المجهر التبايني التفاضلي

المجهر ذو التباين التداخلي التفاضلي ( DIC ) ، ويُسمى أيضًا مجهر نومارسكي ذو التباين التداخلي ( NIC ) أو مجهر نومارسكي ، هو تقنية مجهرية ضوئية تُستخدم لتحسين التباين في العينات الشفافة غير المصبوغة . يعتمد DIC على مبدأ التداخل الضوئي للحصول على معلومات حول طول المسار البصري للعينة، ما يسمح برؤية التفاصيل غير المرئية. ينتج نظام بصري معقد نسبيًا صورةً يظهر فيها الجسم باللون الأسود إلى الأبيض على خلفية رمادية. تشبه هذه الصورة تلك التي يتم الحصول عليها بواسطة مجهر التباين الطوري ، ولكن بدون هالة الحيود الساطعة. اخترع هذه التقنية فرانسيس هيوز سميث. ^{[ 1 ] [ 2 ]} تم إنتاج جهاز "Smith DIK" بواسطة شركة إرنست لايتز ويتزلار في ألمانيا، وكان تصنيعه صعبًا. ثم قام الفيزيائي البولندي جورج نومارسكي بتطوير تقنية DIC في عام 1952. ^{[ 3 ]}

تعمل تقنية التداخل التفاضلي التداخلي (DIC) عن طريق فصل مصدر ضوء مستقطب إلى جزأين متماسكين مستقطبين بشكل متعامد، يتم إزاحتهما مكانيًا (قصهما) عند مستوى العينة، ثم يُعاد تجميعهما قبل الملاحظة. يتأثر تداخل الجزأين عند إعادة التجميع بفرق المسار البصري بينهما (أي حاصل ضرب معامل الانكسار وطول المسار الهندسي). بإضافة طور إزاحة قابل للتعديل يحدد التداخل عند فرق مسار بصري صفري في العينة، يصبح التباين متناسبًا مع تدرج طول المسار على طول اتجاه القص، مما يُعطي مظهرًا ثلاثي الأبعاد يُحاكي تغير الكثافة الضوئية للعينة، مُبرزًا الخطوط والحواف، وإن لم يُوفر صورة دقيقة طوبوغرافيًا.

1. يدخل الضوء غير المستقطب إلى المجهر ويتم استقطابه بزاوية 45 درجة.

يتطلب نجاح هذه التقنية استخدام الضوء المستقطب.

2. يدخل الضوء المستقطب إلى منشور وولاستون المعدل بواسطة نومارسكي الأول ويتم فصله إلى شعاعين مستقطبين بزاوية 90 درجة بالنسبة لبعضهما البعض، وهما شعاع أخذ العينات وشعاع المرجع.

موشورات وولاستون هي نوع من الموشورات المصنوعة من طبقتين من مادة بلورية، مثل الكوارتز، والتي تعمل على فصل الضوء وفقًا لاستقطابه، وذلك بسبب اختلاف معامل انكسارها تبعًا لاستقطابه. أما موشور نومارسكي، فيجعل الشعاعين يتجمعان في نقطة بؤرية خارج جسم الموشور، مما يتيح مرونة أكبر عند ضبط المجهر، حيث يمكن ضبط تركيز الموشور بشكل فعال.

3. يقوم المكثف بتركيز الشعاعين لتمريرهما عبر العينة. ويتم تركيز هذين الشعاعين بحيث يمران عبر نقطتين متجاورتين في العينة، تفصل بينهما مسافة 0.2 ميكرومتر تقريبًا. 

تُضاء العينة بشكل فعال بواسطة مصدرين ضوئيين متماسكين ، أحدهما ذو استقطاب 0° والآخر ذو استقطاب 90°. ومع ذلك، فإن هذين المصدرين ليسا متوازيين تمامًا، حيث يقع أحدهما منحرفًا قليلاً عن الآخر.

4. تنتقل الأشعة عبر مناطق متجاورة من العينة، يفصل بينها القص. عادةً ما يكون هذا الفصل مماثلاً لدقة المجهر. وتختلف أطوال المسارات الضوئية التي تسلكها الأشعة عندما تختلف هذه المناطق في معامل الانكسار أو السماكة. يؤدي هذا إلى تغير في طور أحد الأشعة بالنسبة للآخر نتيجةً للتأخير الذي تتعرض له الموجة في المادة الأكثر كثافة ضوئية.

