التسلسل المتوازي الضخم

📅 آخر تحديث: ٢٨ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٨ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 1 صور
الموسوعة الحرة

التسلسل المتوازي الضخم ( MPS ) هو أحد أساليب التسلسل عالية الإنتاجية للحمض النووي، ويعتمد على مفهوم المعالجة المتوازية الضخمة ؛ ويُعرف أيضًا باسم تسلسل الجيل التالي ( NGS ) أو تسلسل الجيل الثاني . ظهرت بعض هذه التقنيات بين عامي 1993 و1998 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] ، وأصبحت متاحة تجاريًا منذ عام 2005. تستخدم هذه التقنيات منصات مصغرة ومتوازية لتسلسل ما بين مليون إلى 43 مليار قراءة قصيرة (من 50 إلى 400 قاعدة لكل قراءة) في كل دورة تشغيل للجهاز.

تختلف العديد من منصات التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS) في تصميماتها الهندسية وكيمياء التسلسل. وتشترك جميعها في النموذج التقني للتسلسل المتوازي واسع النطاق عبر قوالب الحمض النووي المُضخّمة استنساخياً والمفصولة مكانياً، أو جزيئات الحمض النووي المفردة في خلية تدفق . يختلف هذا التصميم اختلافاً كبيراً عن تصميم تسلسل سانجر - المعروف أيضاً بالتسلسل الشعيري أو تسلسل الجيل الأول - والذي يعتمد على الفصل الكهربائي لمنتجات إنهاء السلسلة الناتجة في تفاعلات التسلسل الفردية. [ 6 ] تتيح هذه المنهجية إمكانية إتمام التسلسل على نطاق أوسع. [ 7 ]

تاريخ

في تسعينيات القرن الماضي، هيمنت شركة "أبلايد بيوسيستمز" على تقنية تسلسل الحمض النووي بفضل أجهزة تسلسل سانجر الآلية بتقنية الفصل الكهربائي الشعيري . إلا أن مطلع الألفية الجديدة شهد دخول العديد من الشركات الجديدة إلى السوق، مدفوعةً بهدف خفض تكاليف تسلسل الجينوم إلى أقل من 1000 دولار أمريكي، وذلك في أعقاب الحماس الذي أثاره مشروع الجينوم البشري . [ 8 ] وقد طُوّرت العديد من هذه الأساليب الجديدة بدعم من معاهد الصحة الوطنية (NIH) ضمن برنامج "تطوير التكنولوجيا لجينوم الألف دولار"، [ 9 ] الذي أُطلق خلال فترة تولي فرانسيس كولينز منصب مدير المعهد الوطني لأبحاث الجينوم البشري . [ 10 ]

استندت أجهزة التسلسل من الجيل التالي الأولى إلى تقنية التسلسل الناري ، التي طورتها شركة Pyrosequencing AB في الأصل، ثم قامت شركة 454 Life Sciences بتسويقها لاحقًا . في عام 2003، أطلقت 454 Life Sciences جهاز GS20، وهو أول جهاز تسلسل الحمض النووي بتقنية التسلسل من الجيل التالي. وفر هذا النظام قراءات بطول يتراوح بين 400 و500 زوج قاعدي بدقة 99%، مما مكّن من تسلسل حوالي 25 مليون قاعدة في عملية تستغرق أربع ساعات بتكاليف أقل بكثير مقارنةً بتقنية سانجر. [ 11 ] مثّلت أجهزة التسلسل التي طورتها 454 نقلة نوعية في هذا المجال، إذ مكّنت من التوازي الجماعي لتفاعلات التسلسل، مما زاد بشكل كبير من كمية الحمض النووي المُتسلسل في كل عملية، وجعل 454 Life Sciences أول شركة تحقق نجاحًا كبيرًا في تقنية التسلسل من الجيل التالي التجارية. [ 12 ]

في عام 2003 أيضًا، بدأت شركة Solexa بتطوير طريقة منافسة تُعرف باسم التسلسل بالتخليق (SBS) . وفي عام 2004، استحوذت Solexa على تقنية تسلسل المستعمرات (تضخيم الجسر) من شركة Manteia ، مما أدى إلى إنتاج شظايا DNA متجمعة بكثافة ("polonies") مثبتة على خلايا التدفق. ولّدت هذه التجمعات الكثيفة إشارات فلورية أقوى، مما حسّن الدقة وخفّض التكاليف البصرية. وفي عام 2005، دمجت Solexa بوليميراز DNA مُهندسًا ونوكليوتيدات إنهاء قابلة للعكس، مما سمح بتكرار دورات التسلسل والتصوير. أُطلق أول جهاز تسلسل تجاري قائم على هذه التقنية، وهو Genome Analyzer، في عام 2006، موفرًا قراءات أقصر (حوالي 35 زوجًا قاعديًا) ولكن إنتاجية أعلى (تصل إلى 1 جيجا بايت لكل تشغيل) وقدرة على التسلسل المزدوج، حيث يتم تسلسل طرفي شظية DNA. [ 13 ]

في عام 2007، استحوذت شركة روش على شركة 454 لايف ساينسز [ 14 ] ، واستحوذت شركة إلومينا على شركة سوليكسا [ 15 ] . وفي العام نفسه، طرحت شركة أبلايد بيوسيستمز منصة SOLiD ، وهي منصة تسلسل تعتمد على الربط [ 16 ] . إلا أن SOLiD واجهت مشاكل في تسلسل المناطق المتناظرة [ 17 ] ، ما أدى في النهاية إلى إيقافها [ 8 ] . وفي عام 2011، قدمت شركة أيون تورنت بديلاً آخر، وهو قياس تغيرات الرقم الهيدروجيني ( pH ) أثناء دمج النيوكليوتيدات باستخدام مستشعرات تعتمد على أشباه الموصلات [ 18 ] . أنتجت أنظمة أيون تورنت قراءات سريعة بطول 100 زوج قاعدي، لكنها واجهت صعوبة متكررة في تسلسل المتجانسات بدقة [ 19 ] ، ما أدى في النهاية إلى التخلي عنها [ 8 ] .

