تيلينغ (علم الأحياء الجزيئي)

📅 آخر تحديث: ٢٣ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٣ يوليو ٢٠٢٦
الموسوعة الحرة

تقنية TILLING ( استهداف الآفات الموضعية المستحثة في الجينوم ) هي طريقة في البيولوجيا الجزيئية تسمح بتحديد الطفرات في جين معين بشكل مباشر . طُورت هذه التقنية عام 2000 باستخدام نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا كنموذج ، ثم توسعت لتشمل استخدامات ومنهجيات أخرى على يد مجموعة صغيرة من العلماء، من بينهم لوكا كوماي . ومنذ ذلك الحين، استُخدمت تقنية TILLING كطريقة في علم الوراثة العكسي في كائنات حية أخرى مثل سمك الزيبرا ، والذرة ، والقمح ، والأرز ، وفول الصويا ، والطماطم ، والخس .

ملخص

تجمع هذه الطريقة بين تقنية قياسية وفعالة للطفرات باستخدام مُطَفِّر كيميائي مثل إيثيل ميثان سلفونات (EMS) وتقنية فحص الحمض النووي الحساسة التي تحدد الطفرات أحادية القاعدة (وتسمى أيضًا الطفرات النقطية) في الجين المستهدف. تعتمد طريقة TILLING على تكوين جزيئات الحمض النووي غير المتجانسة ، والتي تتشكل عند تضخيم أليلات متعددة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ثم تسخينها وتبريدها ببطء. تتشكل " فقاعة " عند عدم تطابق سلسلتي الحمض النووي، والتي يتم شطرها بعد ذلك بواسطة نوكلياز أحادي السلسلة . ثم يتم فصل النواتج حسب الحجم على عدة منصات مختلفة (انظر أدناه).

قد يكون عدم التطابق ناتجًا عن طفرة مستحثة، أو تباين الزيجوت داخل الفرد، أو اختلاف طبيعي بين الأفراد.

EcoTILLING [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] هي طريقة تستخدم تقنيات TILLING للبحث عن الطفرات الطبيعية لدى الأفراد، وعادةً ما تُستخدم في تحليل علم الوراثة السكانية. أما DEcoTILLING [ 5 ] فهي تعديل لتقنيتي TILLING وEcoTILLING، وتستخدم طريقة غير مكلفة لتحديد الشظايا. منذ ظهور تقنيات التسلسل من الجيل التالي (NGS) ، تم تطوير تقنية TILLING-by-sequencing [ 6 ] بالاعتماد على تسلسل Illumina للجينات المستهدفة المُضخّمة من قوالب مُجمّعة متعددة الأبعاد لتحديد التغيرات المحتملة في النوكليوتيدات المفردة.

إنزيمات قطع السلسلة المفردة

توجد مصادر متعددة للنيوكليازات أحادية السلسلة. كان أول إنزيم يُستخدم على نطاق واسع هو نيوكلياز الفاصوليا الخضراء ، ولكن تبين أن هذا الإنزيم يتميز بنشاط غير نوعي عالٍ، ويعمل فقط في بيئة حمضية منخفضة، مما قد يؤدي إلى تحلل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والبادئات الموسومة بالصبغات. كان المصدر الأصلي للنيوكلياز أحادي السلسلة هو CEL1، أو مستخلص عصير الكرفس (CJE)، ولكن ظهرت منتجات أخرى في السوق، بما في ذلك إنزيمات SNiPerase من Frontier Genomics، والتي تم تحسينها للاستخدام على منصات تستخدم نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الموسومة وغير الموسومة (انظر القسم التالي). قامت شركة Transgenomic بعزل بروتين النيوكلياز أحادي السلسلة وتبيعه كشكل مُعاد التركيب. تتمثل ميزة الشكل المُعاد التركيب في أنه، على عكس مخاليط الإنزيمات، لا يحتوي على نشاط نيوكلياز غير نوعي، والذي قد يؤدي إلى تحلل الصبغات الموجودة على بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل. أما عيبه فهو ارتفاع تكلفته بشكل ملحوظ.

