تبلور البروتين

تخضع عملية تبلور البروتينات لنفس قوانين الفيزياء التي تحكم تكوين البلورات غير العضوية. ولكي يحدث التبلور تلقائيًا، يجب أن تكون حالة البلورة مُفضلة من الناحية الديناميكية الحرارية. ويُعبّر عن ذلك بطاقة غيبس الحرة (∆G)، المُعرّفة بالمعادلة ∆G = ∆H - T∆S، والتي تُبيّن كيفية مُوازنة التغير في المحتوى الحراري للعملية، ∆H، مع التغير المُقابل في الإنتروبيا ، ∆S. ^{[ 10 ]} تُعرّف الإنتروبيا، بشكل عام، مدى اضطراب النظام. وتُعتبر الحالات عالية التنظيم، مثل بلورات البروتين، غير مُفضلة من الناحية الديناميكية الحرارية مُقارنةً بالحالات الأقل تنظيمًا، مثل محاليل البروتينات في المذيب، لأن الانتقال إلى حالة أكثر تنظيمًا سيُقلل من الإنتروبيا الكلية للنظام (∆S سالبة). ولكي تتشكل البلورات تلقائيًا، يجب أن تكون قيمة ∆G لتكوين البلورة سالبة. بمعنى آخر، يجب تعويض التكلفة الإنتروبية بانخفاض مماثل في الطاقة الكلية للنظام (∆H). تتشكل البلورات غير العضوية المألوفة، مثل كلوريد الصوديوم، تلقائيًا في الظروف المحيطة لأن الحالة البلورية تُقلل من الطاقة الكلية للنظام. مع ذلك، فإن تبلور بعض البروتينات في الظروف المحيطة يُقلل من الإنتروبيا (∆S سالب) ويزيد من الطاقة الكلية (∆H موجب) للنظام، وبالتالي لا يحدث تلقائيًا. لتحقيق تبلور هذه البروتينات، تُعدّل الظروف لجعل تكوين البلورات مُفضلاً من الناحية الطاقية. ويتحقق ذلك غالبًا عن طريق تكوين محلول فوق مشبع من العينة. ^{[ 3 ]}

يتطلب تكوين البلورات خطوتين: التكوين والنمو . ^{[ 3 ]} التكوين هو الخطوة الأولى في عملية التبلور. ^{[ 3 ] في مرحلة التكوين ،} تتجمع جزيئات البروتين الموجودة في المحلول لتشكل نواة صلبة مستقرة. ^{[ 3} ] مع تشكل النواة، تنمو البلورة تدريجيًا من خلال ارتباط الجزيئات بها. ^{[ 3 ]} تُعد خطوة التكوين حاسمة لتكوين البلورات، لأنها تمثل انتقالًا طوريًا من الدرجة الأولى، حيث تنتقل العينات من حالة ذات درجة حرية عالية إلى حالة منتظمة (من الحالة المائية إلى الحالة الصلبة). ^{[ 3 ]} ولنجاح خطوة التكوين، يُعد التحكم في معايير التبلور أمرًا أساسيًا. وتتمثل الطريقة المتبعة في جعل البروتين يتبلور في تقليل ذوبانيته في المحلول. ^{[ 3 ]} بمجرد تجاوز حد الذوبان وظهور البلورات، تكتمل عملية التبلور. ^{[ 3 ]}

يُعدّ الانتشار البخاري الطريقة الأكثر شيوعًا لتبلور البروتينات. في هذه الطريقة، تُترك قطرات تحتوي على بروتين مُنقّى، ومحلول منظم ، ومُرسب، لتتوازن مع خزان أكبر يحتوي على محاليل منظمة ومُرسبات مماثلة بتراكيز أعلى. في البداية، تحتوي قطرة محلول البروتين على تراكيز منخفضة نسبيًا من المُرسب والبروتين، ولكن مع توازن القطرة والخزان، تزداد تراكيز المُرسب والبروتين في القطرة. إذا استُخدمت محاليل التبلور المناسبة لبروتين مُعين، يحدث نمو البلورات في القطرة. ^{[ 11 ] [ 12 ]} تُستخدم هذه الطريقة لأنها تسمح بتغييرات لطيفة وتدريجية في تركيز البروتين والمُرسب، مما يُساعد على نمو بلورات كبيرة ومنظمة جيدًا.