بسبب محدودية الطرق المنافسة، هيمنت تقنية SBS من Illumina في نهاية المطاف على سوق التسلسل الجيني. [ 8 ] وبحلول عام 2012، لم تتحقق التوقعات بأن تستحوذ 454 على حصة كبيرة من سوق التسلسل الجيني، وأصبح يُنظر إلى استحواذ Roche عليها عام 2007 على أنه أداء ضعيف؛ وفي العام نفسه، قامت Roche بمحاولة فاشلة للاستحواذ على Illumina. [ 14 ] وفي أكتوبر 2013، أعلنت Roche أنها ستغلق 454، وستتوقف عن دعم المنصة بحلول منتصف عام 2016. [ 20 ] وبحلول عام 2014، سيطرت Illumina على ما يقرب من 70% من مبيعات أجهزة تسلسل الحمض النووي، وأنتجت أكثر من 90% من بيانات التسلسل. [ 21 ] [ 22 ] وفي ذلك العام، طرحت Illumina منصة HiSeq X Ten، مما زاد الإنتاجية بشكل كبير، وحققت الهدف الذي طال انتظاره والمتمثل في تسلسل الجينوم البشري بتكلفة تقارب 1000 دولار أمريكي لكل جينوم. [ 23 ] تجاوزت شركة Illumina هذا الإنجاز في عام 2017 بإصدار NovaSeq، وهو نظام قادر على توليد أكثر من 3000 جيجابت في الثانية لكل عملية تشغيل. [ 8 ]

شجع النمو المستمر في الطلب على بيانات التسلسل، إلى جانب انتهاء صلاحية العديد من براءات اختراع Illumina الرئيسية في عام 2023، ظهور موجة من المنافسين في مجال تسلسل القراءة القصيرة، حيث يقدم كل منهم تقنيات كيميائية وتصاميم خلايا تدفق ومستويات إنتاجية وهياكل تكلفة مميزة. [ 24 ] وبحلول أوائل العقد الثالث من القرن الحادي والعشرين، ظلت منصات التسلسل بالتخليق من Illumina مهيمنة؛ وقدّر تقرير عام 2023 أن أكثر من 90% من بيانات التسلسل في العالم عام 2022 قد تم إنتاجها باستخدام أجهزة Illumina. [ 25 ] ومن بين المنافسين شركة MGI Tech ، التي تستخدم منصات DNBSEQ الخاصة بها كرات نانوية من الحمض النووي بدلاً من تضخيم الجسر على غرار Illumina، وشركة Ultima Genomics ، التي طورت منصة إنتاجية واسعة النطاق باستخدام خلية تدفق قرصية دوارة. [ 25 ] قدمت شركة Singular Genomics منصة التسلسل G4 في أواخر عام 2021، وتبعتها شركة Element Biosciences بالإعلان عن تسلسل AVITI في مارس 2022، ودخلت شركة PacBio لاحقًا مجال القراءة القصيرة من خلال منصة Onso المكتبية، التي تم الكشف عنها في أكتوبر 2022. [ 26 ]

بدأت سلسلة NovaSeq X من شركة Illumina بالشحن في عام 2023، وهي تستخدم خلية تدفق مُعاد تصميمها، وكيمياء تسلسل مُحدثة، وبصريات مُطورة. وذكرت Illumina أن النظام قادر على توليد ما يصل إلى ثلاثة أضعاف كمية البيانات لكل تشغيل مقارنةً بجهاز NovaSeq 6000 السابق، وخفض تكلفة تسلسل الجينوم البشري إلى حوالي 200 دولار أمريكي عند الاستخدام الكامل. [ 25 ]

كان انخراط شركة PacBio في سوق القراءة القصيرة قصير الأجل: فبعد إطلاق منصة Onso للقراءة القصيرة في عام 2023، أكملت الشركة بيع بعض الملكية الفكرية والأصول الأخرى المتعلقة بتقنية تسلسل القراءة القصيرة الخاصة بها إلى شركة Illumina في يناير 2026. [ 27 ] [ 28 ]

منصات التسلسل الجيني من الجيل التالي

تُجرى عملية تسلسل الحمض النووي باستخدام منصات التسلسل من الجيل التالي (NGS) المتوفرة تجاريًا عادةً وفقًا للخطوات التالية: أولًا، تُنشأ مكتبات تسلسل الحمض النووي عن طريق التضخيم الاستنساخي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في المختبر . ثانيًا، يُسلسل الحمض النووي عن طريق التخليق ، بحيث يُحدد تسلسل الحمض النووي بإضافة النيوكليوتيدات إلى السلسلة المكملة بدلًا من استخدام تفاعلات إنهاء السلسلة. ثالثًا، تُسلسل قوالب الحمض النووي المُضخمة والمفصولة مكانيًا في وقت واحد وبشكل متوازٍ للغاية دون الحاجة إلى فصلها فيزيائيًا. تُتبع هذه الخطوات في معظم منصات NGS، ولكن كل منصة تستخدم استراتيجية مختلفة. [ 29 ]

تُنتج تقنية التسلسل المتوازي من الجيل التالي (NGS) مئات الميغابايتات إلى غيغابايتات من قراءات تسلسل النيوكليوتيدات في تشغيل واحد للجهاز. وقد مكّن هذا من زيادة هائلة في بيانات التسلسل المتاحة، وأحدث تغييرًا جذريًا في مناهج تسلسل الجينوم في العلوم الطبية الحيوية. [ 30 ] كما ساهمت تقنيات وأجهزة NGS الناشئة حديثًا في انخفاض كبير في تكلفة التسلسل، لتقترب من 500 دولار أمريكي لكل تسلسل جينومي في عام 2022. [ 31 ]

اعتبارًا من عام 2014، أصبحت منصات التسلسل المتوازي عالي الإنتاجية متاحة تجاريًا، وتلخص خصائصها في الجدول. ونظرًا للتطور السريع لتقنيات التسلسل من الجيل التالي، فإن المواصفات الفنية والأسعار في تغير مستمر.