فصل المنتجات المنقسمة

استخدمت الورقة البحثية الأولى التي وصفت تقنية TILLING تقنية HPLC لتحديد الطفرات (McCallum et al., 2000a). وتم تطوير هذه الطريقة لزيادة الإنتاجية باستخدام إنزيم التقييد Cel-I مع نظام LICOR القائم على الهلام لتحديد الطفرات (Colbert et al., 2001). ومن مزايا هذا النظام سهولة تأكيد مواقع الطفرات وتمييزها عن التشويش، وذلك بفضل إمكانية استخدام أصباغ ملونة مختلفة للبادئات الأمامية والخلفية. بعد فصل نواتج القطع على الهلام، يمكن عرضها في قنوات منفصلة، ​​وكما هو الحال في تقنية RFLP، يجب أن يكون مجموع أحجام القطع في كل مسار ضمن كل قناة مساويًا لطول المنتج الكامل. ومن مزايا نظام LICOR فصل القطع الكبيرة (حوالي 2 كيلوبايت)، والإنتاجية العالية للعينات (تحميل 96 عينة على أمشاط ورقية)، وبرنامج مجاني لتحديد الطفرات (GelBuddy). أما عيوب نظام LICOR فتتمثل في ضرورة صب الهلامات المسطحة وطول مدة التشغيل (حوالي 4 ساعات). يتم الآن استخدام طرق TILLING و EcoTILLING على أنظمة الشعيرات الدموية من شركات Advanced Analytical Technologies و ABI و Beckman.

يمكن استخدام عدة أنظمة لفصل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) غير الموسومة بالأصباغ. تفصل أنظمة الفصل الكهربائي البسيطة على هلام الأغاروز نواتج التحلل بتكلفة منخفضة وباستخدام معدات المختبر القياسية. وقد استُخدمت هذه التقنية لاكتشاف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) في سمك السلمون الأحمر، وأُطلق عليها اسم DEcoTILLING. يتمثل عيب هذا النظام في انخفاض الدقة مقارنةً بأنظمة البولي أكريلاميد. تبيع شركة Elchrom Scientific هلامات Spreadex الجاهزة، والتي تتميز بإنتاجية عالية وحساسية أكبر من هلامات البولي أكريلاميد القياسية. كما تبيع شركة Advanced Analytical Technologies Inc نظام AdvanCE FS96 dsDNA الفلوري، وهو نظام فصل كهربائي شعيري مكون من 96 شعيرة، يتميز بعدة مزايا مقارنةً بالطرق التقليدية؛ منها القدرة على فصل أجزاء كبيرة (تصل إلى 40 كيلوبايت)، وعدم الحاجة إلى إزالة الأملاح أو الترسيب، وقصر مدة التشغيل (حوالي 30 دقيقة)، وحساسية تصل إلى 5 بيكوغرام/ميكرولتر، وعدم الحاجة إلى بادئات موسومة بالفلورسنت.

مراكز تبليط

توجد العديد من مراكز TILLING حول العالم التي تركز على الأنواع ذات الأهمية الزراعية:

  • رايس – جامعة كاليفورنيا في ديفيس (الولايات المتحدة الأمريكية)
  • مايز – جامعة بوردو (الولايات المتحدة الأمريكية)
  • Brassica napus – جامعة كولومبيا البريطانية (كاليفورنيا)
  • Brassica rapa – مركز جون إينز (المملكة المتحدة)
  • نبات الرشاد - مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان
  • فول الصويا – جامعة جنوب إلينوي (الولايات المتحدة الأمريكية)
  • اللوتس والبرسيم - مركز جون إينز (المملكة المتحدة)]
  • القمح – جامعة كاليفورنيا في ديفيس (الولايات المتحدة الأمريكية)
  • البازلاء، الطماطم - المعهد الوطني للبحوث الزراعية (فرنسا)
  • الطماطم - RTGR، جامعة حيدر أباد (الهند)

