قبعة متوسطة الحجم

وسط HAT ( وسط هيبوكسانثين - أمينوبتيرين - ثيميدين ) هو وسط انتقائي لزراعة خلايا الثدييات، يعتمد على مزيج من الأمينوبتيرين ، وهو دواء يعمل كمثبط قوي لاستقلاب حمض الفوليك عن طريق تثبيط إنزيم ديهيدروفولات ريدوكتاز ، مع الهيبوكسانثين ( مشتق بيورين ) والثيميدين ( نيوكليوزيد منزوع الأكسجين ) وهما وسيطان في تخليق الحمض النووي . تكمن الفكرة في أن الأمينوبتيرين يمنع تخليق الحمض النووي من الصفر ، وهو أمر ضروري لاستمرار انقسام الخلية ، بينما يوفر الهيبوكسانثين والثيميدين للخلايا المواد الخام اللازمة لتجاوز هذا التثبيط (مسار الإنقاذ)، شريطة أن تمتلك الخلايا الإنزيمات المناسبة ، أي أن يكون لديها نسخ فعالة من الجينات التي تشفرها.

يُثبَّط إنزيم ثنائي هيدروفولات ريدوكتاز ، الذي يُنتج رباعي هيدروفولات (THF) عن طريق اختزال ثنائي هيدروفولات، بشكلٍ خاص بواسطة أمينوبتيرين. ويستطيع رباعي هيدروفولات، من خلال ارتباطه ببروتينات مُحددة ، استقبال وحدات كربون أحادية تُنقل بعد ذلك إلى أهداف مُحددة.

يُعدّ إنزيم ثيميديلات سينثاز أحد الأهداف المهمة لتكاثر الخلايا ، حيث يُنتج ثيميدين أحادي الفوسفات (TMP) من ديوكسي يوريدين أحادي الفوسفات (dUMP). ومن خلال تفاعلات فسفرة إضافية ، يُمكن استخدام TMP لإنتاج ثيميدين ثلاثي الفوسفات (TTP)، وهو أحد سلائف النيوكليوتيدات الأربعة التي تستخدمها بوليميرازات الحمض النووي لإنتاج الحمض النووي . وبدون رباعي هيدروفوران (THF) اللازم لتحويل dUMP، لا يُمكن إنتاج TTP، وبالتالي لا يُمكن أن يستمر تخليق الحمض النووي، إلا إذا أمكن إنتاج TMP من مصدر آخر. المصدر البديل هو الثيميدين الموجود في وسط HAT، والذي يُمكن للخلايا امتصاصه وفسفرته بواسطة إنزيم ثيميدين كيناز (TK) إلى TMP.

يتطلب تخليق الإينوزين أحادي الفوسفات (IMP)، وهو طليعة الجوانوزين أحادي الفوسفات (GMP) والجوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP)، والأدينوزين أحادي الفوسفات (AMP) والأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)، وجود رباعي هيدروفوران (THF)، ويمكن تجاوز هذه العملية. في هذه الحالة، يتفاعل إنزيم هيبوكسانثين-جوانين فوسفوريبوزيل ترانسفيراز (HGPRT) مع الهيبوكسانثين الممتص من الوسط مع بيروفوسفات البروبيلين (PRPP) ، مُحررًا البيروفوسفات ، لإنتاج الإينوزين أحادي الفوسفات (IMP) عبر مسار إعادة التدوير.

لذا، يُعد استخدام وسط HAT لزراعة الخلايا شكلاً من أشكال الانتقاء الاصطناعي للخلايا التي تحتوي على جيني TK وHGPRT فعالين. وقد أُتيحت العديد من التحسينات المفيدة لهذه الطريقة بفضل السموم التي تقتل الخلايا، والتي تكون الخلايا محصنة ضدها إذا كانت تفتقر إلى أحد هذين الجينين. فعلى سبيل المثال، تُقاوم الخلية التي تفتقر إلى جين TK مادة بروموديوكسي يوريدين (BrdU)، وتُقاوم الخلية التي تفتقر إلى جين HGPRT مادتي 6-ثيوغوانين (6-TG) و8-أزاغوانين . وبالتالي، فإن الانتقاء باستخدام أحد هذين الدواءين الأخيرين، متبوعًا بوسط HAT، سينتج عنه مستعمرات مُستعادة . ^{[ 1 ]}

يُستخدم وسط HAT لتحضير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة . تُعرَّض حيوانات المختبر (مثل الفئران) أولًا لمستضد نرغب في عزل جسم مضاد ضده . بعد عزل الخلايا الطحالية من الثدييات، تُدمج الخلايا البائية مع خلايا ورم نقوي خالدة خالية من HGPRT باستخدام بولي إيثيلين جلايكول أو فيروس سينداي . تُحضن الخلايا المدمجة في وسط HAT . يعمل الأمينوبتيرين الموجود في الوسط على تثبيط مسار التخليق الحيوي للخلايا . وبالتالي، تموت خلايا الورم النقوي غير المدمجة، لأنها لا تستطيع إنتاج النيوكليوتيدات عبر مسار التخليق الحيوي أو مسار الإنقاذ. تموت الخلايا البائية غير المدمجة أيضًا نظرًا لقصر عمرها. وبهذه الطريقة، تبقى فقط الخلايا الهجينة من الخلايا البائية والورم النقوي. تُنتج هذه الخلايا أجسامًا مضادة (وهي خاصية للخلايا البائية) وهي خالدة (وهي خاصية لخلايا الورم النقوي). يُخفف الوسط المحضون بعد ذلك في صفائح متعددة الآبار بحيث تحتوي كل بئر على خلية واحدة فقط. ثم يُفحص السائل الطافي في كل بئر بحثًا عن الجسم المضاد المطلوب. بما أن الأجسام المضادة في البئر يتم إنتاجها بواسطة نفس الخلية البائية، فإنها ستكون موجهة نحو نفس الإبيتوب ، وتُعرف باسم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة .

تم اختراع إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لأول مرة بواسطة سيزار ميلشتاين وجورج جيه ​​إف كولر ، الأمر الذي أكسبهما جائزة نوبل في الطب أو علم وظائف الأعضاء لعام 1984، والتي تقاسماها مع نيلز كاج جيرن .