تنقية البروتين

إذا لم يُفرز الكائن الحي البروتين المطلوب في المحلول المحيط، فإن الخطوة الأولى في أي عملية تنقية هي تكسير الخلايا الحاوية على البروتين. وبناءً على مدى هشاشة البروتين واستقرار الخلايا، يمكن، على سبيل المثال، استخدام إحدى الطرق التالية: 1) التجميد والإذابة المتكررين، 2) المعالجة بالموجات فوق الصوتية ، 3) التجنيس بالضغط العالي ( باستخدام مكبس فرنسي )، 4) التجنيس بالطحن (باستخدام مطحنة الخرز)، 5) زيادة نفاذية الغشاء الخلوي باستخدام المنظفات (مثل تريتون X-100 ) و/أو الإنزيمات (مثل الليزوزيم ). ^{[ 4 ]} أخيرًا، يمكن إزالة حطام الخلايا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي، وهي عملية يتم فيها طرد المتجانس بسرعة منخفضة، ثم مرة أخرى بقوة أكبر للحصول على راسب يتكون من النوى والسائل الطافي. ينتج عن ذلك عدة أجزاء ذات كثافة متناقصة، حيث تُطبق تقنيات تنقية أكثر دقة على أحد هذه الأجزاء. ^{[ 1 ]}

كذلك، تُفرز البروتيازات أثناء تحلل الخلايا ، والتي تبدأ بهضم البروتينات في المحلول. إذا كان البروتين المراد تحليله حساسًا للتحلل البروتيني ، يُنصح بالإسراع في العملية، مع الحفاظ على برودة المستخلص، لإبطاء عملية الهضم. بدلاً من ذلك، يمكن إضافة مثبط واحد أو أكثر من مثبطات البروتياز إلى محلول التحلل مباشرةً قبل تكسير الخلايا. في بعض الأحيان، يكون من الضروري أيضًا إضافة إنزيم ديوكسي ريبونيوكلياز (DNAse) لتقليل لزوجة مستخلص الخلية الناتجة عن ارتفاع محتوى الحمض النووي (DNA) .

الطرد المركزي عملية تستخدم قوة الطرد المركزي لفصل مخاليط من الجسيمات ذات الكتل أو الكثافات المختلفة المعلقة في سائل. عند تدوير وعاء (عادةً أنبوب أو زجاجة) يحتوي على خليط من البروتينات أو مواد جسيمية أخرى، مثل الخلايا البكتيرية، بسرعات عالية، فإن قصور كل جسيم ينتج قوة في اتجاه سرعة الجسيم تتناسب مع كتلته. ويُعادل ميل الجسيم للتحرك عبر السائل بسبب هذه القوة المقاومة التي يمارسها السائل عليه. والنتيجة النهائية لتدوير العينة في جهاز الطرد المركزي هي أن الجسيمات الضخمة والصغيرة والكثيفة تتحرك للخارج أسرع من الجسيمات الأقل كتلة أو الجسيمات ذات المقاومة الأكبر في السائل. عند تدوير معلقات الجسيمات في جهاز الطرد المركزي، قد تتشكل رواسب في قاع الوعاء غنية بالجسيمات الأضخم ذات المقاومة الأقل في السائل.

تبقى الجسيمات غير المتراصة في الغالب في السائل المسمى "الراشح"، ويمكن إزالته من الوعاء لفصل الراشح عن الراسب. يتحدد معدل الطرد المركزي بالتسارع الزاوي المطبق على العينة، والذي يُقاس عادةً مقارنةً بقوة الجاذبية الأرضية . إذا طُردت العينات مركزياً لفترة كافية، ستصل الجسيمات في الوعاء إلى حالة اتزان، حيث تتراكم الجسيمات تحديداً عند نقطة في الوعاء تتوازن فيها كثافتها الطافية مع قوة الطرد المركزي. يتيح هذا النوع من الطرد المركزي "المتوازن" تنقيةً شاملةً لجسيم معين.

