التحقق من صحة البنية

التحقق من صحة بنية الجزيئات الكبيرة هو عملية تقييم موثوقية النماذج الذرية ثلاثية الأبعاد للجزيئات البيولوجية الكبيرة، مثل البروتينات والأحماض النووية . تُستمد هذه النماذج، التي توفر إحداثيات ثلاثية الأبعاد لكل ذرة في الجزيء (انظر المثال في الصورة)، من تجارب البيولوجيا التركيبية ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية ^{[ 1 ]} أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ^{[ 2 ]} . يتضمن التحقق ثلاثة جوانب: 1) التحقق من صحة آلاف إلى ملايين القياسات في التجربة؛ 2) التحقق من مدى اتساق النموذج الذري مع تلك البيانات التجريبية؛ 3) التحقق من اتساق النموذج مع الخصائص الفيزيائية والكيميائية المعروفة.

تُعدّ البروتينات والأحماض النووية ركائز أساسية في علم الأحياء، إذ تُوفّر التفاعلات الكيميائية الضرورية، والتنظيم البنيوي، والنمو، والحركة، والتكاثر، والحساسية البيئية. ومن الضروري لوظائفها البيولوجية معرفة بنيتها ثلاثية الأبعاد بالتفصيل، والتغيرات التي تطرأ عليها. لفهم هذه الوظائف والتحكم بها، نحتاج إلى معرفة دقيقة بالنماذج التي تُمثّل هذه البنى، بما في ذلك نقاط قوتها العديدة ونقاط ضعفها المحتملة.

يشمل المستخدمون النهائيون لنماذج الجزيئات الكبيرة الأطباء والمعلمين والطلاب، بالإضافة إلى علماء الأحياء البنيوية أنفسهم، ومحرري المجلات والمراجعين ، والباحثين التجريبيين الذين يدرسون الجزيئات الكبيرة بتقنيات أخرى، والباحثين النظريين وعلماء المعلوماتية الحيوية الذين يدرسون خصائص أكثر عمومية للجزيئات البيولوجية. تختلف اهتماماتهم ومتطلباتهم، لكن جميعهم يستفيدون بشكل كبير من فهم شامل ومحلي لموثوقية النماذج.

سبق علم البلورات الجزيئية الكبيرة مجالٌ أقدم هو علم البلورات بالأشعة السينية للجزيئات الصغيرة (للهياكل التي تحتوي على أقل من بضع مئات من الذرات). تمتد بيانات حيود الأشعة السينية للجزيئات الصغيرة إلى دقة أعلى بكثير مما هو ممكن للجزيئات الكبيرة، وتتميز بعلاقة رياضية دقيقة للغاية بين البيانات والنموذج الذري. يقيس عامل التباين، أو R-factor، مدى التوافق بين البيانات التجريبية والقيم المحسوبة من النموذج الذري. بالنسبة لهيكل جزيئي صغير محدد بدقة، يكون عامل التباين صغيرًا جدًا، يكاد يساوي عدم اليقين في البيانات التجريبية (أقل بكثير من 5%). لذا، يوفر هذا الاختبار وحده معظم التحقق المطلوب، ولكن يتم إجراء عدد من عمليات التحقق الإضافية من الاتساق والمنهجية بواسطة برامج آلية ^{[ 3 ]} كشرط أساسي لأوراق بحثية حول بنية البلورات الجزيئية الصغيرة المقدمة إلى مجلات الاتحاد الدولي لعلم البلورات (IUCr) مثل Acta Crystallographica القسم B أو C. وتُحفظ الإحداثيات الذرية لهذه البنى الجزيئية الصغيرة ويُمكن الوصول إليها من خلال قاعدة بيانات كامبريدج الهيكلية (CSD) ^{[ 4 ]} أو قاعدة بيانات علم البلورات المفتوحة (COD) ^{[ 5 ] .}