جهاز تسلسل Illumina HiSeq 2000
منصات التسلسل الجيني من الجيل التالي
منصةإعداد القالبكيمياءأقصى طول للقراءة (بالقواعد)مدة التشغيل (بالأيام)الحد الأقصى لحجم البيانات لكل عملية تشغيل
روش 454تفاعل البوليميراز المتسلسل الاستنساخيالتسلسل الناري400‡0.420.40-0.60
GS FLX تيتانيومتفاعل البوليميراز المتسلسل الاستنساخيالتسلسل الناري400‡0.420.035
Illumina MiSeqتضخيم الجسر النسيليمُنهي الصبغة القابل للعكس2x3000.17-2.715
Illumina HiSeqتضخيم الجسر النسيليمُنهي الصبغة القابل للعكس2x1500.3-11 [ 32 ]1000 [ 33 ]
محلل الجينوم Illumina IIXتضخيم الجسر النسيليمُنهي الصبغة القابل للعكس [ 34 ] [ 35 ]2x1502-1495
شركة لايف تكنولوجيز SOLID4تفاعل البوليميراز المتسلسل الاستنساخيربط سلسلة من 8 نيوكليوتيدات قليلة [ 36 ]20-454-735-50
شركة لايف تكنولوجيز أيون بروتون [ 37 ]تفاعل البوليميراز المتسلسل الاستنساخيالنيوكليوتيدات الأصلية، الكشف عن البروتونات2000.5100
علم الجينوم الكاملكرات نانوية من الحمض النووي على شكل شبكةربط غير متسلسل من 9 نيوكليوتيدات [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ]7x10113000
هيليكوس للعلوم الحيوية، هيليسكوبجزيء واحدمُنهي الصبغة القابل للعكس35‡825
باسيفيك بيوساينسز إس إم آر تيجزيء واحدالنيوكليوتيدات الفلورية المرتبطة بالفوسفور10000 ( N50 )؛ 30000+ (الحد الأقصى) [ 41 ]0.080.5 [ 42 ]

تم تسجيل أوقات التشغيل وحجم البيانات (جيجابايت) لكل عملية تسلسل أحادية الطرف. يتضاعف وقت التشغيل وحجم البيانات تقريبًا عند إجراء تسلسل ثنائي الطرف. ‡متوسط ​​أطوال القراءة لمنصتي Roche 454 و Helicos Biosciences. [ 43 ]

طرق تحضير القوالب لتقنية التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS)

تُستخدم طريقتان في تحضير قوالب تفاعلات التسلسل الجيني عالي الإنتاجية (NGS): قوالب مُضخّمة مُستمدة من جزيئات DNA مفردة، وقوالب جزيئات DNA مفردة. بالنسبة لأنظمة التصوير التي لا تستطيع رصد أحداث التألق المفردة، يلزم تضخيم قوالب DNA. أكثر ثلاث طرق شيوعًا للتضخيم هي تفاعل البلمرة المتسلسل في المستحلب (emPCR)، وتفاعل البلمرة المتسلسل الدائري، وتفاعل البلمرة المتسلسل في الطور الصلب. يمكن أن يكون التوزيع النهائي للقوالب عشوائيًا مكانيًا أو على شبكة.

تفاعل البوليميراز المتسلسل المستحلب

في طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل في المستحلب ، تُنشأ مكتبة الحمض النووي أولًا من خلال تجزئة عشوائية للحمض النووي الجينومي. تُربط شظايا الحمض النووي أحادية السلسلة (القوالب) بسطح الخرز باستخدام محولات أو روابط، ويرتبط كل خرز بشظية حمض نووي واحدة من مكتبة الحمض النووي. يحتوي سطح الخرز على مجسات قليلة النوكليوتيدات ذات تسلسلات مكملة للمحولات التي تربط شظايا الحمض النووي. بعد ذلك، تُقسّم الخرز إلى قطرات مستحلب ماء-زيت. في مستحلب الماء-الزيت المائي، تُمثل كل قطرة تحتوي على خرزة واحدة مفاعلًا دقيقًا لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، حيث تُنتج نسخًا مُضخمة من قالب الحمض النووي الواحد. [ 44 ] [ 45 ] [ 46 ]

كرات نانوية دائرية متدحرجة مُقسّمة إلى شبكة

يتم تضخيم مجموعة من جزيئات الحمض النووي المفردة باستخدام تقنية التضخيم الدائري المتدحرج في المحلول، ثم يتم التقاطها على شبكة من النقاط أصغر من جزيئات الحمض النووي المراد تثبيتها. [ 47 ] [ 48 ] [ 49 ] [ 50 ] تستخدم تقنيات التسلسل من الجيل الثاني، مثل DNBSEQ من MGI Tech أو AVITI من Element Biosciences، هذا النهج لتحضير العينة على خلية التدفق، والتي يتم تصويرها بعد ذلك دورة تلو الأخرى.

توليد مستعمرات الحمض النووي (تضخيم الجسر)

تُثبّت البادئات الأمامية والخلفية تساهميًا بكثافة عالية على الشريحة في خلية التدفق. وتُحدد نسبة البادئات إلى القالب على الدعامة كثافة التجمعات المُضخّمة على السطح. تُعرّض خلية التدفق للكواشف اللازمة للتمديد باستخدام البوليميراز ، ويحدث التمهيد عندما "تتصل" النهاية الحرة/البعيدة لقطعة الحمض النووي المربوطة بجزيء أوليغونوكليوتيد مُكمّل على السطح. ويؤدي التمسخ والتمديد المتكرران إلى تضخيم موضعي لقطع الحمض النووي في ملايين المواقع المنفصلة عبر سطح خلية التدفق. يُنتج التضخيم في الطور الصلب ما بين 100 و200 مليون تجمع قالب مُتباعد مكانيًا، مما يوفر نهايات حرة تُهجّن معها بادئة تسلسل عالمية لبدء تفاعل التسلسل. [ 44 ] [ 45 ] تم تقديم طلب براءة اختراع لهذه التقنية عام 1997 من قِبل معهد جنيف للأبحاث الطبية الحيوية التابع لشركة جلاكسو ويلكوم (GBRI)، بواسطة باسكال ماير ، وإريك كاواشيما، ولوران فارينيلي، [ 4 ] [ 5 ] وعُرضت علنًا لأول مرة عام 1998. [ 51 ] في عام 1994، قدم كريس آدامز وستيف كرون طلب براءة اختراع لطريقة تضخيم سطحية مماثلة، ولكنها غير استنساخية، تُسمى "التضخيم الجسري" [ 3 ] والتي تم تكييفها للتضخيم الاستنساخي عام 1997 بواسطة تشيرش وميترا. [ 47 ] [ 48 ]