تُجرى عملية الطرد المركزي باستخدام تدرج السكروز - وهو تدرج تركيز خطي للسكر (عادةً السكروز أو الجلسرين أو وسط تدرج الكثافة القائم على السيليكا، مثل بيركول ) - في أنبوب بحيث يكون أعلى تركيز في الأسفل وأدنى تركيز في الأعلى. ثم تُوضع عينة البروتين فوق التدرج وتُدار بسرعات عالية في جهاز طرد مركزي فائق السرعة. يؤدي هذا إلى هجرة الجزيئات الكبيرة الثقيلة نحو قاع الأنبوب أسرع من المواد الأخف. أثناء الطرد المركزي في غياب السكروز، ومع ابتعاد الجزيئات عن مركز الدوران، تتعرض لقوة طرد مركزي متزايدة (كلما زادت المسافة التي تقطعها، زادت سرعتها). تكمن المشكلة في أن نطاق الفصل المفيد داخل الوعاء يقتصر على نافذة صغيرة قابلة للملاحظة. إن تدوير العينة لمدة ضعف المدة لا يعني أن الجزيء المراد دراسته سيقطع ضعف المسافة؛ بل في الواقع، سيقطع مسافة أطول بكثير. مع ذلك، عندما تتحرك البروتينات عبر تدرج السكروز، فإنها تواجه سائلاً تزداد كثافته ولزوجته. يعمل تدرج السكروز المصمم بشكل صحيح على موازنة قوة الطرد المركزي المتزايدة، بحيث تتحرك الجزيئات بما يتناسب تقريبًا مع الوقت الذي قضته في مجال الطرد المركزي. تُعرف العينات المفصولة بهذه التدرجات باسم عمليات الطرد المركزي "المناطقية". بعد فصل البروتين/الجزيئات، يُجزأ التدرج ويُجمع. في الكيمياء الحيوية، يُعد الطرد المركزي الفائق ذا قيمة كبيرة لفصل الجزيئات الحيوية وتحليل خصائصها الفيزيائية. ^{[ 1 ]}

تتطلب معظم البروتينات بعض الأملاح لتذوب في الماء، وهي عملية تُعرف باسم التمليح . ومع زيادة تركيز الملح، قد تترسب البروتينات، وهي عملية تُعرف باسم التمليح العكسي، وتتضمن تغييرًا في ذوبانية البروتين. _[ 1] على سبيل المثال، في تنقية البروتينات بكميات كبيرة، تتمثل الخطوة الأولى الشائعة لعزل البروتينات في الترسيب باستخدام كبريتات الأمونيوم (NH₄)₂SO₄ ^{. [ 7} ] يتم ذلك بإضافة كميات _{متزايدة} من _{كبريتات} الأمونيوم ^{وجمع أجزاء البروتين} المترسبة المختلفة. بعد ذلك، يمكن إزالة كبريتات الأمونيوم باستخدام الديال (فصل البروتينات عن الجزيئات الصغيرة من خلال غشاء شبه منفذ). ^{[ 1 ]} خلال خطوة الترسيب بكبريتات الأمونيوم، تتعرض المجموعات الكارهة للماء الموجودة على البروتينات للهواء، مما يجذب مجموعات كارهة للماء أخرى؛ والنتيجة هي تكوين تجمع من المكونات الكارهة للماء. في هذه الحالة، يكون راسب البروتين مرئيًا بالعين المجردة عادةً . إحدى مزايا هذه الطريقة هي أنها يمكن تنفيذها بتكلفة منخفضة، حتى مع الأحجام الكبيرة جدًا.

تُعدّ البروتينات الذائبة في الماء أولى البروتينات التي تُنقّى. تتطلب تنقية البروتينات الغشائية المتكاملة تفتيت غشاء الخلية لعزل أي بروتين مُحدد عن غيره من البروتينات الموجودة في نفس حيز الغشاء. في بعض الأحيان، يُمكن عزل جزء غشائي مُعين أولًا، مثل عزل الميتوكوندريا من الخلايا قبل تنقية بروتين موجود في غشاء الميتوكوندريا. يُمكن استخدام مُنظف مثل دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) لإذابة أغشية الخلايا والحفاظ على البروتينات الغشائية في المحلول أثناء التنقية؛ ومع ذلك، نظرًا لأن SDS يُسبب تمسخ البروتين ، يُمكن استخدام مُنظفات ألطف مثل تريتون X-100 أو CHAPS للحفاظ على البنية الأصلية للبروتين أثناء التنقية الكاملة.