طُوِّر أول برنامج للتحقق من صحة الجزيئات الكبيرة حوالي عام 1990، للبروتينات. وقد تضمن التحقق المتبادل Rfree لمطابقة النموذج مع البيانات، ^{[ 6 ]} ومعلمات طول الرابطة والزاوية للهندسة التساهمية، ^{[ 7 ]} ومعايير التشكيل الجانبي والعمود الفقري. ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]} بالنسبة لهياكل الجزيئات الكبيرة، تُودَع النماذج الذرية في بنك بيانات البروتين (PDB)، الذي لا يزال الأرشيف الوحيد لهذه البيانات. أُنشئ بنك بيانات البروتين في سبعينيات القرن العشرين في مختبر بروكهافن الوطني ، ^{[ 11 ]} ونُقل في عام 2000 إلى RCSB (التعاون البحثي لعلم الأحياء الهيكلي) الذي يقع مقره في جامعة روتجرز ، ^{[ 12 ]} ووُسِّع في عام 2003 ليصبح wwPDB ( بنك بيانات البروتين العالمي )، ^{[ 13 ]} مع إضافة مواقع وصول في أوروبا () وآسيا (), وباستخدام بيانات الرنين المغناطيسي النووي التي يتم التعامل معها في بنك بيانات الرنين المغناطيسي الحيوي (BMRB) في ولاية ويسكونسن.

سرعان ما أصبح التحقق من الصحة إجراءً قياسيًا في هذا المجال، ^{[ 14 ]} مع مزيد من التطورات الموضحة أدناه. *يحتاج هذا القسم إلى مزيد من التوضيح*

شهدت إمكانية تطبيق التحقق الشامل لكل من الأشعة السينية والرنين النووي المغناطيسي دفعةً قويةً اعتبارًا من 1 فبراير 2008، عندما فرض بنك بيانات البروتين العالمي (wwPDB) إلزامية إيداع البيانات التجريبية مع الإحداثيات الذرية. ومنذ عام 2012، يجري العمل على اعتماد أشكال قوية من التحقق لإيداع البيانات في wwPDB، بناءً على توصيات لجان فريق عمل التحقق التابع لـ wwPDB، وذلك فيما يخص علم البلورات بالأشعة السينية ^{[ 15 ]} ، والرنين النووي المغناطيسي ^{[ 16 ]} ، وتشتت الأشعة السينية بزوايا صغيرة (SAXS )، والمجهر الإلكتروني فائق البرودة (cryoEM ) ^{[ 17 ] .}

يمكن تقسيم عمليات التحقق إلى ثلاث مراحل: التحقق من صحة البيانات الأولية المُجمّعة (التحقق من صحة البيانات)، وتفسير البيانات في النموذج الذري (التحقق من صحة النموذج بالبيانات)، وأخيرًا التحقق من صحة النموذج نفسه. في حين أن الخطوتين الأوليين خاصتان بالتقنية المستخدمة، فإن التحقق من ترتيب الذرات في النموذج النهائي ليس كذلك.

التحقق من صحة النموذج

الهندسة

^{[ 7 ] [ 18 ] [ 19 ]}

التكوين (الزوايا ثنائية السطوح): البروتين والحمض النووي الريبي

لقد ثبت أن زوايا ثنائي السطوح للهيكل الأساسي والسلاسل الجانبية للبروتين والحمض النووي الريبي (RNA) لها تركيبات محددة من الزوايا المسموحة (أو الممنوعة). بالنسبة لزوايا ثنائي السطوح للهيكل الأساسي للبروتين (φ، ψ)، فقد تمت معالجتها بواسطة مخطط راماشاندران الشهير ، بينما بالنسبة لزوايا ثنائي السطوح للسلاسل الجانبية (χ)، ينبغي الرجوع إلى مكتبة دنبراك للروتامرات المعتمدة على الهيكل الأساسي . ^{[ 20 ]}

على الرغم من أن بنى الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) عادةً ما تكون قصيرة العمر ومفردة السلسلة، إلا أن هناك وفرة من الحمض النووي الريبوزي غير المشفر (RNA) ذي الطي الثانوي والثالثي المختلف (مثل الحمض النووي الريبوزي الناقل tRNA والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي rRNA)، والذي يحتوي على غالبية أزواج قواعد واتسون-كريك (WC) المتعارف عليها، بالإضافة إلى عدد كبير من أزواج القواعد غير واتسون-كريك (NWC). وتخضع هذه الأنواع من الحمض النووي الريبوزي أيضًا للتحقق البنيوي المعتاد المطبق على حلزونات الأحماض النووية. وتتمثل الممارسة القياسية في تحليل المعايير الهندسية داخل أزواج القواعد (الانتقالية: الإزاحة، الانزلاق، الارتفاع؛ الدورانية: الميل، الدوران، الالتواء) وبينها (الانتقالية: القص، التداخل، التمدد؛ الدورانية: الانبعاج، المروحة، الفتح) لتحديد ما إذا كانت ضمن النطاق أو خارجه بالنسبة لقيمها المقترحة. ^{[ 21 ] [ 22 ]} تصف هذه المعايير التوجهات النسبية للقاعدتين المزدوجتين بالنسبة لبعضهما البعض في سلسلتين (داخل السلسلة)، بالإضافة إلى توجهات زوجي القواعد المتراصين (بين السلاسل) بالنسبة لبعضهما البعض، وبالتالي، فهي تُستخدم مجتمعةً للتحقق من صحة بنى الأحماض النووية بشكل عام. ونظرًا لصغر طول حلزونات الحمض النووي الريبي (متوسط: 10-20 زوجًا قاعديًا)، فقد وُجد أن استخدام جهد السطح الكهروستاتيكي كمعيار للتحقق ^{[ 23 ] مفيد، لا سيما لأغراض النمذجة.}