قوالب الجزيئات المفردة

غالبًا ما تكون البروتوكولات التي تتطلب تضخيم الحمض النووي معقدة التنفيذ، وقد تُؤدي إلى أخطاء في التسلسل. أما تحضير قوالب الجزيء الواحد فهو أبسط ولا يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، الذي قد يُسبب أخطاءً في القوالب المُضخّمة. تُظهر التسلسلات المستهدفة الغنية بالأدينين والثايمين (AT) والجوانين والسيتوزين (GC) تحيزًا في التضخيم، مما يُؤدي إلى نقص تمثيلها في محاذاة وتجميع الجينوم. عادةً ما تُثبّت قوالب الجزيء الواحد على دعامات صلبة باستخدام إحدى ثلاث طرق على الأقل. في الطريقة الأولى، تُربط جزيئات البادئات الفردية الموزعة مكانيًا تساهميًا بالدعامة الصلبة. ثم يُهجّن القالب، الذي يُحضّر بتجزئة المادة الأولية عشوائيًا إلى أحجام صغيرة (على سبيل المثال، 200-250 زوجًا قاعديًا تقريبًا) وإضافة محولات مشتركة إلى نهايات القطع، مع البادئ المُثبّت. في الطريقة الثانية، تُربط قوالب الجزيء الواحد الموزعة مكانيًا تساهميًا بالدعامة الصلبة عن طريق تحضير وتمديد قوالب أحادية السلسلة من البادئات المُثبّتة. ثم يُهجّن بادئ مشترك مع القالب. في كلا الطريقتين، يرتبط بوليميراز الحمض النووي بتكوين القالب المُهيأ المُثبّت لبدء تفاعل التسلسل الجيني عالي الإنتاجية (NGS). تستخدم شركة Helicos BioSciences كلا الطريقتين المذكورتين أعلاه. في طريقة ثالثة، تُربط جزيئات بوليميراز مفردة موزعة مكانيًا بدعامة صلبة، يرتبط بها جزيء قالب مُهيأ. تستخدم شركة Pacific Biosciences هذه الطريقة. يمكن استخدام جزيئات حمض نووي أكبر (تصل إلى عشرات الآلاف من أزواج القواعد) مع هذه التقنية، وعلى عكس الطريقتين السابقتين، يمكن استخدام الطريقة الثالثة مع طرق الوقت الحقيقي، مما ينتج عنه أطوال قراءة أطول.

أساليب التسلسل

التسلسل عن طريق التخليق

يهدف التسلسل التسلسلي بالتخليق (SBS) إلى تحديد تسلسل عينة الحمض النووي (DNA ) عن طريق الكشف عن دمج النيوكليوتيدات بواسطة بوليميراز الحمض النووي . يُستخدم بوليميراز مُهندس لتخليق نسخة من شريط مفرد من الحمض النووي، ويتم رصد دمج كل نيوكليوتيد. وُصف مبدأ التسلسل بالتخليق لأول مرة عام 1993 [ 1 ] ، ونُشرت تحسينات عليه بعد بضع سنوات [ 52 ] . تتشابه الأجزاء الرئيسية إلى حد كبير في جميع تطبيقات التسلسل التسلسلي بالتخليق، وتشمل: (1) تضخيم الحمض النووي لتعزيز الإشارة اللاحقة وربط الحمض النووي المراد تسلسله بدعامة صلبة، (2) توليد حمض نووي أحادي الشريط على الدعامة الصلبة، (3) دمج النيوكليوتيدات باستخدام بوليميراز مُهندس، و(4) الكشف عن دمج النيوكليوتيدات. ثم يتم تكرار الخطوتين 3-4 ويتم تجميع التسلسل من الإشارات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4. وقد تم استخدام مبدأ التسلسل عن طريق التركيب هذا لجميع أجهزة التسلسل المتوازية الضخمة تقريبًا، بما في ذلك 454 و PacBio و IonTorrent و Illumina و MGI .

التسلسل الناري

وُصِفَ مبدأ التسلسل الناري لأول مرة عام 1993 [ 1 ] من خلال الجمع بين دعامة صلبة وبوليميراز DNA مُهندَس يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز من 3' إلى 5' (التدقيق)، والكشف عن طريق التألق الضوئي في الوقت الحقيقي باستخدام لوسيفيراز اليراعة . وقد تم تقديم جميع المفاهيم الأساسية للتسلسل عن طريق التخليق، بما في ذلك: (1) تضخيم الحمض النووي لتعزيز الإشارة اللاحقة وربط الحمض النووي المراد تسلسله (القالب) بدعامة صلبة، (2) توليد حمض نووي أحادي السلسلة على الدعامة الصلبة، (3) دمج النيوكليوتيدات باستخدام بوليميراز مُهندَس، و(4) الكشف عن النيوكليوتيد المدمج عن طريق الكشف الضوئي في الوقت الحقيقي. في مقال لاحق، [ 2 ] تم تطوير المفهوم بشكل أكبر وفي عام 1998، تم نشر مقال [ 52 ] أظهر فيه المؤلفون أنه يمكن إزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة باستخدام إنزيم رابع ( أبيراز ) مما يسمح بإجراء التسلسل عن طريق التخليق دون الحاجة إلى غسل النيوكليوتيدات غير المدمجة.