يمكن استخدام تقنية الاستشراب لفصل البروتينات في المحاليل أو في ظروف التمسخ باستخدام الهلامات المسامية. تُعد هذه التقنية فصلًا أكثر دقة، وتُعرف باسم استشراب الاستبعاد الحجمي . ويكمن مبدأها في أن الجزيئات الأصغر حجمًا يجب أن تقطع مسافة أكبر داخل المصفوفة المسامية. وبالتالي، تتطلب البروتينات ذات نطاق حجمي معين حجمًا متغيرًا من المذيب قبل أن تُجمع في الطرف الآخر من عمود الهلام. أما الجزيئات (أو البروتينات) الأكبر حجمًا فتقطع مسافة أقل وتُفصل قبل الجزيئات الأصغر.

في سياق تنقية البروتينات، يُجمع المذيب عادةً في أنابيب اختبار مختلفة. تُستبعد جميع الأنابيب التي لا تحتوي على أي أثر قابل للقياس من البروتين المراد تنقيته. وبذلك، يتكون المحلول المتبقي من البروتين المراد تنقيته وأي بروتينات أخرى ذات حجم مماثل.

لا تكفي عادةً تقنية كروماتوغرافية واحدة تعتمد على الخصائص الجزيئية للحصول على بروتين عالي النقاء. ^{[ 1 ]} بالإضافة إلى الحجم، تفصل كروماتوغرافيا التبادل الأيوني المركبات وفقًا لطبيعة ودرجة شحنتها الأيونية. ويتم اختيار العمود المستخدم بناءً على نوعه وقوة شحنته. تتميز راتنجات التبادل الأنيوني بشحنة موجبة وتُستخدم لاحتجاز وفصل المركبات سالبة الشحنة (الأنيونات)، بينما تتميز راتنجات التبادل الكاتيوني بشحنة سالبة وتُستخدم لفصل الجزيئات موجبة الشحنة (الكاتيونات).

قبل بدء عملية الفصل، يُضخ محلول منظم عبر العمود لمعادلة الأيونات ذات الشحنات المتعاكسة. عند حقن العينة، تتبادل جزيئات المذاب أيونات المحلول المنظم، حيث يتنافس كل منهما على مواقع الارتباط على الراتنج. يعتمد طول فترة احتجاز كل مذاب على قوة شحنته. تخرج المركبات الأقل شحنة أولاً، تليها المركبات ذات الشحنات الأقوى تدريجياً. نظراً لطبيعة آلية الفصل، يلعب كل من الرقم الهيدروجيني ونوع المحلول المنظم وتركيزه ودرجة الحرارة أدواراً مهمة في التحكم بعملية الفصل.

تُعدّ كروماتوغرافيا التبادل الأيوني أداةً بالغة الفعالية في تنقية البروتينات، وتُستخدم بكثرة في عمليات الفصل التحليلية والتحضيرية. وهي مفيدةٌ بشكلٍ خاص عند تنقية البروتينات الرابطة للأحماض النووية، حيث يتطلب الأمر فصل البروتين عن الحمض النووي المرتبط به للحصول على عينة نقية خالية من الأحماض النووية التي تم تنقيتها معه من نظام التعبير أو المصدر الأصلي.

الرحلان الكهربائي الحر (FFE) هو تقنية رحلان كهربائي لا تستخدم حاملًا، وتتيح فصل البروتينات تحضيريًا في تيار محلول منظم صفائحي باستخدام مجال كهربائي متعامد. وباستخدام تدرج الأس الهيدروجيني، الذي يمكن توليده على سبيل المثال بواسطة الأمفوليتات ، تسمح هذه التقنية بفصل نظائر البروتين بدقة تصل إلى أقل من 0.02 دلتا-pI.

تتميز وسائط كروماتوغرافيا التفاعل الكاره للماء (HIC) بخاصية البرمائية، حيث تحتوي على مناطق كارهة للماء وأخرى محبة للماء، مما يسمح بفصل البروتينات بناءً على كراهية سطحها للماء. تميل البروتينات المستهدفة وتجمعاتها الناتجة إلى امتلاك خصائص كارهة للماء مختلفة، وإزالتها عبر HIC تزيد من تنقية البروتين المطلوب. ^{[ 8 ]} بالإضافة إلى ذلك، تستخدم البيئة المستخدمة عادةً ظروفًا أقل قسوة في عملية التمسخ مقارنةً بتقنيات الكروماتوغرافيا الأخرى، مما يساعد على الحفاظ على البروتين المطلوب في حالته الأصلية والوظيفية. في الماء النقي، تكون التفاعلات بين الراتنج والمناطق الكارهة للماء في البروتين ضعيفة للغاية، ولكن يتم تعزيز هذا التفاعل بتطبيق عينة البروتين على راتنج HIC في محلول منظم ذي قوة أيونية عالية. ثم يتم تقليل القوة الأيونية للمحلول المنظم لفصل البروتينات بترتيب تنازلي حسب كراهيتها للماء. ^{[ 9 ]}