التعبئة والكهرباء الساكنة: البروتينات الكروية

بالنسبة للبروتينات الكروية، ثبت أن التراص الذري الداخلي (الناجم عن تفاعلات محلية قصيرة المدى) للسلاسل الجانبية ^{[ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]} يُعدّ عاملاً محورياً في استقرار بنية البروتين. من جهة أخرى، ثبت أيضاً أن التناغم الكهروستاتيكي (غير المحلي، طويل المدى) للبنية الكلية ^{[ 28 ]} ضروري لاستقرارها. تشمل شذوذات التراص التداخلات الفراغية ^{[ 29 ]} ، والتلامسات القصيرة ^{[ 27 ]} ، والثقوب ^{[ 30 ]} ، والتجاويف ^{[ 31 ]،} بينما يشير عدم التناغم الكهروستاتيكي ^{[ 28 ] [ 32 ]} إلى عدم توازن الشحنات الجزئية في لب البروتين (وهو أمر ذو أهمية خاصة للبنى الداخلية المصممة للبروتينات). بينما تحدد درجة التصادم في Molprobity التصادمات الفراغية بدقة عالية جدًا، فإن مخطط التكامل يجمع بين شذوذ التعبئة وعدم التوازن الكهروستاتيكي للسلاسل الجانبية وإشارات لكليهما أو أحدهما.

الكربوهيدرات

تُشكّل الطبيعة المتفرعة والحلقية للكربوهيدرات تحديات خاصة لأدوات التحقق من صحة البنية. ^{[ 35 ]} عند دقة أعلى، يُمكن تحديد تسلسل/بنية السكريات قليلة الوحدات والسكريات المتعددة، سواءً كتعديلات تساهمية أو كروابط. مع ذلك، عند دقة أقل (عادةً أقل من 2.0 أنغستروم)، يجب أن تتطابق التسلسلات/البنى إما مع البنى المعروفة، أو أن تدعمها تقنيات تكميلية مثل مطياف الكتلة. ^{[ 36 ]} كذلك، تتميز السكريات الأحادية بتفضيلات بنيوية واضحة (توجد الحلقات المشبعة عادةً في بنيات الكرسي)، ^{[ 37 ]} لكن الأخطاء التي تحدث أثناء بناء النموذج و/أو تحسينه (مثل خطأ في كيرالية الرابطة أو المسافة، أو اختيار نموذج خاطئ - انظر ^{[ 38 ]} للاطلاع على توصيات بشأن بناء نموذج الكربوهيدرات وتحسينه، و ^{[ 39 ] و [ 40 ] و[ 41 ]} للاطلاع على مراجعات حول الأخطاء العامة في بنى الكربوهيدرات) قد تُخرج نماذجها الذرية من حالة الطاقة المنخفضة الأكثر احتمالاً. حوالي 20% من هياكل الكربوهيدرات المودعة تكون في هيئة ذات طاقة أعلى لا تبررها البيانات الهيكلية (المقاسة باستخدام معامل الارتباط في الفضاء الحقيقي). ^{[ 42 ]}

تتوفر العديد من خدمات التحقق من صحة الكربوهيدرات على موقع glycosciences.de (بما في ذلك التحقق من التسمية والروابط باستخدام pdb-care ، ^{[ 43 ]} والتحقق المتبادل باستخدام بيانات قياس الطيف الكتلي من خلال GlycanBuilder)، بينما تُوزّع حزمة CCP4 حاليًا برنامج Privateer ، ^{[ 33 ]} وهو أداة مُدمجة في عملية بناء النموذج وتحسينه. يستطيع Privateer التحقق من الكيمياء الفراغية والموضعية، وتكوين الحلقة وتجعدها، والتواءات الروابط، والارتباط في الفضاء الحقيقي مقابل كثافة الحذف الموجبة، مما يُولّد قيود التواء غير دورية على روابط الحلقة، والتي يُمكن استخدامها بواسطة أي برنامج تحسين للحفاظ على أدنى طاقة ممكنة لتكوين السكريات الأحادية. ^{[ 33 ]}