التسلسل باستخدام كيمياء الإنهاء العكسي

تعتمد هذه الطريقة على استخدام نيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) مرتبطة بمُنهيات قابلة للعكس، وذلك ضمن أسلوب دوري يتضمن دمج النيوكليوتيدات، والتصوير الفلوري، والقطع. يتم تصوير مُنهي مُوسَم بالفلورة عند إضافة كل نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات، ثم يُقطع للسماح بدمج القاعدة التالية. تُحجب هذه النيوكليوتيدات كيميائيًا بحيث يكون كل دمج حدثًا فريدًا. تلي كل خطوة دمج قاعدة خطوة تصوير، ثم تُزال المجموعة المحجوبة كيميائيًا لتحضير كل خيط للدمج التالي بواسطة بوليميراز الحمض النووي. تستمر هذه السلسلة من الخطوات لعدد محدد من الدورات، وفقًا لإعدادات الجهاز التي يُحددها المستخدم. صُممت مجموعات الحجب 3' في الأصل إما للانعكاس الإنزيمي [ 53 ] أو الكيميائي [ 34 ] [ 35 ]. وقد شكلت الطريقة الكيميائية أساسًا لأجهزة Solexa وIllumina. يمكن أن يكون التسلسل باستخدام كيمياء الإنهاء العكسي دورة رباعية الألوان كما هو الحال في Illumina/Solexa، أو دورة أحادية اللون كما هو الحال في Helicos BioSciences. استخدمت Helicos BioSciences "المنهيات الافتراضية"، وهي منتهيات غير محجوبة مع نظير نيوكليوزيد ثانٍ يعمل كمثبط. تحتوي هذه المنهيات على التعديلات المناسبة لمجموعات الإنهاء أو التثبيط بحيث يتم إنهاء تخليق الحمض النووي بعد إضافة قاعدة واحدة. [ 45 ] [ 54 ] [ 55 ]

التسلسل عن طريق الربط بوساطة إنزيمات الليغاز

في هذه الطريقة، لا يتم إجراء تفاعل إطالة التسلسل بواسطة البوليميراز، بل بواسطة إنزيم ربط الحمض النووي ( DNA ligase) ومجسات مشفرة إما بقاعدة واحدة أو بقاعدتين. في أبسط صورها، يتهجن مجس موسوم بصبغة فلورية مع تسلسله المكمل المجاور للقالب المُهيأ. ثم يُضاف إنزيم ربط الحمض النووي لربط المجس الموسوم بالصبغة بالبادئ. تُغسل المجسات غير المرتبطة، ويُجرى تصوير فلوري لتحديد هوية المجس المرتبط. يمكن تكرار هذه الدورة إما باستخدام مجسات قابلة للقطع لإزالة الصبغة الفلورية وإعادة تكوين مجموعة 5′-PO4 لدورات الربط اللاحقة (الربط المتسلسل [ 36 ] [ 56 ] )، أو بإزالة بادئ جديد وتهجينه مع القالب (الربط غير المتسلسل [ 38 ] [ 39 ] ).

النيوكليوتيدات الفلورية المرتبطة بالفوسفور أو التسلسل في الوقت الحقيقي

تتصدر شركة باسيفيك بيوساينسز حاليًا هذا الأسلوب. يعتمد أسلوب التسلسل في الوقت الحقيقي على تصوير عملية دمج النيوكليوتيدات الموسومة بالصبغة بشكل مستمر أثناء تخليق الحمض النووي: حيث تُربط جزيئات بوليميراز الحمض النووي المفردة بالسطح السفلي لكاشفات الموجات الدليلية ذات النمط الصفري (كاشفات Zmw) التي تستطيع الحصول على معلومات التسلسل أثناء دمج النيوكليوتيدات المرتبطة بالفوسفور في سلسلة البادئ المتنامية. تستخدم باسيفيك بيوساينسز بوليميراز حمض نووي فريدًا من نوعه، يتميز بقدرة أفضل على دمج النيوكليوتيدات المرتبطة بالفوسفور، ويتيح إعادة تسلسل القوالب الدائرية المغلقة. في حين أن دقة القراءة الفردية تبلغ 87%، فقد تم إثبات دقة توافقية تصل إلى 99.999% مع أطوال قراءة متعددة الكيلوبايت. [ 57 ] [ 58 ] في عام 2015، أصدرت باسيفيك بيوساينسز جهاز تسلسل جديدًا يُسمى نظام Sequel، والذي يزيد السعة بمقدار 6.5 أضعاف تقريبًا. [ 59 ] [ 60 ]

