تمزق الخلايا

تعتمد إحدى الطرق الميكانيكية الشائعة لتفتيت الخلايا على نطاق المختبر على استخدام خرز زجاجي أو خزفي أو فولاذي ، بقطر يتراوح بين 0.1 و2 مم (0.004-0.08 بوصة) ، يُخلط مع عينة معلقة في محلول مائي . طُوّرت هذه الطريقة لأول مرة على يد تيم هوبكنز في أواخر سبعينيات القرن الماضي، حيث يُعرّض مزيج العينة والخرز لحركة قوية عن طريق التحريك أو الرج. يصطدم الخرز بالعينة الخلوية، مما يؤدي إلى تشقق الخلية وإطلاق مكوناتها الداخلية . على عكس بعض الطرق الأخرى، يكون القص الميكانيكي معتدلاً أثناء التجنيس، مما ينتج عنه تحضيرات ممتازة للأغشية أو المكونات الخلوية. تُعرف هذه الطريقة، التي تُسمى غالبًا "الخفق بالخرز"، بأنها فعّالة مع جميع أنواع المواد الخلوية - من الأبواغ إلى الأنسجة الحيوانية والنباتية . وهي الطريقة الأكثر استخدامًا لتحليل الخميرة ، ويمكن أن تُحقق نسبة تكسر تتجاوز 50% (تصل إلى 95%). ^{[ 1 ]} يتميز هذا الأسلوب عن طرق التفتيت الميكانيكي الأخرى للخلايا بقدرته على تفتيت أحجام عينات صغيرة جدًا، ومعالجة العديد من العينات في وقت واحد دون أي مخاوف بشأن التلوث المتبادل، كما أنه لا يطلق رذاذًا ضارًا محتملاً في هذه العملية.  

في أبسط مثال على هذه الطريقة، تُضاف كمية متساوية من الخرز إلى معلق الخلايا أو الأنسجة في أنبوب اختبار، ثم تُخلط العينة بقوة باستخدام جهاز خلط دوامي مختبري عادي . ورغم أن وقت المعالجة بطيء، إذ يستغرق من 3 إلى 10 أضعاف الوقت اللازم في أجهزة الخلط المتخصصة ، إلا أنها فعالة مع الخلايا سهلة التفتيت وغير مكلفة.

يعتمد نجاح عملية الخلط بالخرز ليس فقط على خصائص تصميم آلة الخلط (التي تأخذ في الاعتبار تردد اهتزازات الخلط، ومدى أو مسافة الخلط، واتجاه الخلط، واتجاه القارورة)، ولكن أيضًا على اختيار الحجم الصحيح للخرز ( قطر 0.1-6 مم (0.004-0.2 بوصة) )، وتكوين الخرز (زجاج، سيراميك، فولاذ) وحمل الخرز في القارورة .  

في معظم المختبرات، تُجرى عملية تكسير الخلايا باستخدام الخرز في دفعات تتراوح بين قارورة بلاستيكية محكمة الإغلاق أو أنابيب طرد مركزي ، من قارورة واحدة إلى أربع وعشرين قارورة . تُحرّك العينة والخرزات الدقيقة بسرعة 2000 ذبذبة في الدقيقة تقريبًا في هزازات ترددية مصممة خصيصًا، تعمل بمحركات كهربائية عالية القدرة . يكتمل تكسير الخلايا في غضون دقيقة إلى ثلاث دقائق من الرج. ويمكن تحقيق معدلات تكسير خلايا أسرع بكثير باستخدام نوع مُعدّل من آلات تكسير الخلايا يُسمى "سوني بيست" . يختلف هذا الجهاز عن الآلات التقليدية، إذ يُحرّك الخرزات بحركة دوامية بسرعة 20000 ذبذبة في الدقيقة. كما تُساهم آلات تكسير الخلايا الأكبر حجمًا، التي تتسع لألواح معايرة دقيقة ذات آبار عميقة ، في تقصير أوقات العملية، وكذلك موزعات الخرز المصممة لتحميل الخرزات بسرعة في قوارير أو ألواح معايرة دقيقة متعددة. ^{[ 2 ] [ 3 ]} تتوفر أيضًا قوارير وألواح معايرة دقيقة مُحمّلة مسبقًا.

