مجهر الانعكاس التداخلي

📅 آخر تحديث: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 8 صور
الموسوعة الحرة
مبدأ المجهر الانعكاسي التداخلي (IRM)
مبدأ مجهر الانعكاس التداخلي (IRM) يوضح تأثير التداخل على الموجات المنعكسة وتأثيره على شدة الصورة النهائية. تمثل الموجة البنفسجية الداكنة الضوء الصادر من مصدر الضوء. أما الموجات البنفسجية الفاتحة فهي انعكاسات من غشاء الخلية وسطح الزجاج. عند اصطدام الموجات المنعكسة بسطح الزجاج، تنزاح بمقدار نصف طول موجي. عندما يكون الغشاء قريبًا جدًا من الزجاج، ينعكس الضوء خارج الطور مع الشعاع المنعكس من الزجاج، مما يُسبب تداخلًا هدّامًا (انظر الخط الأحمر)، وينتج عنه بكسل داكن. أما إذا كانت المسافة بين الغشاء والزجاج أكبر، فإن الموجات العائدة تنزاح بشكل أقل، مما يُسبب تداخلًا بنّاءً (انظر الخط الأحمر)، وينتج عنه بكسل أكثر سطوعًا في الصورة النهائية. يوضح الشكل معاملات الانكسار النموذجية للزجاج والوسط وغشاء الخلية، والتي تحدد مقدار الانعكاس.

المجهر الانعكاسي التداخلي ( IRM )، والذي يُسمى أيضًا مجهر التباين التداخلي الانعكاسي ( RICM ) أو مجهر التباين الانعكاسي ( RCM ) اعتمادًا على العناصر البصرية المستخدمة، هو تقنية مجهرية ضوئية تستفيد من تأثيرات التداخل في الأغشية الرقيقة لتكوين صورة لجسم ما على سطح زجاجي. تُعد شدة الإشارة مقياسًا لقرب الجسم من السطح الزجاجي. يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة الأحداث التي تحدث على غشاء الخلية دون الحاجة إلى استخدام علامة (فلورية) كما هو الحال في مجهر TIRF .

التاريخ والاسم

في عام 1964، صاغ آدم إس جي كورتيس مصطلح مجهر الانعكاس التداخلي ( IRM )، مستخدمًا إياه في مجال بيولوجيا الخلية لدراسة الخلايا الليفية في قلب جنين الدجاج. [ 1 ] [ 2 ] استخدم كورتيس تقنية IRM لفحص مواقع الالتصاق ومسافات الخلايا الليفية، ملاحظًا أن التلامس مع الزجاج كان يقتصر في الغالب على محيط الخلية والأقدام الكاذبة . [ 1 ]

في عام 1975، قدّم يوهان سيباستيان بلويم تحسينًا على تقنية المجهر الانعكاسي التبايني (IRM) (نُشر في فصل من كتاب [ 3 ] )، أطلق عليه اسم المجهر الانعكاسي التبايني ( RCM ). [ 4 ] يتمثل هذا التحسين في استخدام عدسة موضوعية مضادة للانحناء ومستقطبات متقاطعة لتقليل الضوء الشارد في النظام البصري. يُشار إلى هذه التقنية اليوم بشكل أساسي باسم المجهر الانعكاسي التبايني التداخلي ( RICM )، [ 5 ] [ 6 ] وهو الاسم الذي أطلقه باريتر-هان وكونراد بيك في عام 1979. [ 7 ]

مع ذلك، يُستخدم مصطلح IRM أحيانًا لوصف إعداد RICM. وقد تسبب تعدد الأسماء المستخدمة لوصف هذه التقنية في بعض الالتباس، ونوقش هذا الأمر في وقت مبكر من عام 1985 من قبل فيرشويرن. [ 8 ]

