إليسبوت

اختبار البقعة المناعية المرتبطة بالإنزيم ( ELISpot ) هو نوع من الاختبارات التي تركز على القياس الكمي لمعدل إفراز السيتوكينات من خلية واحدة. يُعد اختبار ELISpot أيضًا شكلاً من أشكال التلوين المناعي، حيث يُصنف كتقنية تستخدم الأجسام المضادة للكشف عن بروتين معين ، ويشير مصطلح "البروتين" هنا إلى أي مادة بيولوجية أو كيميائية يتم تحديدها أو قياسها.

يُعد اختبار FluoroSpot أحد أنواع اختبار ELISpot. يستخدم اختبار FluoroSpot تقنية التألق لتحليل العديد من المواد، مما يعني أنه قادر على الكشف عن إفراز أكثر من نوع واحد من البروتينات.

وصف سيسيل تشيركينسكي تقنية ELISpot لأول مرة عام 1983 كطريقة جديدة لقياس إنتاج الغلوبولين المناعي النوعي للمستضد بواسطة خلايا الهيبريدوما . وفي عام 1988، طور تشيركينسكي اختبار ELISA لقياس إفراز الليمفوكين بواسطة الخلايا التائية . وفي العام نفسه، جُمعت تقنية ELISpot ثنائية اللون مع التصوير الحاسوبي لأول مرة، مما أتاح عدّ البقع وتحليلها. وشهد عام 1988 أيضًا الاستخدام الأول للصفائح ذات القاع الغشائي لإجراء هذه الاختبارات. ^{[ 1 ]}

1. تغليف الأجسام المضادة : في تقنية اختبار ELISpot، تُضاف مواد مختلفة إلى الآبار وتُغسل منها. توجد هذه الآبار على صفيحة مخبرية تحتوي على أطباق/أوعية صغيرة تُملأ بالمادة المراد فحصها؛ ويختلف عدد الآبار في الصفيحة، ولكنه يتراوح عادةً بين 16 و100 بئر. أول مادة تُضاف إلى الآبار هي أجسام مضادة وحيدة النسيلة خاصة بالسيتوكينات. تُغلف هذه الأجسام المضادة جدران الآبار لتسهيل ارتباطها بالسيتوكينات لاحقًا. الأجسام المضادة وحيدة النسيلة تعني أن الجسم المضاد مُنتَج من سلالة خلوية واحدة، ولا يستطيع الارتباط إلا بموقع محدد واحد على البروتين . أما الأجسام المضادة متعددة النسيلة ، فهي قادرة على الارتباط بمواقع محددة متعددة على نفس البروتين.
2. حضانة الخلايا : تُضاف الخلايا المراد فحصها وتحليلها إلى الآبار. يمكن أن تحتوي كل بئر على محفزات تُنشط إفراز السيتوكينات في الخلايا، أو قد لا تحتوي عليها. خلال حضانة الخلايا، تُترك الخلايا لتتفاعل مع أي محفزات موجودة وتُفرز السيتوكينات. هناك العديد من الإجراءات والأساليب التي يجب اتباعها لضمان التعامل السليم مع الخلايا. لضمان جودة الخلايا، يجب تحريك خلايا عينات الدم برفق إذا تم تخزينها لأكثر من 3 ساعات، ويجب تخفيف عينات الدم في محلول ملحي مُخفف بالفوسفات (PBS ) قبل تخزينها، ويجب ألا تحتوي عينات الدم على خلايا الدم البيضاء المحببة . يجب ترك أي خلايا تم تجميدها ثم إذابتها لمدة ساعة أو أكثر عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة الجسم الطبيعية). ^{[ 2 ]} هناك أيضًا العديد من الأمور التي يجب مراعاتها عند حضانة الخلايا، مثل التأكد من عدم تعرض الخلايا لحركات مفاجئة قد تؤثر على تكوين البقع، أو أن تكون رطوبة الحاضنة عالية بما يكفي لتجنب التبخر المفرط وجفاف الآبار. ^{[ 3 ]}
3. التقاط السيتوكين : بما أن الخلايا محاطة بأجسام مضادة أحادية النسيلة خاصة بالسيتوكين تغطي جدران الآبار، فإن السيتوكين الذي تم إفرازه بواسطة الخلايا المحضونة سيبدأ في الارتباط بالأجسام المضادة عند موقع محدد.
4. الأجسام المضادة للكشف : في هذه المرحلة، يجب شطف الآبار للتخلص من الخلايا وأي مواد أخرى غير مرغوب فيها. يجب ألا يتبقى سوى الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة بالسيتوكينات وأي سيتوكينات ارتبطت بها. ثم تُضاف أجسام مضادة للكشف خاصة بالسيتوكينات مُؤشَّرة بالبيوتين إلى البئر. سترتبط هذه الأجسام المضادة بأي سيتوكين متبقٍ في البئر، لأن السيتوكين لا يزال مرتبطًا بالمجموعة الأولى من الأجسام المضادة المستخدمة. ولأن السيتوكين كان مرتبطًا بالمجموعة الأولى من الأجسام المضادة التي تُغطي الآبار، فإنه لم يُغسل عند شطفها.
5. مُقترن الستربتافيدين بالإنزيم : يُضاف مُقترن الستربتافيدين بالإنزيم إلى الآبار ليرتبط بالأجسام المضادة الكاشفة. والهدف من إضافة البيوتين إلى الأجسام المضادة الكاشفة الخاصة بالسيتوكينات، والتي أُضيفت إلى الآبار في الخطوة السابقة، هو تمكينها من الارتباط بمُقترن الستربتافيدين بالإنزيم الجديد. تُنشئ إضافة البيوتين أساسًا ألفةً قويةً بين البيوتين الموجود على الجسم المضاد الخاص بالسيتوكينات والستربتافيدين الموجود على المُقترن. ^{[ 4 ]}
6. إضافة الركيزة : تُضاف الركيزة إلى الآبار، ويُحفز التفاعل بواسطة الإنزيم المُضاف في الخطوة السابقة. يُنتج هذا التفاعل راسبًا غير قابل للذوبان يُشكل بقعًا في الآبار. تعتمد الركيزة المستخدمة في هذه الخطوة على نوع الإنزيم المستخدم في الخطوة السابقة. فإذا استُخدم ستربتأفيدين-ALP (ستربتأفيدين مع إنزيم الفوسفاتاز القلوي )، فإن استخدام BCIP/NBT-plus (مزيج من 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل فوسفات وكلوريد نيتروبلو تترازوليوم) ^{[ 5 ]} كركيزة سيُنتج بقعًا أكثر وضوحًا وأسهل في التحليل. أما إذا استُخدم ستربتأفيدين-HRP (ستربتأفيدين مع إنزيم بيروكسيداز الفجل)، فإن استخدام TMB (رباعي ميثيل بنزيدين) ^{[ 6 ]} كركيزة سيُعطي نتائج أفضل. ^{[ 7 ]}
7. التحليل : يمكن بعد ذلك قراءة البقع التي تتشكل على قارئ ELISpot آلي، أو عدها تحت مجهر تشريحي، واستخدامها بشكل أكبر لحساب تردد إفراز السيتوكين.