يمكن إجراء عملية التبلور بالانتشار البخاري إما بتقنية القطرة المعلقة أو بتقنية القطرة الجالسة. في تقنية القطرة المعلقة، توضع قطرة من محلول البروتين على غطاء زجاجي مقلوب، ثم تُعلق فوق الخزان. أما في تقنية التبلور بالقطرة الجالسة، فتوضع القطرة على قاعدة منفصلة عن الخزان. تتطلب كلتا الطريقتين إحكام إغلاق البيئة المحيطة لضمان حدوث التوازن بين القطرة والخزان. ^{[ 11 ] [ 13 ]}

تتضمن عملية التحضير الدقيق عادةً غمر حجم صغير جدًا من قطرات البروتين في الزيت (قد يصل إلى 1 ميكرولتر). والسبب في استخدام الزيت هو صغر حجم محلول البروتين المستخدم، مما يستدعي منع التبخر لإجراء التجربة في وسط مائي. ورغم وجود أنواع مختلفة من الزيوت، فإن أكثر مواد منع التسرب شيوعًا هما زيت البارافين (كما وصفه تشاين وآخرون) وزيت السيليكون (كما وصفه دارسي). وهناك أيضًا طرق أخرى للتحضير الدقيق لا تستخدم مادة مانعة للتسرب سائلة، بل تتطلب من الباحث وضع غشاء أو شريط لاصق بسرعة على صفيحة ذات تجاويف بعد وضع القطرة في التجويف.

إلى جانب الكميات المحدودة للغاية من العينات المطلوبة، تتميز هذه الطريقة أيضًا بميزة إضافية تتمثل في حماية العينات من التلوث المحمول جوًا، حيث أنها لا تتعرض للهواء أبدًا أثناء التجربة.

تعتمد تقنية الميكرودياليز على غشاء شبه نفاذ ، يسمح بمرور الجزيئات الصغيرة والأيونات، بينما لا تستطيع البروتينات والبوليمرات الكبيرة المرور. ومن خلال إنشاء تدرج في تركيز المذاب عبر الغشاء والسماح للنظام بالتقدم نحو حالة التوازن، يمكن للنظام أن يتحرك ببطء نحو حالة التشبع الفائق، وعندها قد تتشكل بلورات البروتين.

يمكن لتقنية الميكرودياليز إنتاج البلورات عن طريق الترسيب الملحي ، باستخدام تركيزات عالية من الملح أو مركبات صغيرة أخرى قابلة للنفاذ عبر الغشاء، مما يقلل من ذوبان البروتين. وفي حالات نادرة جدًا، يمكن بلورة بعض البروتينات عن طريق الترسيب الملحي بالدياليز، وذلك عن طريق الدياليز ضد الماء النقي، مما يزيل المواد المذابة ويحفز التجمع الذاتي والتبلور.

تجمع هذه التقنية بين محلولي البروتين والترسيب دون مزجهما مسبقًا، بل بحقنهما من جانبي قناة، مما يسمح بالوصول إلى حالة التوازن عبر الانتشار. يتلامس المحلولان في حجرة التفاعل، وكلاهما عند أعلى تركيز لهما، مما يبدأ عملية التبلور التلقائي. ومع وصول النظام إلى حالة التوازن، ينخفض ​​مستوى التشبع الفائق، مما يُحفز نمو البلورات. ^{[ 14 ]}

تتمثل القوة الدافعة الأساسية لتبلور البروتينات في تحسين عدد الروابط التي يمكن أن تتشكل بين البروتينات من خلال التفاعلات بين الجزيئية. ^{[ 3 ]} تعتمد هذه التفاعلات على كثافة الإلكترونات في الجزيئات والسلاسل الجانبية للبروتين، والتي تتغير تبعًا لدرجة الحموضة ( pH) . ^{[ 10 ]} يتحدد التركيب الثالثي والرباعي للبروتينات من خلال التفاعلات بين الجزيئية بين المجموعات الجانبية للأحماض الأمينية، حيث تتجه المجموعات المحبة للماء عادةً نحو الخارج باتجاه المحلول لتشكيل غلاف مائي مع المذيب (الماء). ^{[ 10 ]} مع تغير درجة الحموضة، تتغير الشحنة على هذه المجموعات الجانبية القطبية أيضًا تبعًا لدرجة حموضة المحلول وقيمة pKa للبروتين . لذا، يُعد اختيار درجة الحموضة أمرًا بالغ الأهمية إما لتعزيز تكوين البلورات حيث يكون الترابط بين الجزيئات مع بعضها البعض أكثر ملاءمة من الترابط مع جزيئات الماء. ^{[ 10 ]} تُعد درجة الحموضة من أقوى العوامل التي يمكن التحكم بها لتحقيق ظروف التبلور المثلى.

تُعدّ درجة الحرارة عاملاً مهماً آخر يستحق النقاش، إذ أن ذوبان البروتين يعتمد عليها. ^{[ 15 ]} في عملية تبلور البروتين، يُعدّ التحكم بدرجة الحرارة للحصول على بلورات ناجحة إحدى الاستراتيجيات الشائعة. وعلى عكس الرقم الهيدروجيني، فإن درجة حرارة المكونات المختلفة لتجارب علم البلورات قد تؤثر على النتائج النهائية، مثل درجة حرارة تحضير المحلول المنظم، ^{[ 16 ]} ودرجة حرارة تجربة التبلور نفسها، وغيرها.