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 3 نيرن، ب.؛ بيترسون، ب.؛ أولين، م. (يناير 1993). "التسلسل المصغر للحمض النووي في الطور الصلب بواسطة فحص الكشف عن بيروفوسفات غير عضوي إنزيمي ضوئي" . الكيمياء الحيوية التحليلية . 208 (1): 171-175 . doi : 10.1006/abio.1993.1024 . PMID 8382019 . 
  2. 1 2 روناغي م، كارامحمد س، بيترسون ب، أولين م، نيرين ب (نوفمبر 1996). "تسلسل الحمض النووي في الوقت الحقيقي باستخدام الكشف عن إطلاق البيروفوسفات". الكيمياء الحيوية التحليلية . 242 (1): 84-89 . doi : 10.1006/abio.1996.0432 . PMID 8923969 . 
  3. 1 2 US 5641658 ، آدامز سي بي، كرون إس جيه، "طريقة لتضخيم الحمض النووي باستخدام بادئين مرتبطين بدعامة صلبة واحدة"، نُشرت في 24 يونيو 1997، مُسجلة باسم شركة موزاييك تكنولوجيز ومعهد وايتهيد للأبحاث الطبية الحيوية 
  4. 1 2 EP 0972081 ، فارينيلي إل ، كاواشيما إي ، ماير بي )، "طريقة تضخيم الحمض النووي"، نُشر في 2007-06-13، مُخصص لشركة Solexa Ltd. 
  5. 1 2 EP 0975802 ، كاواشيما إي، فارينيلليت إل، ماير بي ، "طريقة تسلسل الأحماض النووية"، نُشر في 23 يونيو 2004 
  6. ↑ فولكردينغ كيه في، دامز إس إيه، دورتشي جيه دي (أبريل 2009). "التسلسل الجيني من الجيل التالي: من البحوث الأساسية إلى التشخيص" . الكيمياء السريرية . 55 (4): 641-658 . doi : 10.1373/clinchem.2008.112789 . PMID 19246620 . 
  7. ↑ بالارد د، وينكلر-غاليكي ج، ويسولي ج (يوليو 2020). "التسلسل المتوازي الضخم في الطب الشرعي: المزايا، والمشاكل، والجوانب التقنية، والآفاق" . المجلة الدولية للطب الشرعي . 134 (4): 1291-1303 . doi : 10.1007/s00414-020-02294-0 . PMC 7295846. PMID 32451905 .  
  8. 1 2 3 4 5 جياني إيه إم، غالو جي آر، جيانفرانشيسكي إل، فورمنتي جي (2020). "رحلة طويلة نحو علم الجينوم: تاريخ ومناهج تسلسل وتجميع الجينوم الحالية" . مجلة الحوسبة والتكنولوجيا الحيوية الهيكلية . 100 : 9-19 . doi : 10.1016/j.csbj.2019.11.002 . PMC 6926122. PMID 31890139 .  
  9. ↑ "مفهوم إعلان البرنامج: تطوير التكنولوجيا لمشروع الجينوم ذي الألف دولار" . مؤرشف من الأصل في 1 مارس 2025. تم الاطلاع عليه في 6 أبريل 2025 .
  10. ↑ مارديس، إي. (2011). "نظرة على مدى عقد من الزمن لتقنية تسلسل الحمض النووي". مجلة نيتشر . 470 (7333): 198-203 . Bibcode : 2011Natur.470..198M . doi : 10.1038/nature09796 . PMID 21307932 . 
  11. ↑ مارغوليس م، إيغولم م، ألتمان و، وآخرون (2005). "تسلسل الجينوم في مفاعلات بيكولتر عالية الكثافة مصنعة بتقنية النانو" . مجلة نيتشر . 437 (7057): 376-380 . Bibcode : 2005Natur.437..376M . doi : 10.1038/nature03959 . PMC 1464427. PMID 16056220 .   
  12. ↑ هيذر، جيمس م.؛ تشين، بنجامين (2016). "تسلسل أجهزة التسلسل: تاريخ تسلسل الحمض النووي" . علم الجينوم . 107 (1): 1-8 . doi : 10.1016 / j.ygeno.2015.11.003 . PMC 4727787. PMID 26554401 .  
  13. ↑ بنتلي د، بالاسوبرامانيان س، سويردلو هـ، وآخرون (2008). "تسلسل دقيق للجينوم البشري الكامل باستخدام كيمياء الإنهاء العكسي" . نيتشر . 456 ( 7218): 53-59 . Bibcode : 2008Natur.456...53B . doi : 10.1038/nature07517 . PMC 2581791. PMID 18987734 .   
  14. ١ ٢ تحقق من هايدن، إي. (٢٠١٢). "روش تسعى للحصول على حصة في التسلسل الطبي". نيتشر . ٤٨٤ (٧٣٩٣): ١٥٢. Bibcode : 2012Natur.484..152C . doi : 10.1038/484152a . PMID 22498604 . 
  15. ↑ بالاسوبرامانيان، شانكار (2015). "تسلسل Solexa: فك شفرة الجينومات على نطاق سكاني". الكيمياء السريرية . 61 (1): 21-24 . doi : 10.1373/clinchem.2014.221747 . PMID 25332311 . 
  16. ↑ ماكيرنان كيه جيه، بيكهام إتش إي، كوستا جي إل، وآخرون (2009). "التغيرات في التسلسل والبنية في الجينوم البشري التي تم الكشف عنها بواسطة تسلسل الربط المتوازي عالي الإنتاجية ذي القراءة القصيرة باستخدام ترميز ثنائي القاعدة" . أبحاث الجينوم . 19 (9): 1527-1541 . doi : 10.1101/gr.091868.109 . PMC 2752135. PMID 19546169 .   
  17. ↑ هوانغ واي إف، تشين إس سي، تشيانغ واي إس، وآخرون (2012). "التسلسل المتناظر يعيق آلية التسلسل بالربط" . بي إم سي سيست بيول . 6 (ملحق 2) S10. doi : 10.1186/1752-0509-6-S2-S10 . PMC 3521181. PMID 23281822 .   
  18. ↑ روثبرغ جيه إم، هينز إتش، ريريك تي إم، وآخرون (2011). "جهاز أشباه موصلات متكامل يُمكّن من تسلسل الجينوم غير البصري" . مجلة نيتشر . 475 (7356): 348-352 . doi : 10.1038/nature10242 . PMID 21776081 .  
  19. ↑ لومان، ن. ج.، ميسرا، ر. ف.، دالمان، ت. ج.، وآخرون (2012). "مقارنة أداء منصات التسلسل عالية الإنتاجية المكتبية". نات بيوتكنولوجي . 30 (5): 434-439 . doi : 10.1038/nbt.2198 . PMID 22522955 .  
  20. ↑ "بعد قرار روش بإغلاق منصة 454، يخطط العملاء للانتقال إلى منصات أخرى" . 22 أكتوبر 2013.