مراجع

  1. ↑ كوماي، ل .؛ يونغ، ك.؛ تيل، ب. ج.؛ رينولدز، ش. هـ.؛ غرين، إ. أ.؛ كودومو، س. أ.؛ إينز، ل. س.؛ جونسون، ج. إ.؛ بيرتنر، س.؛ أودن، أ. ر.؛ هينيكوف، س. (2004). "الاكتشاف الفعال لتعدد أشكال الحمض النووي في التجمعات الطبيعية بواسطة تقنية Ecotilling". مجلة النبات . 37 (5): 778-786 . doi : 10.1111/j.0960-7412.2003.01999.x . PMID 14871304 . 
  2. ↑ جيلكريست، إي جيه؛ هوغن، جي دبليو؛ يينغ، سي سي؛ أوتو، إس بي؛ تشوانغ، جيه؛ تشيونغ، دي؛ هامبرغر، بي؛ أبو ترابي، إف؛ كالينياك، تي؛ جونسون، لي؛ بولمان، جيه؛ إليس، بي إي؛ دوغلاس، سي جيه؛ كرونك، كيو سي بي (2006). "استخدام تقنية Ecotilling كأداة فعالة لاكتشاف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) لدراسة التباين الجيني في التجمعات البرية لنبات الحور الأسود (Populus trichocarpa)". علم البيئة الجزيئية . 15 (5): 1367-1378 . Bibcode : 2006MolEc..15.1367G . doi : 10.1111/j.1365-294X.2006.02885.x . PMID 16626459 . S2CID 16198260 .  
  3. ↑ ميلهيد، ن.؛ كيوفسكا، ز.؛ باكيس، ج.؛ بورين، ك.؛ راسموسن، س.ك.؛ جاهور، أ. (2006). "تقنية EcoTILLING لتحديد التباين الأليلي في جينات مقاومة البياض الدقيقي mlo وMla في الشعير" (ملف PDF) . تربية النبات . 125 (5): 461-467 . Bibcode : 2006PBree.125..461M . doi : 10.1111/j.1439-0523.2006.01226.x . S2CID 62901355 . 
  4. ^ نييتو، سي. بيرون، F .؛ دالمايس، م.؛ ماركو، قوات التحالف؛ موريونس، E.؛ غوميز غويلامون، ML؛ ترونيجر، V.؛ غوميز، ب. جارسيا ماس، J .؛ أراندا، ماساتشوستس؛ بن دهمان، أ. (2007). "EcoTILLING لتحديد المتغيرات الأليلية للبطيخ eIF4E، وهو العامل الذي يتحكم في قابلية الإصابة بالفيروسات" . بي إم سي بيولوجيا النبات . 7 (1) 34. بيب كود : 2007BMCPB...7...34N . دوى : 10.1186/1471-2229-7-34 . بمك 1914064 . بميد 17584936 .  
  5. ↑ غارفين، إم آر؛ غاريت، إيه جيه (2007). "DEco-TILLING: طريقة غير مكلفة لاكتشاف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة تقلل من تحيز التحقق". ملاحظات علم البيئة الجزيئية . 7 (5): 735-746 . doi : 10.1111/j.1471-8286.2007.01767.x .
  6. ↑ تساي، هيلين؛ هاول، تايسون؛ نيتشر، ريبيكا؛ ميسيريان، فيكتور؛ واتسون، برايان؛ نغو، كاثي جيه؛ ليبرمان، ميريك؛ فاس، جوزيف؛ أواوي، كريستوبال؛ تران، روبرت كيه؛ خان، آصف علي؛ فيلكوف، فلاديمير؛ تاي، توماس إتش؛ دوبكوفسكي، خورخي؛ كوماي، لوكا (2011). "اكتشاف الطفرات النادرة في التجمعات السكانية: تقنية TILLING عن طريق التسلسل" . علم وظائف النبات . 156 (3): 1257-1268 . doi : 10.1104/pp.110.169748 . PMC 3135940. PMID 21531898 .  

الأدبيات العلمية