الإضافات الكيميائية هي مركبات كيميائية صغيرة تُضاف إلى عملية التبلور لزيادة إنتاجية البلورات. ^{[ 17 ]} لم يُدرس دور الجزيئات الصغيرة في تبلور البروتينات جيدًا في البداية، إذ اعتُبرت في معظم الحالات شوائب. ^{[ 17 ]} يُعتقد أن الجزيئات الصغيرة تُساعد عند دمجها كـ"جسور تعبئة" في أسطح التلامس البلورية. ولا يُمكن حاليًا (حتى عام 2017) تحديد الجزيئات الصغيرة التي يجب استخدامها لتحسين فرص التبلور بشكل منطقي. ^{[ 18 ]}

تتمثل إحدى الطرق الكلاسيكية للتبلور في إضافة كمية صغيرة من البروتياز إلى القطرة، حيث قد ينتج عن الهضم جزء أكثر قابلية للتبلور عن طريق إزالة المناطق غير المنظمة.

يمكن استخدام التعديل الكيميائي لتحسين التبلور. وأكثر الطرق شيوعاً هي المَثْيَلَة الاختزالية، التي تُغيّر الليسينات السطحية بطريقة تُقلل عادةً من الإنتروبيا. ^{[ 18 ]}

توجد طرق عالية الإنتاجية تُساعد على تبسيط العدد الكبير من التجارب اللازمة لاستكشاف الظروف المختلفة الضرورية لنمو البلورات بنجاح. تتوفر العديد من المجموعات التجارية الجاهزة التي تستخدم مكونات مُجمّعة مسبقًا في أنظمة تضمن إنتاج بلورات ناجحة. باستخدام هذه المجموعات، يتجنب الباحث عناء تنقية البروتين وتحديد ظروف التبلور المناسبة. ^{[ 19 ]}

يمكن استخدام الروبوتات المُخصصة لمعالجة السوائل لإعداد وأتمتة عدد كبير من تجارب التبلور في وقت واحد. ما كان سيُعتبر عملية بطيئة وعرضة للأخطاء عند تنفيذها يدويًا، يُمكن إنجازه بكفاءة ودقة باستخدام نظام آلي. تستخدم أنظمة التبلور الروبوتية نفس المكونات المذكورة أعلاه، ولكنها تُنفذ كل خطوة من خطوات العملية بسرعة وبعدد كبير من التكرارات. تستخدم كل تجربة كميات ضئيلة من المحلول، وتكمن ميزة الحجم الأصغر في جانبين: لا تُقلل أحجام العينات الأصغر من استهلاك البروتين المُنقّى فحسب، بل تُؤدي كميات المحلول الأصغر إلى تبلور أسرع. تتم مراقبة كل تجربة بواسطة كاميرا ترصد نمو البلورات. ^{[ 12 ]}

يمكن هندسة البروتينات لتحسين فرص نجاح عملية التبلور. ومن الطرق الشائعة لذلك تقليم التركيب المُعاد تركيبه لإزالة الأجزاء الطرفية N و C، والتي غالباً ما تكون غير منتظمة أو ذات بنية ضعيفة ("ذات إنتروبيا عالية"). ^{[ 18 ]}

يتضمن تقليل إنتروبيا السطح استبدال تجمعات بقايا الأحماض الأمينية السطحية ذات الإنتروبيا التشكيلية العالية (عادةً الليسين، والغلوتامات، والغلوتامين) بالألانين. ^{[ 20 ]} وبالمثل، أثبت استبدال الليسين بالأرجينين في المواد الصلبة جدواه. ^{[ 21 ]} كما يمكن هندسة التفاعلات البلورية عن طريق تغيير بقايا الأحماض الأمينية. ^{[ 22 ]}

تتضمن إحدى الطرق الأكثر تطوراً استخدام بروتينات "مرافقة" معروفة بقدرتها العالية على التبلور. ويمكن تحقيق ذلك من خلال تصميم بروتين اندماجي يتكون من بروتين ذي بنية غير معروفة ونطاق بروتيني معروف بقدرته الجيدة على التبلور. وقد يكون التفاعل المعني بين الجزيئات ، على سبيل المثال بين البروتين المرشح وبعض أجزاء Fab من الأجسام المضادة المختارة للارتباط بإحكام بالبروتين، ^{[ 18 ]} أو بين بروتين اندماجي مرشح مع بروتين رابط للمالتوز (MBP) وبروتين مصمم خصيصاً للارتباط بـ MBP. ^{[ 23 ]}

تتطلب العديد من طرق هندسة البروتينات معرفة مسبقة ببنية البروتين، إما بمعرفة الأحماض الأمينية السطحية أو المدفونة، أو بمعرفة البنية الثلاثية الكاملة. وتُعد أدوات التنبؤ الحديثة ببنية البروتين كافية إلى حد كبير. كما يُمكن التنبؤ بنتيجة التبلور باستخدام هذه الطرق. ^{[ 24 ]}

تُسبب بقايا السيستين على السطح مشاكل في إنتاج البروتينات المؤتلفة نتيجة لتكتلها. ويمكن استبدالها بالألانين. لا تُشكل هذه مشكلة في عملية التبلور بحد ذاتها ، ولكنها شائعة في تحديد البنية.