التلوين المناعي

يُعدّ التلوين المناعي النسيجي (IHC) لشرائح الأنسجة (أو التلوين المناعي الخلوي ، وهو تلوين الخلايا ) من أكثر تقنيات التلوين المناعي شيوعًا. ^{[ 2 ]} في حين استُخدمت الأصباغ الفلورية في البداية (انظر: التألق المناعي )، تُستخدم الآن طرق أخرى غير فلورية تعتمد على إنزيمات مثل البيروكسيداز (انظر: التلوين المناعي بالبيروكسيداز ) والفوسفاتاز القلوي . هذه الإنزيمات قادرة على تحفيز تفاعلات تُنتج مادة ملونة يسهل الكشف عنها بالمجهر الضوئي . كما يمكن استخدام العناصر المشعة كعلامات، ويمكن تصوير التفاعل المناعي بالتصوير الإشعاعي الذاتي . ^{[ 3 ]}

يُعدّ تحضير الأنسجة أو تثبيتها ضروريًا للحفاظ على شكل الخلايا وبنية الأنسجة. قد يؤدي التثبيت غير المناسب أو المطوّل إلى تقليل قدرة الأجسام المضادة على الارتباط بشكل ملحوظ. يمكن إظهار العديد من المستضدات بنجاح في مقاطع الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين . مع ذلك، لا تصمد بعض المستضدات حتى مع كميات معتدلة من التثبيت بالألدهيد. في هذه الحالة، يجب تجميد الأنسجة تجميدًا سريعًا في النيتروجين السائل وتقطيعها باستخدام جهاز التقطيع المبرد (كريوستات). تشمل عيوب المقاطع المجمدة ضعف الشكل، وضعف الدقة عند التكبيرات العالية، وصعوبة التقطيع فوق مقاطع البارافين، والحاجة إلى التخزين المجمد. في المقابل، لا تتطلب مقاطع الفايبراتوم معالجة الأنسجة بالمذيبات العضوية أو الحرارة العالية، مما قد يُفقدها خصائصها المستضدية، أو يُتلفها بالتجميد والذوبان المتكرر. من عيوب مقاطع الفايبراتوم أن عملية التقطيع بطيئة وصعبة مع الأنسجة الرخوة وغير المثبتة جيدًا، وأن علامات الاهتزاز أو خطوط الفايبراتوم غالبًا ما تكون واضحة في المقاطع.

يمكن تحسين الكشف عن العديد من المستضدات بشكل كبير باستخدام طرق استرجاع المستضدات التي تعمل على كسر بعض الروابط المتشابكة للبروتين المتكونة أثناء التثبيت، وذلك للكشف عن المواقع المستضدية المخفية. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق التسخين لفترات زمنية متفاوتة (استرجاع المستضدات بالحرارة أو HIER) أو باستخدام الهضم الإنزيمي (استرجاع المستضدات بالتحلل البروتيني أو PIER). ^{[ 4 ]}

تُعدّ معالجة الخلفية، سواءً كانت نوعية أو غير نوعية، من أبرز التحديات في التلوين المناعي النسيجي. وللحصول على تلوين مناعي عالي الجودة، من المهم تحسين طرق التثبيت وأوقاته، والمعالجة المسبقة بعوامل الحجب، وحضانة الأجسام المضادة في محاليل ملحية عالية التركيز، وتحسين محاليل الغسل وأوقات الغسل بعد استخدام الأجسام المضادة. إضافةً إلى ذلك، يُعدّ وجود كلٍّ من الضوابط الإيجابية والسلبية للتلوين ضروريًا لتحديد النوعية.

يمكن استخدام جهاز قياس التدفق الخلوي للتحليل المباشر للخلايا التي تُعبّر عن بروتين واحد أو أكثر من البروتينات المحددة. تُصبغ الخلايا مناعياً في محلول باستخدام طرق مشابهة لتلك المستخدمة في التألق المناعي، ثم تُحلل بواسطة قياس التدفق الخلوي.

