توقف التدفق

تُمكّن مطيافية التدفق المتوقف من دراسة الحركية الكيميائية في المحلول للتفاعلات السريعة، والتي عادةً ما يكون عمر النصف لها في نطاق أجزاء من الألف من الثانية. في البداية، استُخدمت هذه التقنية بشكل أساسي لدراسة التفاعلات المحفزة بالإنزيمات، لكنها سرعان ما أصبحت أداةً أساسيةً في مختبرات الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية والكيمياء لتتبع العمليات الكيميائية السريعة.

في أبسط صوره، يقوم نظام التدفق المتوقف بمزج محلولين بسرعة. تُضخ كميات صغيرة من كل محلول إلى خلاط عالي الكفاءة، مما يُحفز تفاعلاً سريعاً. ثم يتدفق المحلول المختلط إلى خلية الملاحظة، مُزيحاً المحتويات المتبقية من التجربة السابقة أو من عملية الغسل. يُشار إلى الوقت الذي يستغرقه المحلول للانتقال من نقطة المزج إلى نقطة الملاحظة باسم "الزمن الميت". يعتمد الحد الأدنى لحجم الحقن على حجم خلية المزج.

بمجرد حقن كمية كافية من المحلول لاستبدال المحلول السابق تمامًا، يصل النظام إلى حالة استقرار، ويتوقف التدفق. يمكن تحقيق ذلك باستخدام محقنة إيقاف ووحدة إيقاف نهائية. عند هذه النقطة، يرسل الجهاز "إشارة بدء"، أو إشارة تشغيل، إلى الكاشف لمراقبة التفاعل. يتم التحكم في توقيت إشارة التشغيل بواسطة برنامج، مما يسمح للمستخدمين بمزامنتها مع إيقاف التدفق أو قبل ذلك بقليل للتأكد من الوصول إلى حالة الاستقرار.

يتحدد أداء جهاز التدفق المتوقف إلى حد كبير بزمن التوقف. يُعرَّف زمن التوقف بأنه الفترة الزمنية بين مزج المواد المتفاعلة وبدء الملاحظة، وهو في جوهره عمر التفاعل لحظة دخول مزيج التفاعل إلى خلية الملاحظة. وتتمثل العوامل المحددة لزمن التوقف في جهاز تدفق متوقف معين في كفاءة الخلاط، والمسافة بين الخلاط والخلية، ومعدل تدفق مزيج التفاعل لحظة توقف التدفق. وبحسب أبعاد خلية الملاحظة المستخدمة، تستطيع أجهزة التدفق المتوقف الحديثة عادةً تحقيق أزمنة توقف تتراوح بين 0.5 و1 مللي ثانية.

أبسط طريقة تشغيل لجهاز التدفق المتوقف هي استخدام تكوين خلط أحادي. يُستخدم مادتان متفاعلتان؛ تُعبأ هاتان المادتان في محاقن وتُدفعان عبر الخلاط والخلية البصرية بفعل مكبس هوائي يُحرك مكابس المحقنة. يدخل خليط التفاعل الخارج من الخلية البصرية إلى محقنة ثالثة (محقنة الإيقاف)، ويتوقف التدفق عندما يلامس مكبس محقنة الإيقاف مفتاح التشغيل. يؤدي هذا إلى إيقاف التدفق وبدء جمع البيانات في آنٍ واحد.

عادةً، تكون محقنتا الدفع متماثلتين في الحجم لتحقيق نسبة خلط 1:1، ولكن يمكن دمج محاقن بأحجام مختلفة للحصول على نسب خلط أخرى تصل إلى 1:10 أو 1:20. هذا ما يسمى بالخلط غير المتماثل، أو الخلط النسبي، وهو مطلب شائع في أعمال التدفق المتوقف.

الخلط المتسلسل، أو الخلط المزدوج، هو شكل من أشكال اختبار التدفق المتوقف، حيث يُدفع مادتان متفاعلتان عبر خلاط أولي إلى حلقة معالجة. بعد فترة تأخير محددة، يُدفع السائل المختلط عبر خلاط منفصل مع مادة متفاعلة ثالثة، ويُدرس التفاعل اللاحق كما في الخلط الأحادي. يُستخدم الخلط المتسلسل لدراسة سلوك وسائط التفاعل أو الحالات العابرة قصيرة الأجل.

يُستخدم مصباح زينون قوسي غير مُنتج للأوزون بشكل شائع في معظم تجارب التدفق المتوقف العامة التي تتجاوز 250 نانومتر. تتميز مصابيح الزينون واسعة الطيف بتعدد استخداماتها، مما يسمح للمستخدمين باختيار أي طول موجي تقريبًا لدراسات الامتصاص أو التألق، مما يجعلها مثالية لتطبيقات مثل مراقبة التغيرات الهيكلية في البروتينات بمرور الوقت.

بالنسبة لتطبيقات الأشعة فوق البنفسجية البعيدة، تتوفر مصابيح زينون قوسية منتجة للأوزون، لكنها تتطلب تنظيفًا بغاز النيتروجين النقي لمنع تراكم الأوزون وتدهور الخصائص البصرية. في المقابل، تُعد مصابيح الزئبق-زينون (Hg-Xe) مناسبة تمامًا لتجارب التألق الضوئي حيث يتوافق طول موجة الإثارة المطلوبة مع أحد خطوط انبعاث الزئبق الشديدة.

تُعد مصادر ضوء LED خيارًا شائعًا وغير مكلف لتجارب التدفق المتوقف، خاصة عندما تكون هناك حاجة إلى طول موجي واحد أو عدد قليل من الأطوال الموجية المحددة.