  21. ↑ زيمرمان، إيلين (18 فبراير 2014). "أذكى 50 شركة: إلومينا" . مجلة إم آي تي ​​للتكنولوجيا . معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا . مؤرشف من الأصل في 11 ديسمبر 2015. تم الاطلاع عليه في 25 أغسطس 2014 .
  22. ↑ ريغالادو، أنطونيو. "التكنولوجيا الناشئة: شركة إلومينا تقول إنها ستُجري تسلسل 228 ألف جينوم بشري هذا العام" . مجلة إم آي تي ​​للتكنولوجيا . معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا . مؤرشف من الأصل في 26 ديسمبر 2015. تم الاطلاع عليه في 26 سبتمبر 2014 .
  23. ↑ كلارك، ليات (15 يناير 2014). "شركة إلومينا تعلن عن مشروع تاريخي لتسلسل الجينوم البشري بتكلفة 1000 دولار" . مجلة وايرد . مؤرشف من الأصل في 4 نوفمبر 2019. تم الاطلاع عليه في 4 نوفمبر 2019 .
  24. ↑ بولونيس ك، بلوميل جيه إتش، هيوز إيه إي، وآخرون (2025). "الابتكارات في تقنيات تسلسل القراءة القصيرة وتطبيقاتها في علم الجينوم السريري" . الكيمياء السريرية . 71 (1): 97-108 . doi : 10.1093/clinchem/hvae173 . 
  25. 1 2 3 أيزنشتاين، مايكل (20 فبراير 2023). "التقنيات المبتكرة تغزو سوق تسلسل القراءة القصيرة". مجلة نيتشر . 614 (7949): 798-800 . doi : 10.1038/d41586-023-00512-4 . PMID 36807670 . 
  26. ↑ فيليبيديس، أليكس (2024). "أفضل ما في تقنية التسلسل الجيني من الجيل التالي: شركات الأجهزة التي تستحق المتابعة: شركة إلومينا الرائدة منذ فترة طويلة والعديد من الشركات المنافسة تُكثّف إطلاق أدوات التسلسل الجيني الجديدة من الجيل التالي" . أخبار الهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية . 44 (4): 16-41 .
  27. ↑ فريق عمل Bio-IT World (3 فبراير 2026). "شركة PacBio تبيع حقوق الملكية الفكرية الخاصة بتقنية القراءة القصيرة لشركة Illumina" . Bio-IT World . تاريخ الاسترجاع: 6 مايو 2026 .
  28. ↑ «باكبيو تُكمل بيع أصول تسلسل القراءة القصيرة» (بيان صحفي). باكبيو. 2 فبراير 2026. تم الاطلاع عليه بتاريخ 6 مايو 2026 .
  29. ↑ أندرسون، إم دبليو، وشريجفر ، آي (مايو 2010). "تسلسل الحمض النووي من الجيل التالي ومستقبل الطب الجينومي" . الجينات . 1 (1): 38-69 . doi : 10.3390/genes1010038 . PMC 3960862. PMID 24710010 .  
  30. ↑ تاكر تي، مارا إم، فريدمان جيه إم (أغسطس 2009). "التسلسل المتوازي الضخم: التطور الأبرز القادم في الطب الجيني" . المجلة الأمريكية لعلم الوراثة البشرية . 85 (2): 142-154 . doi : 10.1016/j.ajhg.2009.06.022 . PMC 2725244. PMID 19679224 .  
  31. ↑ "تكاليف تسلسل الحمض النووي: البيانات" . www.genome.gov . تم الاطلاع عليه بتاريخ 2026-02-03 .
  32. ↑ "مواصفات جهاز HiSeq 2500" . مؤرشف من الأصل بتاريخ 2014-12-06 . تم الاطلاع عليه بتاريخ 2014-11-06 .
  33. ↑ "هاي سيك الإصدار الرابع متوفر الآن... وهو يفي بالغرض | إدنبرة جينوميكس" . مؤرشف من الأصل بتاريخ 6 نوفمبر 2014. تم الاطلاع عليه بتاريخ 6 نوفمبر 2014 .
  34. 1 2 براءة اختراع أمريكية رقم 7790869 ، جو جيه، لي زد، إدواردز جيه آر، إيتاغاكي واي، "طريقة متوازية ضخمة لفك شفرة الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA"، نُشرت في 7 سبتمبر 2010، مُسجلة باسم أمناء جامعة كولومبيا في مدينة نيويورك 
  35. 1 2 بنتلي دي آر، بالاسوبرامانيان إس، سويردلو إتش بي، سميث جي بي، ميلتون جيه، براون سي جي، وآخرون . (نوفمبر 2008). "تسلسل دقيق للجينوم البشري الكامل باستخدام كيمياء الإنهاء العكسي" . نيتشر . 456 (7218): 53-59 . Bibcode : 2008Natur.456...53B . doi : 10.1038/nature07517 . PMC 2581791. PMID 18987734 .   
  36. 1 2 ماكيرنان كيه جيه، بيكهام إتش إي، كوستا جي إل، ماكلولين إس إف، فو واي، تسونغ إي إف، وآخرون . (سبتمبر 2009). "التغيرات في التسلسل والبنية في جينوم بشري تم الكشف عنها بواسطة تسلسل الربط المتوازي عالي الإنتاجية ذي القراءة القصيرة باستخدام ترميز ثنائي القاعدة" . أبحاث الجينوم . 19 (9): 1527-1541 . doi : 10.1101/gr.091868.109 . PMC 2752135. PMID 19546169 .   
  37. ↑ "Ion Torrent" . مؤرشف من الأصل في 30 ديسمبر 2013. تم الاطلاع عليه في 1 يناير 2014 .
  38. 1 2 Drmanac R, Sparks AB, Callow MJ, Halpern AL, Burns NL, Kermani BG, et al. (يناير 2010). " تسلسل الجينوم البشري باستخدام قراءات القواعد غير المتسلسلة على مصفوفات نانوية ذاتية التجميع من الحمض النووي" . مجلة ساينس . 327 (5961): 78-81 . Bibcode : 2010Sci...327...78D . doi : 10.1126/science.1181498 . PMID 19892942. S2CID 17309571 .   
  39. شندور جيه ، بوريكا جي جيه، ريباس إن بي، لين إكس، مكوتشون جيه بي، روزنباوم إيه إم، وآخرون . (سبتمبر 2005). " التسلسل المتعدد الدقيق لجينوم بكتيري متطور" . مجلة ساينس . 309 (5741): 1728-1732 . Bibcode : 2005Sci...309.1728S . doi : 10.1126/science.1117389 . PMID 16081699. S2CID 11405973 .   