يمكن استخدام اختبارات ELISpot وFluoroSpot في العديد من المجالات البحثية: تطوير اللقاحات، ^{[ 10 ]} والسرطان، ^{[ 11 ]} والحساسية، ^{[ 12 ]} وتوصيف الخلايا الوحيدة/البلعمية/المتغصنة، وتحليل البروتينات الدهنية، والبحوث البيطرية ^{[المراجع 10 و11 و12 بحاجة إلى تحديث]} . باستخدام اختبار ELISpot، يمكنك دراسة استجابات السيتوكينات النوعية للمستضد، والخلايا المفرزة للأجسام المضادة النوعية، ^{[ 13 ]} ومستضدات الأورام، ^{[ 11 ]} وإطلاق غرانزيم B وبيرفورين بواسطة الخلايا التائية، وفعالية اللقاح، ^{[ 14 ]} وتحديد مواقع المستضدات، ^{[ 15 ]} ونشاط الخلايا التائية السامة، والكشف عن IL-4 وIL-5 وIL-13، ^{[ 12 ]} واستجابات الأجسام المضادة الناتجة عن اللقاح، وخلايا الذاكرة البائية النوعية للمستضد، ^{[ 10 ]} وغير ذلك الكثير.

وبشكلٍ أدق، يُستخدم اختبار ELISpot للخلايا التائية لتوصيف مجموعات الخلايا التائية الفرعية. وذلك لقدرة هذا الاختبار على الكشف عن إنتاج السيتوكينات IFN-γ، وIL-2، وTNF-α، وIL-4، وIL-5، وIL-13. تُنتَج السيتوكينات الثلاثة الأولى بواسطة خلايا Th1، بينما تُنتَج السيتوكينات الثلاثة الأخيرة بواسطة خلايا Th2. كما يُتيح قياس استجابات الخلايا التائية من خلال إنتاج السيتوكينات دراسة فعالية اللقاح. ^{[ 16 ]}

باستخدام تقنية T-cell FluoroSpot، يمكنك مراقبة الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم. كما يمكنك تحليل إفراز السيتوكين IFN-γ والجرانزيم B لتقييم استجابات الخلايا التائية السامة. تُستخدم كلتا التقنيتين في أبحاث السرطان. ^{[ 17 ]}

باستخدام تقنية فلوروسبوت للخلايا البائية، يمكن أيضًا رصد فعالية اللقاح من خلال قياس إفراز الغلوبولين المناعي IgG وIgA وIgM قبل التطعيم وبعده. ويُمكن إجراء هذا التحليل للغلوبولينات المناعية المتعددة بفضل طريقة التألق المستخدمة في فلوروسبوت. ^{[ 17 ]}