مرور العديد من أزواج الأشعة عبر أزواج من النقاط المتجاورة في العينة (وما يترتب على ذلك من امتصاص وانكسار وتشتت بواسطة العينة) يعني أن صورة العينة ستُحمل الآن بواسطة كل من الضوء المستقطب بزاوية 0° والضوء المستقطب بزاوية 90°. وإذا نُظر إلى كل منهما على حدة، فستكون صورتين ساطعتين للعينة ، مع إزاحة طفيفة بينهما. يحمل الضوء أيضًا معلومات عن الصورة غير المرئية للعين البشرية، وهي طور الضوء. وهذا أمر بالغ الأهمية لاحقًا. يمنع الاستقطاب المختلف التداخل بين هاتين الصورتين في هذه المرحلة.

5. تنتقل الأشعة عبر العدسة الشيئية ويتم تركيزها من أجل موشور وولاستون المعدل بواسطة نومارسكي الثاني.

6. يقوم الموشور الثاني بإعادة تجميع الشعاعين في شعاع واحد مستقطب بزاوية 135 درجة. ويؤدي تجميع الأشعة إلى تداخل ، مما يؤدي إلى زيادة سطوع الصورة أو تعتيمها عند تلك النقطة وفقًا لاختلاف المسار البصري.

يُركّب هذا الموشور صورتي المجال المضيء ويُحاذي استقطابهما ليتداخلا. مع ذلك، لا تتطابق الصورتان تمامًا بسبب اختلاف الإضاءة، ما يعني أنه بدلًا من حدوث تداخل بين شعاعين ضوئيين مرا عبر النقطة نفسها في العينة، يحدث تداخل بين أشعة ضوئية مرت عبر نقاط متجاورة ، وبالتالي يكون لها طور مختلف قليلًا. ولأن اختلاف الطور ناتج عن اختلاف طول المسار البصري، فإن إعادة تركيب الضوء هذه تُسبب " تفاضلًا بصريًا " لطول المسار البصري، مُولِّدةً الصورة المرئية.

تظهر الصورة كجسم ثلاثي الأبعاد تحت إضاءة مائلة للغاية، مما يُسبب إضاءة قوية وظلالاً داكنة على الأسطح المقابلة. ويُحدد اتجاه الإضاءة الظاهرية من خلال توجيه موشورات وولاستون.

كما هو موضح أعلاه، تُنتج الصورة من صورتين متطابقتين لحقل ساطع، يتم تراكبهما بإزاحة طفيفة (عادةً حوالي 0.2 ميكرومتر)، ويؤدي التداخل الناتج عن اختلاف الطور إلى تحويل التغيرات في الطور (وبالتالي طول المسار البصري) إلى تغير مرئي في درجة الظلام. قد يكون هذا التداخل بناءً أو هدامًا، مما يُنتج المظهر المميز ثلاثي الأبعاد.

يكون فرق الطور النموذجي الذي يُسبب التداخل صغيرًا جدًا، ونادرًا ما يتجاوز 90 درجة (ربع الطول الموجي). ويعود ذلك إلى تشابه معامل انكسار معظم العينات والوسط المحيط بها؛ فعلى سبيل المثال، لا يتجاوز فرق معامل انكسار الخلية في الماء 0.05. يُعدّ هذا الفرق الطفيف في الطور مهمًا لعمل تقنية التداخل التفاضلي التداخلي (DIC) بشكل صحيح، لأنه إذا كان فرق الطور عند نقطة التقاء مادتين كبيرًا جدًا، فقد يصل إلى 180 درجة (نصف الطول الموجي)، مما يؤدي إلى تداخل هدّام كامل وظهور منطقة مظلمة شاذة. أما إذا وصل فرق الطور إلى 360 درجة (طول موجي كامل)، فسيؤدي ذلك إلى تداخل بنّاء كامل، مما يُنتج منطقة مضيئة شاذة.