تقوم جميع أجهزة الخلط بالخرز عالية الطاقة بتسخين العينة بمعدل 10 درجات مئوية تقريبًا في الدقيقة. ويعود ذلك إلى احتكاك الخرز أثناء عملية التجنيس. وقد يكون تبريد العينة أثناء أو بعد الخلط بالخرز ضروريًا لمنع تلف البروتينات الحساسة للحرارة، مثل الإنزيمات. ويمكن التحكم في تسخين العينة عن طريق الخلط بالخرز لفترات قصيرة مع التبريد على الجليد بين كل فترة، أو عن طريق معالجة القوارير في حوامل قوارير ألومنيوم مبردة مسبقًا، أو عن طريق تدوير سائل تبريد غازي عبر الجهاز أثناء الخلط بالخرز.

يستخدم تصميم مختلف لخلاط الخرز، مناسب لأحجام عينات أكبر، دوارًا فلوروكربونيًا داخل حجرة سعتها 15 أو 50 أو 200 مل لتحريك الخرز. في هذا التصميم، يمكن إحاطة الحجرة بغلاف تبريد ثابت. وباستخدام نفس تصميم الدوار/الحجرة، تتوفر آلات تجارية كبيرة لمعالجة عدة لترات من معلقات الخلايا . حاليًا، تقتصر هذه الآلات على معالجة الكائنات وحيدة الخلية مثل الخميرة والطحالب والبكتيريا .

تُطحن العينات ذات المادة الخلوية الخارجية الصلبة، مثل الأنسجة الضامة الحيوانية، وبعض عينات خزعات الأورام، والأنسجة الوريدية، والغضاريف، والبذور، وغيرها، إلى مسحوق ناعم عن طريق الطحن بالصدم عند درجات حرارة النيتروجين السائل. تعتمد هذه التقنية، المعروفة بالطحن بالتبريد، على حقيقة أن العينات البيولوجية التي تحتوي على نسبة كبيرة من الماء تصبح هشة عند درجات الحرارة المنخفضة للغاية. وقد وصف سموكر وبفايستر هذه التقنية لأول مرة عام 1975، وأطلقوا عليها اسم الطحن بالصدم بالتبريد. وأثبت الباحثان أن الخلايا تُكسر بفعالية بهذه الطريقة، مؤكدين من خلال المجهر الضوئي والإلكتروني أن مستويات الكسر تخترق جدران الخلايا والأغشية السيتوبلازمية. ^{[ 4 ]}

يمكن تطبيق هذه التقنية باستخدام هاون ومدقة مُبرّدين إلى درجة حرارة النيتروجين السائل، إلا أن استخدام هذا الجهاز التقليدي مُرهق، وغالبًا ما يُشكّل فقدان العينة مصدر قلق. كما تتوفر مطاحن متخصصة من الفولاذ المقاوم للصدأ، تُعرف عمومًا باسم مطاحن الأنسجة، لهذا الغرض. فهي تتطلب جهدًا يدويًا أقل، وتُحقق استخلاصًا جيدًا للعينات، كما يسهل تنظيفها بين العينات. من مزايا هذه التقنية زيادة إنتاجية البروتينات والأحماض النووية من عينات الأنسجة الصغيرة والصلبة، لا سيما عند استخدامها كخطوة تمهيدية لطرق تكسير الخلايا الميكانيكية أو الكيميائية/بالمذيبات المذكورة سابقًا.

منذ أربعينيات القرن العشرين، استُخدم الضغط العالي كوسيلة لتفتيت الخلايا، ولا سيما باستخدام مكبس الخلايا بالضغط الفرنسي (French Press). طُوِّرت هذه الطريقة على يد تشارلز ستايسي فرينش، وتعتمد على الضغط العالي لدفع الخلايا عبر فتحة ضيقة، مما يؤدي إلى تحللها نتيجة لقوى القص الناتجة عن فرق الضغط. ^{[ 5 ] [ 6 ]} ورغم أن مكابس الضغط الفرنسي أصبحت عنصرًا أساسيًا في العديد من مختبرات علم الأحياء الدقيقة، إلا أن إنتاجها توقف إلى حد كبير، مما أدى إلى ظهور تطبيقات بديلة لتقنية مماثلة.