نظرية

لتكوين صورة للخلية الملتصقة، يُمرر ضوء ذو طول موجي محدد عبر مستقطب . ينعكس هذا الضوء المستقطب خطيًا بواسطة فاصل شعاع نحو العدسة الشيئية ، التي تُركز الضوء على العينة. سطح الزجاج عاكس بدرجة معينة، لذا يعكس الضوء المستقطب. أما الضوء الذي لا ينعكس بواسطة الزجاج، فينتقل إلى داخل الخلية وينعكس بواسطة غشاء الخلية. تحدث ثلاث حالات محتملة. أولًا، عندما يكون الغشاء قريبًا من الزجاج، ينزاح الضوء المنعكس من الزجاج بمقدار نصف طول موجي، ما يؤدي إلى اختلاف طوري بين الضوء المنعكس من الغشاء والضوء المنعكس من الزجاج، وبالتالي يلغي أحدهما الآخر ( تداخل ). ينتج عن هذا التداخل بكسل داكن في الصورة النهائية (الحالة اليسرى في الشكل). ثانيًا، عندما لا يكون الغشاء ملتصقًا بالزجاج، يكون الانعكاس من الغشاء أقل اختلافًا في الطور من الضوء المنعكس من الزجاج، وبالتالي لا يلغي أحدهما الآخر، ما ينتج عنه بكسل ساطع في الصورة (الحالة اليمنى في الشكل). ثالثًا، عندما لا توجد عينة، يتم الكشف فقط عن الضوء المنعكس من الزجاج وسيظهر كبكسلات ساطعة في الصورة النهائية.

سيعود الضوء المنعكس إلى فاصل الشعاع ويمر عبر مستقطب ثانٍ، يزيل الضوء المتناثر، قبل أن يصل إلى الكاشف (عادةً كاميرا CCD ) لتكوين الصورة النهائية. يمكن للمستقطبات أن تزيد الكفاءة عن طريق تقليل الضوء المتناثر؛ ومع ذلك، في نظام حديث مزود بكاميرا رقمية حساسة، فهي غير ضرورية. [ 9 ]

نظرية

يحدث الانعكاس نتيجة لتغير معامل الانكسار، لذا ينعكس جزء من الضوء على كل سطح فاصل. وتُحدد كمية الانعكاس بمعامل الانعكاس.ر12{\displaystyle r_{12}\!}، وفقًا للقاعدة التالية: [ 8 ]

ر12=ن1-ن2ن1+ن2{\displaystyle r_{12}={\frac {n_{1}-n_{2}}{n_{1}+n_{2}}}}

الانعكاسيةR{\displaystyle R\!}هي نسبة شدة الضوء المنعكس (أنار{\displaystyle I_{r}\!}) وشدة الضوء الوارد (أناأنا{\displaystyle I_{i}\!}): [ 8 ]

R=أنارأناأنا=[ن1-ن2ن1+ن2]2=ر122{\displaystyle R={\frac {I_{r}}{I_{i}}}=\left\lbrack {\frac {n_{1}-n_{2}}{n_{1}+n_{2}}}\right\rbrack ^{2}={r_{12}}^{2}}

باستخدام معاملات الانكسار النموذجية للزجاج (1.50-1.54، انظر القائمة )، والماء (1.31، انظر القائمة )، وغشاء الخلية (1.48) [ 10 ] ، والسيتوسول ( 1.35) [ 10 ] ، يمكن حساب نسبة الضوء المنعكس من كل سطح فاصل. تزداد كمية الانعكاس مع ازدياد الفرق بين معاملات الانكسار، مما ينتج عنه انعكاس كبير من السطح الفاصل بين سطح الزجاج ووسط الاستنبات (مماثل تقريبًا للماء: 1.31-1.33). هذا يعني أنه بدون خلية، ستكون الصورة ساطعة، بينما عند التصاق الخلية، يتسبب الفرق بين الوسط والغشاء في انعكاس كبير مع إزاحة طفيفة في الطور، مما يؤدي إلى تداخل مع الضوء المنعكس من الزجاج. ولأن سعة الضوء المنعكس من السطح الفاصل بين الوسط والغشاء تقل بسبب التشتت، ستظهر المنطقة الملتصقة أغمق، ولكنها لن تكون سوداء تمامًا. ولأن مخروط الضوء المُركّز على العينة يُنتج زوايا سقوط مختلفة، فهناك نطاق واسع من أنماط التداخل. عندما يختلف النمطان بأقل من طول موجة واحدة (هدب الرتبة الصفرية)، يتقاربان، مما يؤدي إلى زيادة شدة الإضاءة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام عدسة موضوعية ذات فتحة عددية أكبر من 1. [ 8 ]

متطلبات

من أجل تصوير الخلايا باستخدام IRM، يحتاج المجهر على الأقل إلى العناصر التالية: 1) مصدر ضوء، مثل مصباح هالوجين ، 2) مرشح بصري (يمرر نطاقًا صغيرًا من الأطوال الموجية)، و3) مقسم شعاع (يعكس 50% وينقل 50% من الطول الموجي المختار).