يتميز قياس التدفق الخلوي بعدة مزايا مقارنةً بالتلوين المناعي النسيجي، منها: القدرة على تحديد مجموعات الخلايا المتميزة بناءً على حجمها وحبيباتها؛ والقدرة على استبعاد الخلايا الميتة؛ وحساسية محسّنة؛ وتحليل متعدد الألوان لقياس عدة مستضدات في آنٍ واحد. مع ذلك، قد يكون قياس التدفق الخلوي أقل فعالية في الكشف عن مجموعات الخلايا النادرة للغاية، كما يُفقد بعض العلاقات البنيوية في حال عدم وجود مقطع نسيجي. ^{[ 5 ]} كما أن قياس التدفق الخلوي يتطلب تكلفة رأسمالية عالية لشراء جهاز قياس التدفق الخلوي.

تتيح تقنية التلطيخ الغربي الكشف عن بروتينات محددة من مستخلصات الخلايا أو الأنسجة، قبل أو بعد أي خطوات تنقية . تُفصل البروتينات عادةً حسب حجمها باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي قبل نقلها إلى غشاء اصطناعي عبر طرق التلطيخ الجاف أو شبه الجاف أو الرطب. بعد ذلك، يمكن فحص الغشاء باستخدام الأجسام المضادة بطرق مشابهة للكيمياء المناعية النسيجية، ولكن دون الحاجة إلى تثبيت. ويتم الكشف عادةً باستخدام أجسام مضادة مرتبطة بالبيروكسيداز لتحفيز تفاعل التلألؤ الكيميائي .

يُعدّ التحليل المناعي الغربي طريقةً روتينيةً في علم الأحياء الجزيئي، ويمكن استخدامه لمقارنة مستويات البروتين بين المستخلصات بشكلٍ شبه كمي. يسمح فصل البروتينات حسب الحجم قبل عملية النقل بقياس وزنها الجزيئي مقارنةً بعلامات الوزن الجزيئي المعروفة.

يُعدّ اختبار المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) طريقة تشخيصية لتحديد تركيزات البروتينات كميًا أو شبه كميًا في بلازما الدم أو المصل أو مستخلصات الخلايا/الأنسجة، وذلك باستخدام لوحة متعددة الآبار (عادةً 96 بئرًا لكل لوحة). بشكل عام، تُمتص البروتينات الموجودة في المحلول على لوحات ELISA. وتُستخدم أجسام مضادة نوعية للبروتين المراد فحصه لتحليل اللوحة. يتم تقليل التشويش الخلفي عن طريق تحسين طرق الحجب والغسل (كما هو الحال في التلوين المناعي النسيجي)، ويتم ضمان النوعية من خلال وجود ضوابط موجبة وسالبة. تعتمد طرق الكشف عادةً على قياس الألوان أو التلألؤ الكيميائي.

يمكن استخدام المجهر الإلكتروني لدراسة البنية المجهرية الدقيقة للأنسجة أو الخلايا. يسمح المجهر الإلكتروني المناعي بالكشف عن بروتينات محددة في مقاطع نسيجية رقيقة للغاية. ويمكن تصوير الأجسام المضادة الموسومة بجزيئات المعادن الثقيلة (مثل الذهب) مباشرةً باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ . ورغم فعاليته في الكشف عن التموضع الخلوي الفرعي للبروتين، إلا أن المجهر الإلكتروني المناعي قد يكون صعبًا من الناحية التقنية، ومكلفًا، ويتطلب تحسينًا دقيقًا لطرق تثبيت الأنسجة ومعالجتها. وقد اقتُرح استخدام البيوتين في البروتينات داخل الجسم الحي للتخفيف من المشاكل الناجمة عن عدم توافق تلوين الأجسام المضادة في كثير من الأحيان مع بروتوكولات التثبيت التي تحافظ بشكل أفضل على مورفولوجيا الخلية. ^{[ 6 ]}