تعمل أجهزة تفتيت الخلايا الفيزيائية الحديثة عادةً بالضغط الهوائي أو الهيدروليكي. ورغم أن الأجهزة الهوائية أقل تكلفة في الغالب، إلا أن أداءها قد يكون غير موثوق به بسبب تقلبات ضغط المعالجة خلال شوط مضخة الهواء. ويُعتقد عمومًا أن الأجهزة الهيدروليكية توفر قدرة تفتيت فائقة، خاصةً عند معالجة عينات يصعب تفتيتها مثل الخميرة أو البكتيريا موجبة الجرام ، وذلك لقدرتها على الحفاظ على ضغط ثابت طوال شوط المكبس. وبما أن مكبس القهوة الفرنسي، الذي يعمل بالضغط الهيدروليكي، قادر على تفتيت أكثر من 90% من معظم أنواع الخلايا الشائعة الاستخدام، فإنه يُعتبر غالبًا المعيار الذهبي في أداء التفتيت، وكثيرًا ما تُقارن به الأجهزة الحديثة ليس فقط من حيث كفاءة التفتيت، بل أيضًا من حيث السلامة وسهولة الاستخدام. كما يحاول بعض المصنّعين تحسين التصميم التقليدي بتغيير خصائص هذه الأجهزة الأخرى غير الضغط الذي يدفع العينة عبر الفتحة. ومن الأمثلة على ذلك شركة Constant Systems، التي أظهرت مؤخرًا أن أجهزة تفتيت الخلايا الخاصة بها لا تُضاهي أداء مكبس القهوة الفرنسي التقليدي فحسب، بل إنها تسعى أيضًا إلى تحقيق النتائج نفسها باستهلاك طاقة أقل بكثير. ^{[ 7 ]}

تقنية دورات الضغط ("PCT"). تُعدّ تقنية دورات الضغط منصة تقنية حاصلة على براءة اختراع، تستخدم دورات متناوبة من الضغط الهيدروستاتيكي بين الضغط الجوي ومستويات عالية جدًا (تصل إلى 90,000 رطل لكل بوصة مربعة) للتحكم بأمان وسهولة وبشكل قابل للتكرار في عمل الجزيئات في العينات البيولوجية، مثل تمزق (تحلل) الخلايا والأنسجة من مصادر بشرية وحيوانية ونباتية وميكروبية، وتعطيل مسببات الأمراض. تعالج الأنظمة المُحسّنة بتقنية دورات الضغط (الأجهزة والمواد الاستهلاكية) بعض المشكلات الصعبة المتأصلة في تحضير العينات البيولوجية. تشمل مزايا تقنية دورات الضغط ما يلي: (أ) استخلاص واستعادة المزيد من البروتينات الغشائية، (ب) تحسين هضم البروتين، (ج) التحلل التفاضلي في قاعدة عينة مختلطة، (د) تعطيل مسببات الأمراض، (هـ) زيادة الكشف عن الحمض النووي، و(و) تحكم دقيق في عملية تحضير العينات. ^{[ 8 ]}

تؤثر طريقة الميكروفلويدايزر المستخدمة في تكسير الخلايا بشكل كبير على الخصائص الفيزيائية والكيميائية لمعلق الخلايا المتحللة ، مثل حجم الجسيمات، واللزوجة، وإنتاج البروتين، ونشاط الإنزيمات. وقد اكتسبت هذه الطريقة شعبية واسعة في السنوات الأخيرة في مجال تكسير الخلايا نظرًا لسهولة استخدامها وكفاءتها في تكسير أنواع عديدة من الخلايا. تم ترخيص تقنية الميكروفلويدايزر من شركة آرثر دي ليتل، وطُوّرت واستُخدمت لأول مرة في ثمانينيات القرن الماضي، حيث بدأت كأداة لإنتاج الليبوسومات . ومنذ ذلك الحين، استُخدمت في تطبيقات أخرى، مثل تكسير الخلايا في المستحلبات النانوية ، وتقليل حجم الجسيمات الصلبة، وغيرها.