يحتاج مصدر الضوء إلى إنتاج ضوء عالي الكثافة، نظرًا لفقدان كمية كبيرة من الضوء عبر مُقسِّم الشعاع والعينة نفسها. وتؤدي الأطوال الموجية المختلفة إلى صور IRM مختلفة؛ فقد أظهر بيريتير-هان وزملاؤه أن الضوء بطول موجي 546  نانومتر يُعطي تباينًا أفضل لخلايا PtK 2 الخاصة بهم مقارنةً بالضوء الأزرق بطول موجي 436  نانومتر. [ 7 ] وقد أُدخلت تحسينات عديدة على النظرية الأساسية لتقنية IRM، معظمها يزيد من كفاءة وتكوين الصورة. فبوضع مستقطبات ولوحة ربع موجة بين مُقسِّم الشعاع والعينة، يُمكن تحويل الضوء المستقطب خطيًا إلى ضوء مستقطب دائريًا ، ثم إعادته إلى ضوء مستقطب خطيًا، مما يزيد من كفاءة النظام. وتناقش مقالة المستقطب الدائري هذه العملية بالتفصيل. علاوة على ذلك، بإضافة مستقطب ثانٍ، مُدار بزاوية 90 درجة مقارنةً بالمستقطب الأول، يُمكن منع الضوء الشارد من الوصول إلى الكاشف، مما يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء (انظر الشكل 2 من فيرشويرن [ 8 ] ).

التطبيقات البيولوجية

توجد عدة طرق يمكن من خلالها استخدام تقنية التصوير بالرنين المغناطيسي لدراسة العينات البيولوجية. ركزت الأمثلة المبكرة لاستخدام هذه التقنية على التصاق الخلايا [ 1 ] وهجرة الخلايا . [ 11 ]

اندماج الحويصلات

تم تصوير خليتين من خلايا الكرومافين باستخدام تقنية DIC (يسار) وتقنية IRM (يمين).
تم تصوير اندماج الحويصلات باستخدام تقنية التصوير بالرنين المغناطيسي بالأشعة تحت الحمراء. يمثل شريط المقياس 2  ميكرومتر.

في الآونة الأخيرة، استُخدمت هذه التقنية لدراسة الإخراج الخلوي في خلايا الكرومافين . [ 9 ] عند تصوير خلايا الكرومافين باستخدام تقنية التباين التفاضلي التداخلي (DIC)، تظهر كخلايا مستديرة ذات نتوءات صغيرة. وعند تصوير الخلية نفسها باستخدام تقنية التصوير بالرنين المغناطيسي بالأشعة تحت الحمراء (IRM)، يمكن رؤية أثر الخلية على الشريحة الزجاجية بوضوح كمنطقة داكنة ذات نتوءات صغيرة. وعندما تندمج الحويصلات مع الغشاء، تظهر كدوائر ضوئية صغيرة داخل الأثر الداكن (بقع ساطعة في الخلية العلوية في اللوحة اليمنى).

يُظهر الفيديو رقم 1 مثالًا على اندماج الحويصلات في خلايا الكرومافين باستخدام تقنية التصوير بالرنين المغناطيسي بالأشعة تحت الحمراء (IRM). عند التحفيز بتركيز 60 ملي مولار من البوتاسيوم ، تبدأ بقع مضيئة متعددة بالظهور داخل المنطقة المظلمة لخلية الكرومافين نتيجةً لإخراج الحبيبات ذات النواة الكثيفة . ولأن تقنية IRM لا تتطلب استخدام علامات فلورية، يمكن دمجها مع تقنيات تصوير أخرى، مثل المجهر الفلوري ومجهر TIRF، لدراسة ديناميكيات البروتين بالتزامن مع إخراج الحويصلات وابتلاعها. ومن فوائد عدم استخدام العلامات الفلورية أيضًا تقليل السمية الضوئية . 

