتج عن ذلك سلاسل بطول يساوي موضع كل قاعدة من النوع المُكمِّل للنوع الذي يحتوي على ثنائي ديوكسي نيوكليوتيد. وقد لوحظ في العديد من الأبحاث أن إنزيم بوليميراز taq المستخدم في تفاعل PCR يُفضِّل ثنائي ديوكسي جوانوزين ثلاثي الفوسفات (ddGTP). [ 8 ] أي أن لكل قاعدة نيوكليوتيدية من ذلك النوع احتمال ارتباطها بثنائي ديوكسي نيوكليوتيد وليس بثنائي ديوكسي نيوكليوتيد، مما يُنهي استطالة السلسلة. لذلك، إذا خضعت العينة للرحلان الكهربائي، فستظهر حزمة لكل طول يوجد فيه مُكمِّل ثنائي ديوكسي نيوكليوتيد. ومن الشائع الآن استخدام ثنائيات ديوكسي نيوكليوتيدات فلورية، بحيث يكون لكل واحد من الأربعة فلورة مختلفة يمكن الكشف عنها بواسطة جهاز التسلسل. وبالتالي، لا يلزم سوى تفاعل واحد.

إنتاج

في طريقة مُسجّلة ببراءة اختراع، استُخدم رباعي هيدروفوران في مذيب يحتوي على 50 غرامًا (0.205 مول) من اليوريدين (أو، على الأرجح، أي نيوكليوزيد غير محمي )، و112 مل (1.03 مول) من ميثيل أورثوفورمات ، و10 غرامات (52.6 ملي مول) من حمض بارا -تولوين سلفونيك عند درجة حرارة الغرفة مع التحريك. بعد التحريك عند درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة، صُبّ خليط التفاعل في محلول مائي من بيكربونات الصوديوم، ثم استُخلص بالكلوروفورم خمس مرات. جُفّف المستخلص فوق كبريتات الصوديوم، ورُكّز للحصول على 49.5 غرامًا (0.173 مول) من 2'،3'-o-ميثوكسي ميثيليدين يوريدين (بنسبة 84.5%). بعد هذا التفاعل، يُذاب ناتج اليوريدين، 2'،3'-o-ميثوكسي ميثيليدين يوريدين، في 50 مل من أنهيدريد الخل عند درجة حرارة الغرفة مع التحريك. يُسخن المحلول إلى 140  درجة مئوية ويُحفظ عند هذه الدرجة لمدة 5 ساعات تحت الارتداد. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، يُزال المذيب بالتقطير تحت ضغط منخفض، ثم يُضاف 50 مل من الماء، ويُستخلص المزيج 3 مرات باستخدام 100 مل من الكلوروفورم. يُركز المستخلص تحت ضغط منخفض باستخدام محلول الأمونيا بنسبة 30% للحصول على عائد 82.3% من 2'،3'-ثنائي ديوكسي-2'،3'-ثنائي هيدرو يوريدين. يُعاد ترطيب هذا المنتج لإزالة الرابطة المزدوجة عن طريق إذابته في 10 مل من الميثانول المحتوي على عامل مساعد (5% بلاديوم رطب على الكربون) (400 ملغ) في جو من الهيدروجين لمدة ساعة واحدة للحصول على ثنائي ديوكسي نيوكليوزيد الناتج (2'،3'-ثنائي ديوكسي يوريدين في هذه الحالة). [ 6 ] من المرجح أن يتم الحصول على نيوكليوتيد الصبغة المستخدم عن طريق المعالجة بإنزيم فسفرة، ثم إضافة البيوتين، وتفاعل المادة المُبيوتينية مع الصبغة. من المحتمل أيضًا حدوث تفاعل فوري مع الصبغة، ولكن يُزعم أن إطالة الذراع تزيد من الكفاءة في حالة استخدام شكل متحور من بوليميراز الحمض النووي. [ 5 ]

مراجع

  1. 1 2 3 ميس آر جيه، راغافاتشاري آر (2001). "تطبيقات الأشعة تحت الحمراء القريبة في تسلسل الحمض النووي وتحليله" . في راغافاتشاري آر (محرر). تطبيقات الأشعة تحت الحمراء القريبة في التكنولوجيا الحيوية . مطبعة سي آر سي . ص 133-150 . ISBN  9781420030242.
  2. 1 2 3 4 واتسون، جيه دي، بيكر، تي إيه، بيل، إس بي، غان، إيه، ليفين، إم، لوسيك، آر (2014). البيولوجيا الجزيئية للجين (الطبعة السابعة ). كولد سبرينغ هاربور، نيويورك: بيرسون. الصفحات 160-161 . ISBN   978-0-321-76243-6.
  3. ↑ سانجر، ف. ، نيكلين، س.، وكولسون، أ. ر. (ديسمبر 1977). "تسلسل الحمض النووي باستخدام مثبطات إنهاء السلسلة" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 74 (12): 5463-5467 . Bibcode : 1977PNAS...74.5463S . doi : 10.1073/pnas.74.12.5463 . PMC 431765. PMID 271968 .  
  4. ↑ سانجر ف ، كولسون أ.ر. (مايو 1975). "طريقة سريعة لتحديد التسلسلات في الحمض النووي عن طريق التخليق المُحفَّز باستخدام بوليميراز الحمض النووي". مجلة البيولوجيا الجزيئية . 94 (3): 441-448 . doi : 10.1016/0022-2836(75)90213-2 . PMID 1100841 . 
  5. 1 2 ماكسام إيه إم ، جيلبرت دبليو (فبراير 1977). "طريقة جديدة لتسلسل الحمض النووي" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 74 (2): 560-564 . Bibcode : 1977PNAS...74..560M . doi : 10.1073/ pnas.74.2.560 . PMC 392330. PMID 265521 .  
  6. ١ ٢ الأكاديمية الملكية السويدية للعلوم (١٤ أكتوبر ١٩٨٠). "جائزة نوبل في الكيمياء ١٩٨٠" . nobelprize.org (بيان صحفي). نوبل ميديا . مؤرشف من الأصل في ٣١ أكتوبر ٢٠١٨. تم الاطلاع عليه في ١٤ ديسمبر ٢٠١٩ .
  7. ↑ سانجر، ف. (8 ديسمبر 1980). "تحديد تسلسل النيوكليوتيدات في الحمض النووي (محاضرة نوبل)" (ملف PDF) . nobelprize.org . مؤسسة نوبل الإعلامية . مؤرشف (ملف PDF) من الأصل في 14 ديسمبر 2019. تم الاطلاع عليه في 14 ديسمبر 2019 .
  8. ↑ لي واي، ميتاكسوف في، واكسمان جي (أغسطس 1999). "تصميم بوليميرازات الحمض النووي Taq القائمة على البنية مع خصائص محسّنة لإدخال ثنائي ديوكسي نيوكليوتيد" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 96 (17): 9491-9496 . Bibcode : 1999PNAS...96.9491L . doi : 10.1073/pnas.96.17.9491 . PMC 22236. PMID 10449720 .  
  • شعار ويكيميديا ​​كومنزالوسائط المتعلقة بالديدوكسي نيوكليوتيدات على ويكيميديا ​​كومنز