تُملأ محقنتان بمحاليل خاملة حتى يتم مزجها. تُوصل هاتان المحقنتان معًا وتُفرغان في جهاز المزج في آنٍ واحد، إما بواسطة مكبس واحد أو محركات خطوية مستقلة. يُمكن تحقيق المزج النسبي بسهولة باستخدام محاقن ذات سعات حجمية مختلفة، مما يُتيح تحكمًا دقيقًا في نسب المحاليل المُدمجة. أما بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب مزجًا متسلسلًا - مثل تحضين كاشفين مسبقًا قبل إضافة كاشف ثالث - فيُمكن استخدام مكبسين مستقلين للسماح بتسلسلات مزج أكثر تعقيدًا.

بمجرد خروج المحلولين من محاقنهما، يدخلان نظام خلط مصمم لضمان مزجهما جيدًا، وعادةً ما يستخدم تصميمًا هندسيًا مثل الخلاط على شكل حرف T. يعزز هذا النظام التدفق المضطرب، مما يحقق مزجًا كاملًا. في المقابل، يؤدي التدفق الصفائحي إلى تدفق المحلولين جنبًا إلى جنب، مما ينتج عنه مزج غير كامل.

زمن التوقف هو الفترة الزمنية اللازمة لانتقال المحاليل من نقطة المزج إلى نقطة الملاحظة، وهو يمثل جزءًا من حركية التفاعل لا يمكن رصده. يؤدي تقليل زمن التوقف إلى تحسين أداء الجهاز وتمكين دراسة نطاق أوسع من التفاعلات. تتراوح أزمنة التوقف النموذجية بين 0.5 و1 مللي ثانية، وذلك حسب تصميم الجهاز. ^{[ 4 ]}

يمكن تقليل زمن التوقف عن طريق تصغير أبعاد خلية التدفق، إلا أن هذه الطريقة لها قيود بسبب انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء الناتج عن صغر نوافذ المراقبة وقصر مسارات الضوء. يُعد تفاعل إخماد التألق بين N-أسيتيل تريبتوفاناميد (NAT) و N-بروموسكسينيميد (NBS)، كما وصفه بيترمان، طريقة شائعة الاستخدام لقياس زمن التوقف في أجهزة التدفق المتوقف. ^{[ 5 ]}

تُضخ المواد المتفاعلة المختلطة إلى خلية مراقبة (خلية تدفق) حيث يمكن رصد التفاعل باستخدام مطياف ضوئي، عادةً باستخدام تقنيات مثل الامتصاص ، والتألق ، وتباين التألق ، أو الاستقطاب الدائري . ومن الشائع بشكل متزايد الجمع بين عدة تقنيات من هذه التقنيات لإجراء تحليل أكثر شمولاً. ^{[ 6 ]}

تتوفر خراطيش خلايا التدفق عادةً بأطوال مسار امتصاص تتراوح من 1 إلى 10 مم، وأطوال مسار فلورية أقصر تبلغ حوالي 2 مم. وتُعدّ أطوال المسار القصيرة مهمةً للغاية لقياسات الفلورة لتقليل تأثير المرشح الداخلي. صُممت أجهزة التدفق المتوقف الحديثة لتناسب أحجامًا متنوعة من خلايا التدفق لتلبية الاحتياجات التجريبية المختلفة.

بمجرد حقن كمية كافية من المحلول لاستبدال محتويات خلية المراقبة بالكامل، يتدفق المزيج إلى محقنة ثالثة تُعرف بمحقنة الإيقاف. تصطدم هذه المحقنة بآلية إيقاف صلبة مُعايرة الحجم، مما يوقف التدفق ويُعيد النظام إلى حالة سكون. في هذه اللحظة، يتم تشغيل الكاشف لبدء مراقبة التفاعل.

قد تعمل أجهزة قياس الطيف الضوئي بتقنية التدفق المتوقف كأجهزة مستقلة، ولكنها غالبًا ما تُدمج في أنظمة لقياس الاستقطاب الدائري (CD) والامتصاص و/أو التألق، أو تُجهز بملحقات متنوعة لدعم تطبيقات متخصصة. تشمل الملحقات الشائعة لأجهزة التدفق المتوقف ما يلي:

• مصادر الضوء : تشمل الخيارات الزينون (المنتج للأوزون أو غير المنتج للأوزون)، والزئبق-زينون (Hg-Xe)، والديوتيريوم، ومصادر LED أحادية الطول الموجي.
• أجهزة أحادية اللون : تُستخدم أجهزة أحادية اللون القائمة على محزز الحيود على نطاق واسع ويمكن تهيئتها لإثارة التألق أو مسح الانبعاث بدقة.
• خلايا المراقبة : تتوفر مجموعة من أحجام خلايا التدفق، وعادة ما تتراوح أطوال المسار من 1 إلى 10 مم.
• أجهزة الكشف : تُستخدم أجهزة الكشف الأنبوبية المضاعفة الضوئية (PMT) بشكل شائع نظرًا لحساسيتها العالية. كما تتوفر أجهزة الكشف المصفوفية الضوئية (PDA) للحصول على بيانات الطيف الكامل في وقت واحد.

تشمل الإضافات أو الملحقات الشائعة الأخرى ما يلي:

• مرشحات استقطاب/تباين التألق : لقياس التفاعلات الجزيئية أو الديناميكيات الهيكلية.
• الملحقات اللاهوائية : للتجارب التي تُجرى في أجواء خاملة أو في صناديق القفازات.
• محولات التبريد والتدفق : مثالية للتجارب المتخصصة، مثل تبادل الهيدروجين والديوتيريوم (HDX).

تعمل هذه الملحقات والتكوينات على تعزيز تنوع أجهزة قياس الطيف الضوئي ذات التدفق المتوقف، مما يتيح استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات في الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية والكيمياء.