يُنشئ برنامج Privateer أيضًا مخططات SVG ثنائية الأبعاد قابلة للتوسيع وفقًا لتسمية الرموز القياسية لكتاب Essentials of Glycobiology ^{[ 34 ]} ، والتي تحتوي على جميع معلومات التحقق كشرح توضيحي (انظر الشكل). هذه الوظيفة مُدمجة حاليًا في برامج CCP4 الأخرى، مثل برنامج الرسومات الجزيئية CCP4mg (من خلال تمثيل Glycoblocks ثلاثي الأبعاد ^{[ 44 ]} ، والذي يتوافق مع تسمية الرموز القياسية ^{[ 34 ]} )، وواجهة المستخدم الرسومية للمجموعة، CCP4i2.

يمثل المجهر الإلكتروني فائق البرودة تحديات خاصة لبناة النماذج حيث أن كثافة الإلكترون المرصودة غالباً ما تكون غير كافية لحل الذرات الفردية، مما يؤدي إلى زيادة احتمالية حدوث الأخطاء.

يمكن استخدام أدوات التحقق القائمة على الهندسة، المشابهة لتلك المستخدمة في علم البلورات بالأشعة السينية، لتسليط الضوء على خيارات النمذجة غير المنطقية وتوجيه مصمم النماذج نحو هياكل أقرب إلى البنية الأصلية. وتُعدّ طريقة CaBLAM، التي تستخدم ذرات Cα فقط، ^{[ 48 ]} مناسبة للهياكل منخفضة الدقة المُستخرجة من المجهر الإلكتروني فائق البرودة. ^{[ 49 ]}

تم وضع طريقة لحساب خريطة كثافة الفرق في المجهر الإلكتروني فائق البرودة (cyro-EM). ^{[ 50 ] [ 51 ]} كما يتوفر التحقق المتبادل باستخدام خريطة "حرة"، وهو ما يُشابه استخدام عامل R الحر. ^{[ 52 ] [ 53 ]} تشمل الطرق الأخرى للتحقق من ملاءمة النموذج للخريطة معاملات الارتباط، وFSC للنموذج والخريطة، ^{[ 54 ]} وخرائط الثقة، وCryoEF (التحقق من انحياز التوجيه)، وTEMPy SMOC. ^{[ 51 ]}

يُعدّ تشتت الأشعة السينية بزوايا صغيرة (SAXS) مجالًا سريع النمو في تحديد البنية، سواءً كمصدر لبنية ثلاثية الأبعاد تقريبية للحالات الأولية أو المعقدة، أو كمكوّن من مكونات تحديد البنية باستخدام الطرق الهجينة عند دمجها مع معلومات الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو المجهر الإلكتروني (EM) أو علم البلورات أو الربط المتشابك أو المعلومات الحاسوبية. ويُبدى اهتمام كبير بتطوير معايير موثوقة للتحقق من صحة تفسير بيانات SAXS وجودة النماذج الناتجة، إلا أنه لا توجد حتى الآن طرق معتمدة للاستخدام العام. ومن بين الخطوات الثلاث الحديثة في هذا الاتجاه: إنشاء لجنة فريق عمل التحقق من صحة تشتت الأشعة السينية بزوايا صغيرة من قِبل بنك بيانات البروتين العالمي وتقريرها الأولي ^{[ 55 ]،} ومجموعة من المعايير المقترحة لإدراج البيانات في المنشورات ^{[ 56 ]} ، واقتراح أولي لمعايير مستمدة إحصائيًا للتقييم الآلي للجودة ^{[ 57 ] .}