مراجع

  1. 1 2 3 كورتيس، أ. س. (فبراير 1964). "آلية التصاق الخلايا بالزجاج  : دراسة باستخدام مجهر الانعكاس التداخلي" . مجلة بيولوجيا الخلية . 20 (2): 199-215 . doi : 10.1083/jcb.20.2.199 . PMC 2106393. PMID 14126869 .  
  2. ↑ فيلر تي جيه، بيوكر إي تي (أبريل 2000). "مجهر التباين الانعكاسي (RCM): تقنية منسية؟". مجلة علم الأمراض . 190 (5): 635-638 . doi : 10.1002/(SICI)1096-9896(200004)190:5 < 635::AID - PATH571 > 3.0.CO ; 2-E . PMID 10727991. S2CID 43800311 .  
  3. ↑ فورث، رالف فان (1975). "الفصل 27: مجهر التباين الانعكاسي كأداة لدراسة التصاق الخلايا الحية بسطح زجاجي". الخلايا البلعمية أحادية النواة: في المناعة والعدوى وعلم الأمراض . أكسفورد: بلاكويل ساينتيفيك. الصفحات 405-421 . ISBN  0-632-00471-1. OCLC 2701405 . 
  4. ↑ بلويم، يوهان سيباستيان (21 فبراير 2019). "تطبيقات مجهر التباين الانعكاسي، بما في ذلك الكشف الحساس عن نتائج التهجين الموضعي: مراجعة". مجلة المجهر . 274 (2). وايلي: 79-86 . doi : 10.1111/jmi.12785 . ISSN 0022-2720 . PMID 30720204. S2CID 73431526 .   
  5. ↑ ثيودولي، أ.؛ هوانغ، ز.-هـ.؛ فالينات، م.-ب. (30-11-2009). "نمذجة جديدة لمجهر التباين التداخلي الانعكاسي تتضمن تأثيرات الاستقطاب والفتحة العددية: تطبيق على قياسات المسافة النانومترية وإعادة بناء ملامح الجسم" (ملف PDF) . لانغمير . 26 (3). الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS): 1940-1948 . doi : 10.1021/la902504y . ISSN 0743-7463 . PMID 19947618 .  
  6. ↑ ليموزين، لوران؛ سينغوبتا، خيا (2009-11-03). "المجهر الكمي للتباين التداخلي الانعكاسي (RICM) في المواد اللينة والتصاق الخلايا". ChemPhysChem . 10 (16). وايلي: 2752-2768 . doi : 10.1002/cphc.200900601 . ISSN 1439-4235 . 
  7. 1 2 بيريتير-هان ج، فوكس سي إتش، ثوريل ب (سبتمبر 1979). "المجهر الكمي الانعكاسي المتباين للخلايا الحية" . مجلة بيولوجيا الخلية . 82 (3): 767-779 . doi : 10.1083/jcb.82.3.767 . PMC 2110483. PMID 389938 .  
  8. 1 2 3 4 5 فيرشويرن، هـ. (أبريل 1985). "مجهر الانعكاس التداخلي في بيولوجيا الخلية: المنهجية والتطبيقات" . مجلة علوم الخلية . 75 (1): 279-301 . doi : 10.1242/jcs.75.1.279 . PMID 3900106 . 
  9. وو إم إم، لوبيت إيه، لاغنادو إل (نوفمبر 2009). "الترابط الضعيف بين قنوات الكالسيوم ومواقع الإخراج الخلوي في خلايا الكرومافين" . مجلة علم وظائف الأعضاء . 587 (الجزء 22): 5377-91 . doi : 10.1113/jphysiol.2009.176065 . PMC 2793871. PMID 19752110 .  
  10. 1 2 دان، أندرو كينيث (1997). "بنية الخلية" . خصائص تشتت الضوء في الخلايا (أطروحة دكتوراه). جامعة تكساس في أوستن . OCLC 39949488. تاريخ الاسترجاع: 23 فبراير 2010 . 
  11. ↑ غودوين إس إل، فليتشر إم، بورشارد آر بي (سبتمبر 1989). "دراسة مجهرية انعكاسية تداخلية لمواقع الارتباط بين البكتيريا المنزلقة والركائز الزجاجية" . مجلة علم البكتيريا . 171 (9): 4589-94 . doi : 10.1128/jb.171.9.4589-4594.1989 . PMC 210255. PMID 2768185 .  

للمزيد من القراءة

  • ليموزين، لوران؛ سينغوبتا، خيا (9 نوفمبر 2009). "المجهر الكمي الانعكاسي التداخلي المتباين (RICM) في المواد اللينة والتصاق الخلايا". ChemPhysChem . 10 (16): 2752–2768 . doi : 10.1002/cphc.200900601 . ISSN 1439-4235 .