تُعدّ كروماتوغرافيا التقارب تقنية فصل فعّالة أخرى تتميز بانتقائية عالية للبروتين المطلوب بناءً على بنيته الجزيئية، وتستخدم عادةً راتنجات مُخصصة لهذا الغرض. تحتوي هذه الراتنجات على روابط كيميائية مُرتبطة بسطحها، وهي روابط مُخصصة للمركبات المراد فصلها. في أغلب الأحيان، تعمل هذه الروابط بطريقة مشابهة لتفاعلات الأجسام المضادة مع المستضدات. هذا التوافق الدقيق بين الرابط والمركب المستهدف يُضفي على العملية انتقائية عالية، وغالبًا ما يُنتج قمة واحدة، بينما تبقى جميع المركبات الأخرى في العينة دون فصل.

العديد من البروتينات الغشائية هي بروتينات سكرية ، ويمكن تنقيتها باستخدام كروماتوغرافيا الألفة للليكتين . تُترك البروتينات المذابة بالمنظفات لترتبط براتنج كروماتوغرافي مُعدّل ليحتوي على ليكتين مرتبط تساهميًا. تُغسل البروتينات غير المرتبطة بالليكتين، ثم تُفصل البروتينات السكرية المرتبطة تحديدًا بإضافة تركيز عالٍ من سكر يُنافس البروتينات السكرية المرتبطة في موقع ارتباط الليكتين. تتميز بعض الليكتينات بألفة ارتباط عالية مع قليل السكريات في البروتينات السكرية، يصعب على السكريات منافستها، ولذا يلزم تحرير البروتينات السكرية المرتبطة عن طريق تغيير طبيعة الليكتين.

تستخدم كروماتوغرافيا التقارب المناعي الارتباط النوعي بين جسم مضاد ومستضد لتنقية البروتين المستهدف بشكل انتقائي. تتضمن هذه العملية تثبيت بروتين على ركيزة صلبة (مثل حبة مسامية أو غشاء)، حيث يرتبط هذا البروتين بالبروتين المستهدف بشكل انتقائي، بينما تمر جميع الجزيئات الأخرى عبر الركيزة. يمكن فصل البروتين المستهدف عن طريق تغيير درجة الحموضة أو الملوحة . قد يكون الليجاند المُثبَّت جسمًا مضادًا (مثل الغلوبولين المناعي G ) أو بروتينًا (مثل البروتين A ). ولأن هذه الطريقة لا تتطلب إضافة علامة، يمكن استخدامها مع البروتينات من مصادر طبيعية. ^{[ 10 ]}

الاستشراب السائل عالي الأداء، أو الاستشراب السائل عالي الضغط، هو نوع من الاستشراب يُطبَّق فيه ضغط عالٍ لدفع المواد المذابة عبر العمود بسرعة أكبر. هذا يعني أن الانتشار محدود، وبالتالي تحسَّن الفصل. الشكل الأكثر شيوعًا هو الاستشراب السائل عالي الأداء ذو ​​الطور المعكوس، حيث تكون مادة العمود كارهة للماء . تُفصل البروتينات بتدرج من كميات متزايدة من مذيب عضوي ، مثل الأسيتونيتريل. وتُفصل البروتينات وفقًا لدرجة كراهيتها للماء. بعد التنقية بواسطة الاستشراب السائل عالي الأداء، يكون البروتين في محلول يحتوي فقط على مركبات متطايرة ، ويمكن تجفيفه بالتجميد بسهولة. ^{[ 11 ]} غالبًا ما تؤدي تنقية الاستشراب السائل عالي الأداء إلى تمسخ البروتينات المنقاة، وبالتالي فهي غير مناسبة للبروتينات التي لا تعيد طي نفسها تلقائيًا.