يصعب إجراء تقييم ذي مغزى لنموذج جزيئي كبير فردي، قائم على الحسابات الحاسوبية فقط، في غياب البيانات التجريبية الخاصة بهذا الجزيء، لأن النموذج ذو أفضل هندسة وأفضل درجة توافقية قد لا يكون الأقرب إلى الإجابة الصحيحة. ولذلك، ينصب التركيز في تقييم النماذج الحاسوبية على تقييم الأساليب المستخدمة. ولتجنب التحيز والتفكير التمني، نُظمت مسابقات تنبؤ مزدوجة التعمية، ومن أبرزها (التي تُعقد كل عامين منذ عام 1994) مسابقة CASP (التقييم النقدي لتوقع البنية) لتقييم توقعات بنية البروتين ثلاثية الأبعاد للهياكل البلورية أو هياكل الرنين المغناطيسي النووي التي تم حلها حديثًا ، والتي تُحفظ سرية حتى نهاية المسابقة المعنية. ^{[ 58 ]} المعيار الرئيسي لتقييم CASP هو درجة مرجحة تُسمى GDT-TS لمطابقة مواقع ألفا بين النماذج المتوقعة والتجريبية. ^{[ 59 ]}

• قائمة بالهياكل البلورية الجزيئية الكبيرة ذات الأهمية البيوفيزيائية

• التنبؤ الحسابي
  • الصفحة الرئيسية لتجارب CASP
  • التحقق من صحة النموذج في ياسارا
• التحقق من صحة الهيكل للأغراض العامة
  • موقع التحقق/الإيداع ( إصدار wwPDB )
  • خدمة الويب MolProbity (تحتوي على ميزات خاصة بتقنية الرنين المغناطيسي النووي)
  • تقرير قاعدة البيانات (قاعدة بيانات التحقق من صحة بنية البروتين
  • برنامج What_Check، مؤرشف بتاريخ 1 مايو 2011 في أرشيف الإنترنت (Wayback Machine) .
  • برنامج ProCheck
  • مخطط التكامل
  • pdb-care (التحقق من صحة الكربوهيدرات)
  • برايفتير (التحقق من صحة الكربوهيدرات)
  • OOPS2، جزء من مصنع برمجيات أوبسالا
  • خدمة الويب ProSA
  • تحليل ملف تعريف ثلاثي الأبعاد من Verify
  • NUPARM (التحقق من صحة الأحماض النووية)
  • RNAhelix (التحقق من صحة الحمض النووي الريبي)
• الأشعة السينية
  • تمت أرشفة EDS (خادم كثافة الإلكترون) في 2017-07-02 على Wayback Machine ^{[ 1 ]}
  • برنامج Coot - برنامج نمذجة (يتضمن التحقق من الصحة)^{[ 2 ]}
  • PDB-REDO - تحسين نموذج الأشعة السينية: إعادة بناء وتحسين جميع نماذج PDB باستخدام أحدث التقنيات ^{[ 3 ]}
  • برنامج PROSESS - مجموعة أدوات وخادم تقييم بنية البروتين
  • حل المشكلة بالوكالة ، ResProx - حل مشكلة نموذج البروتين بالوكالة
  • فادار - تقرير الحجم والمساحة والزاوية ثنائية السطوح
• الرنين النووي المغناطيسي
  • برنامج CING (الواجهة المشتركة لتوليد بنية الرنين النووي المغناطيسي)
  • ProCheck - فحص الجودة الكيميائية الفراغية للأشعة السينية والرنين النووي المغناطيسي ^{[ 4 ]}
  • برنامج وخادم TALOS+ (خادم للتنبؤ بزوايا الالتواء في العمود الفقري للبروتين من خلال الإزاحة الكيميائية)
  • فادار - تقرير الحجم والمساحة والزاوية ثنائية السطوح
  • برنامج PROSESS - مجموعة أدوات وخادم تقييم بنية البروتين
  • ResProx - حل نموذج البروتين بالوكالة
• المجهر الإلكتروني فائق البرودة
  • بنك بيانات الكهرومغناطيسية، لإيداع خرائط الكهرومغناطيسية
  • قاعدة بيانات EMDB في قاعدة بيانات PDB، معلومات حول تنزيل الخرائط عبر بروتوكول نقل الملفات (FTP).
  • يقوم مشروع CERES بإعادة بناء (ونأمل أن يحسن) نماذج Cyro-EM باستخدام أحدث إصدار من PHENIX ^{[ 5 ].}

• كافاناغ جيه، فيربراذر دبليو جيه، بالمر إيه جي، سكيلتون إن جيه (2006). مطيافية الرنين النووي المغناطيسي للبروتين: المبادئ والتطبيق (الطبعة الثانية  ). دار النشر الأكاديمية. رقم ISBN 978-0-12-164491-8.
• روب ب (2009). علم البلورات الجزيئية الحيوية: المبادئ والممارسة والتطبيق على البيولوجيا التركيبية . جارلاند ساينس. ISBN 978-0815340812.