يمكن تقريب الصورة (مع إهمال الانكسار والامتصاص الناتج عن العينة وحدود دقة فصل الحزمة) على أنها تفاضل طول المسار البصري بالنسبة للموضع عبر العينة على طول القص، وبالتالي تفاضل معامل الانكسار (الكثافة البصرية) للعينة.

يمكن ضبط التباين باستخدام إزاحة الطور، إما بتحريك موشور نومارسكي الشيئي، أو باستخدام صفيحة موجية λ/4 بين المستقطب وموشور نومارسكي المكثف (تعويض دي سينارمونت). ويتراوح التباين الناتج من مجال مظلم عند إزاحة طور صفرية (شدة تتناسب مع مربع فرق القص)، إلى التباين النموذجي المرئي عند طور يتراوح بين 5 و90 درجة تقريبًا، إلى التلوين البصري عند 360 درجة، حيث يتغير الطول الموجي المنطفئ مع فرق الطور.

عند تجميع الصور المتتابعة، يمكن فصل إزاحة الطور الناتجة عن الجسم عن التشوهات غير المرغوب فيها غير التداخلية، مما يؤدي عادةً إلى تحسين التباين، خاصة في العينات المعتمة. ^{[ 4 ]}

تُستخدم تقنية التباين التفاضلي التداخلي (DIC) لتصوير العينات البيولوجية الحية وغير المصبوغة، مثل مسحة من مزرعة نسيجية أو كائنات وحيدة الخلية تعيش في الماء. وبفضل الإضاءة غير المتماسكة مكانيًا إلى أقصى حد، تقترب الدقة النظرية من أقصى تغطية نظرية تحددها كرة إيوالد . ^{[ 5 ]} وهذا يُعد تحسينًا على الطرق التي تتطلب درجة أعلى من التماسك، مثل تقنية تباين الطور .

يُستخدم تحليل التباين الرقمي (DIC) في أحد المجالات غير البيولوجية، وهو تحليل عمليات تصنيع أشباه الموصلات السيليكونية المستوية.  غالبًا ما تكون الأغشية الرقيقة (عادةً ما بين 100 و1000 نانومتر) المستخدمة في تصنيع السيليكون شفافةً للضوء المرئي (مثل ثاني أكسيد السيليكون، ونيتريد السيليكون، والسيليكون متعدد التبلور)، مما يجعل العيوب الموجودة فيها أو الشوائب المتراكمة عليها أكثر وضوحًا. وهذا يُتيح أيضًا تحديد ما إذا كانت السمة عبارة عن حفرة في مادة الركيزة أو كتلة من مادة غريبة على سطحها. وتكتسب السمات البلورية المحفورة مظهرًا لافتًا للنظر بشكل خاص عند استخدام تقنية DIC.

تتميز جودة الصورة، عند استخدامها في ظروف مناسبة، بدقة فائقة. مع ذلك، يجب أن يراعي تحليل صور DIC دائمًا اتجاه موشورات وولاستون واتجاه الإضاءة الظاهري، إذ لن تكون العناصر الموازية لهذا الاتجاه مرئية. لكن يمكن التغلب على هذه المشكلة بسهولة عن طريق تدوير العينة وملاحظة التغيرات في الصورة.

• المجهر التداخلي الكلاسيكي
• المجهر النانوي

• مورفي، د.، المجهر التبايني للتداخل التفاضلي (DIC) ومجهر تباين التعديل، في أساسيات المجهر الضوئي والتصوير الرقمي، وايلي-ليس، نيويورك، ص  153-168 (2001).
• Salmon, E. and Tran, P., High-solution video-enhanced differential intervention contrast (VE-DIC) light microscopy., Video Microscopy, Sluder, G. and Wolf, D. (eds), Academic Press, New York, pp.  153–184 (1998).
• تباين التداخل التفاضلي - المراجع

• مقدمة عن التباين التفاضلي التداخلي
• تباين التداخل التفاضلي ( مؤرشف بتاريخ 25 يوليو 2020 في أرشيف الإنترنت )
• مجهر التباين التفاضلي للضوء المنعكس
• دليل حول تقنية التباين التفاضلي التداخلي (DIC)