هناك طريقة أخرى لوسم البروتينات، وهي هندسة وسم ببتيدي مستضدي على البروتين، ثم تنقية البروتين باستخدام عمود كروماتوغرافي أو عن طريق حضنه مع راتنج غير متماسك مغطى بجسم مضاد مثبت . تُعرف هذه العملية تحديدًا باسم الترسيب المناعي . يتميز الترسيب المناعي بقدرته على توليد تفاعل شديد التخصص، مما يؤدي عادةً إلى ارتباط البروتين المطلوب فقط. بعد ذلك، يمكن فصل البروتينات الموسومة المنقاة بسهولة عن البروتينات الأخرى في المحلول، ثم إعادة إذابتها في محلول نقي.

عندما لا تعود هناك حاجة إلى العلامات، يمكن فصلها بواسطة إنزيم البروتياز. يتضمن هذا غالبًا هندسة موقع فصل البروتياز بين العلامة والبروتين.

تُغني العلامات ذاتية الانفصال عن الحاجة إلى استخدام البروتيازات لفصل العلامة عن البروتين المستهدف أثناء عملية التنقية ( مثل CapTag ™). ^{[ 12 ] [ 13 ]} المكون الرئيسي للعلامة هو الإنتين، الذي ينفصل ببساطة بعد تغيير درجة الحموضة. ثم يُطلق البروتين المستهدف النقي الخالي من العلامة في محلول الإذابة.

تستكشف الأساليب الحديثة في علم الأحياء التركيبي بدائل خالية من الكروماتوغرافيا، وذلك بتسخير فصل الطور السائل-السائل لإنشاء عضيات اصطناعية داخل الخلايا البكتيرية، مثل الإشريكية القولونية. تستخدم هذه الأساليب هياكل الحمض النووي الريبي المفصولة طوريًا لتقسيم البروتينات إلى حجيرات، مما يتيح التنظيم داخل الخلية، والانقسام الذاتي عبر الإنتينات، والإطلاق المباشر للبروتينات الخالية من العلامات، الأمر الذي يؤدي إلى تحسين كفاءة عمليات إنتاج البروتينات المؤتلفة.

إذا لم يحتوي المحلول على أي مكون قابل للذوبان غير البروتين المعني، فيمكن تجفيف البروتين بالتجميد. ويتم ذلك عادةً بعد إجراء تحليل كروماتوغرافي سائل عالي الأداء (HPLC). يزيل هذا الإجراء جميع المكونات المتطايرة، تاركًا البروتينات فقط.

تُستخدم عملية الترشيح الفائق لتركيز محلول البروتين باستخدام أغشية نفاذية انتقائية. وتتمثل وظيفة الغشاء في السماح بمرور الماء والجزيئات الصغيرة مع الاحتفاظ بالبروتين. ويتم دفع المحلول باتجاه الغشاء بواسطة مضخة ميكانيكية أو ضغط غاز أو جهاز طرد مركزي.

يُعدّ الفصل الكهربائي الهلامي تقنية مخبرية شائعة تُستخدم كطريقة تحضيرية وتحليلية. يعتمد مبدأ الفصل الكهربائي على حركة الأيونات المشحونة في مجال كهربائي. عمليًا، تُسخّن البروتينات في محلول يحتوي على منظف ( SDS ). في هذه الظروف، تُفكّك البروتينات وتُغلّف بجزيئات المنظف سالبة الشحنة. تُفصل البروتينات في SDS-PAGE بناءً على حجمها فقط.

في الطرق التحليلية، تهاجر البروتينات على شكل نطاقات بناءً على حجمها. ويمكن الكشف عن كل نطاق باستخدام صبغات مثل صبغة كوميسي الزرقاء أو صبغة الفضة . تتطلب طرق التحضير لتنقية كميات كبيرة من البروتين استخلاص البروتين من الهلام الكهربائي. وقد يشمل هذا الاستخلاص استئصال الهلام الذي يحتوي على النطاق، أو فصل النطاق مباشرةً من الهلام عند خروجه من نهايته.

في سياق استراتيجية التنقية، يوفر الفصل الكهربائي في ظروف التشويه دقة محسنة مقارنة بالكروماتوغرافيا الاستبعادية الحجمية، ولكنه لا يتناسب مع كميات كبيرة من البروتينات في العينة مثل أعمدة الكروماتوغرافيا المتأخرة .

يُعدّ الفصل الكهربائي الهلامي الأصلي التحضيري (parage) إجراءً غير مُشوِّه للبروتينات المعدنية النشطة بيولوجيًا في مخاليط البروتينات المعقدة. ويجب التأكد من سلامة البروتين المعزول أو سلامته البنيوية باستخدام طريقة مستقلة. ^{[ 14 ]}