  40. ↑ بيترز، ب. أ.، كرماني، ب. ج.، سباركس، أ. ب.، ألفيروف، أ.، هونغ، ب.، أليكسييف، أ.، وآخرون . (يوليو 2012). "التسلسل الدقيق للجينوم الكامل وتحديد النمط الفرداني من 10 إلى 20 خلية بشرية" . مجلة نيتشر . 487 (7406): 190-195 . Bibcode : 2012Natur.487..190P . doi : 10.1038/nature11236 . PMC 3397394. PMID 22785314 .   
  41. ↑ «شركة باسيفيك بيوساينسز تُقدّم تقنية كيميائية جديدة ذات قراءات أطول للكشف عن خصائص جديدة في تسلسل الحمض النووي وتطوير دراسات الجينوم للكائنات الحية الكبيرة» (بيان صحفي). باسيفيك بيوساينسز، كاليفورنيا. 3 أكتوبر 2013 - عبر غرفة أخبار غلوب نيوزواير.
  42. ↑ نيدربراغت إل (2013-07-05). "تجميع الجينوم البكتيري من الصفر: مشكلة محلولة؟" .
  43. ↑ فولكردينغ كيه في، دامز إس، دورتشي جيه دي (سبتمبر 2010). "التسلسل الجيني من الجيل التالي للتشخيص السريري - المبادئ والتطبيق على إعادة التسلسل المستهدف لاعتلال عضلة القلب الضخامي: ورقة بحثية من ندوة مستشفى ويليام بومونت لعام 2009 حول علم الأمراض الجزيئي" . مجلة التشخيص الجزيئي . 12 (5): 539-551 . doi : 10.2353/jmoldx.2010.100043 . PMC 2928417. PMID 20805560 .  
  44. 1 2 تشي-سينغ ك، يون لي، يودي ب، كي-سينغ سي (أبريل 2010). "تقنيات التسلسل من الجيل التالي وتطبيقاتها". موسوعة علوم الحياة (ELS) . تشيتشستر: جون وايلي وأولاده المحدودة.
  45. 1 2 3 ميتزكر ، إم إل (يناير 2010). "تقنيات التسلسل - الجيل القادم". مراجعات الطبيعة. علم الوراثة . 11 (1): 31-46 . doi : 10.1038/nrg2626 . PMID 19997069. S2CID 205484500 .  
  46. ↑ دريسمان د، يان هـ، ترافيرسو ج، كينزلر ك.و، فوغلشتاين ب (يوليو 2003). "تحويل جزيئات الحمض النووي المفردة إلى جسيمات مغناطيسية فلورية للكشف عن الاختلافات الجينية وحصرها" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 100 (15): 8817-8822 . Bibcode : 2003PNAS..100.8817D . doi : 10.1073/pnas.1133470100 . PMC 166396. PMID 12857956 .  
  47. 1 2 براءة اختراع أمريكية رقم 6485944 ، تشيرش جي إم، ميترا آر، "تضخيم النسخ المتماثل لمصفوفات الأحماض النووية"، نُشرت في 26 نوفمبر 2002، مُخصصة لرئيس وزملاء كلية هارفارد 
  48. 1 2 ميترا آر دي، تشيرش جي إم (ديسمبر 1999). "التضخيم الموضعي في الموقع والتضاعف التلامسي للعديد من جزيئات الحمض النووي الفردية" . أبحاث الأحماض النووية . 27 (24): 34e–34. doi : 10.1093/nar/27.24.e34 . PMC 148757. PMID 10572186 .  
  49. ↑ براءة اختراع أمريكية رقم 9624538 ، تشيرش جي إم، بوريكا جي جي، شندور جي، روزنباوم إيه إم، "تسلسل الحمض النووي الدائري المتدحرج على شبكة نانوية"، نُشرت في 18 أبريل 2017، مُخصصة لرئيس وزملاء كلية هارفارد 
  50. ↑ براءة اختراع أمريكية رقم 8445194 ، Drmanac R، Callow MJ، Drmanac S، Hauser BK، Yeung G، "مصفوفات الجزيئات المفردة للتحليل الجيني والكيميائي"، نُشرت في 2013-05-21، مُخصصة لشركة Callida Genomics Inc. 
  51. ↑ ماير ب، ماتون ج، أديسي س، توركاتي ج، ميرمود ج ج، كاواشيما إي (7-10 أكتوبر 1998). طريقة تسلسل الحمض النووي واسعة النطاق وعالية الإنتاجية ومنخفضة التكلفة تعتمد على عملية جديدة للنمط التلقائي ثنائي الأبعاد للحمض النووي . المؤتمر الدولي الخامس للأتمتة في رسم الخرائط وتسلسل الحمض النووي. سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية. عرض تقديمي حول التسلسل المتوازي الضخم لمستعمرات الحمض النووي ams98
  52. 1 2 روناغي، مصطفى؛ أولين، ماتياس. نيرين ، بال (17/07/1998). "طريقة التسلسل على أساس بيروفوسفات في الوقت الحقيقي" . علوم . 281 (5375): 363–365 . دوى : 10.1126/science.281.5375.363 . ISSN 0036-8075 . بميد 9705713 . S2CID 26331871 .   
  53. ↑ US 6833246 ، Balasubramanian S، "تسلسل متعدد النوكليوتيدات"، نُشر في 2004-12-21، مُخصص لشركة Solexa Ltd. 
  54. ↑ "تقنية التحليل" . إلومينا. مؤرشف من الأصل بتاريخ 26-08-2012 . تم الاطلاع عليه بتاريخ 05-08-2012 .
  55. ↑ "تسلسل الجزيء المفرد الحقيقي (tSMS™): شركة هيليكوس للعلوم الحيوية" . Helicosbio.com. مؤرشف من الأصل بتاريخ 11 مارس 2012. تم الاطلاع عليه بتاريخ 5 أغسطس 2012 .
  56. ↑ "أساسيات ترميز الأساس الثنائي ومساحة الألوان" . Appliedbiosystems.cnpg.com. مؤرشف من الأصل بتاريخ 1 سبتمبر 2008. تم الاطلاع عليه بتاريخ 5 أغسطس 2012 .
  57. ↑ تشين سي إس، ألكسندر دي إتش، ماركس بي، كلامر إيه إيه، دريك جيه، هاينر سي، وآخرون (يونيو 2013). " تجميعات جينومية ميكروبية غير هجينة وكاملة من بيانات تسلسل SMRT طويلة القراءة". Nature Methods . 10 (6): 563–569 . doi : 10.1038/nmeth.2474 . PMID 23644548. S2CID 205421576 .   
  58. ↑ مونيكا هيجر (5 مارس 2013). "مستخدمو PacBio يبلغون عن تقدم في القراءات الطويلة لتجميع جينوم النبات، والمناطق الصعبة من الجينوم البشري" .
  59. ↑ "باكبيو تطلق نظام تسلسل جزيء واحد ذو إنتاجية أعلى وتكلفة أقل" . أكتوبر 2015.
  60. ↑ "باك بايو تعلن عن نظام تسلسل السلاسل - عالم تكنولوجيا المعلومات الحيوية" . www.bio-itworld.com . مؤرشف من الأصل بتاريخ 2015-10-02.