باستخدام قنوات دقيقة ذات هندسة ثابتة ومضخة مكثفة، يتم توليد معدلات قص عالية تؤدي إلى تمزق الخلايا. يمكن لهذه الطريقة في تحلل الخلايا أن تؤدي إلى تمزق أكثر من 90% من خلايا الإشريكية القولونية. ^{[ 9 ]}

تتميز العديد من البروتينات بحساسيتها الشديدة للحرارة، وفي كثير من الحالات قد تبدأ بالتلف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية فقط. داخل القنوات الدقيقة، تتجاوز درجات الحرارة 4 درجات مئوية، ولكن الجهاز مصمم للتبريد السريع بحيث تكون مدة تعرض الخلايا لدرجات الحرارة المرتفعة قصيرة للغاية ( زمن الإقامة من 25 إلى 40 مللي ثانية). بفضل هذا التحكم الفعال في درجة الحرارة، يُنتج جهاز Microfluidizer مستويات أعلى من البروتينات والإنزيمات النشطة مقارنةً بالطرق الميكانيكية الأخرى عندما تكون البروتينات حساسة للحرارة. ^{[ 10 ]}

تُلاحظ تغيرات اللزوجة أيضًا عند تفتيت الخلايا. فإذا كانت لزوجة معلق الخلايا عالية، فقد يُصعّب ذلك عمليات المعالجة اللاحقة، مثل الترشيح والمعايرة الدقيقة. أما تغيرات اللزوجة التي تُلاحظ مع جهاز الميكروفلويدايزر فهي منخفضة نسبيًا، وتتناقص مع كل دورة إضافية في الجهاز. ^{[ 11 ]}

على عكس طرق التفتيت الميكانيكية الأخرى، يقوم جهاز الميكروفلويدايزر بتفتيت أغشية الخلايا بكفاءة ولطف، مما ينتج عنه شظايا كبيرة نسبياً من جدار الخلية (450  نانومتر)، وبالتالي يسهل فصل محتويات الخلية. وهذا بدوره قد يؤدي إلى تقليل أوقات الترشيح وتحسين عملية الفصل بالطرد المركزي. ^{[ 12 ]}

تتراوح تقنية الموائع الدقيقة من ملليلتر واحد إلى آلاف اللترات.

في عملية تخفيف الضغط باستخدام النيتروجين، تُذاب كميات كبيرة من النيتروجين أولاً في الخلية تحت ضغط عالٍ داخل وعاء ضغط مناسب . ثم، عند تحرير ضغط الغاز فجأة، يخرج النيتروجين من المحلول على شكل فقاعات متمددة تُمدد أغشية كل خلية حتى تتمزق وتُطلق محتوياتها.

يُعدّ تخفيف الضغط بالنيتروجين أكثر حمايةً للإنزيمات والعضيات من طرق التجنيس بالموجات فوق الصوتية والميكانيكية، ويُقارن بشكلٍ إيجابي مع التأثير التفكيكي المُتحكّم به الذي يتم الحصول عليه في مُجانس الهاون والمدقة المصنوع من مادة PTFE والزجاج. ^{[ 13 ]} في حين تعتمد طرق التفكيك الأخرى على الاحتكاك أو القص الميكانيكي الذي يُولّد الحرارة، فإنّ إجراء تخفيف الضغط بالنيتروجين مصحوب بتمدد أديباتي يُبرّد العينة بدلاً من تسخينها.

توفر طبقة من غاز النيتروجين الخامل، التي تشبع معلق الخلايا والمتجانس، حمايةً لمكونات الخلايا من الأكسدة . ورغم استخدام غازات أخرى، مثل ثاني أكسيد الكربون وأكسيد النيتروز وأول أكسيد الكربون والهواء المضغوط، في هذه التقنية، يُفضل استخدام النيتروجين لكونه غير متفاعل ، ولأنه لا يُغير درجة حموضة الوسط المعلق. إضافةً إلى ذلك، يُفضل النيتروجين لتوفرّه عمومًا بتكلفة منخفضة وضغوط مناسبة لهذه العملية.

بمجرد إطلاقها، لا تتعرض المواد الخلوية للتآكل المستمر الذي قد يُفسد العينة أو يُسبب تلفًا غير مرغوب فيه. لا حاجة لمراقبة ذروة العلاقة بين نشاط الإنزيم ونسبة التفكك. نظرًا لتكوّن فقاعات النيتروجين داخل كل خلية، تُطبّق نفس قوة التفكك بشكل موحد في جميع أنحاء العينة، مما يضمن تجانسًا استثنائيًا في المنتج. يُمكن إنتاج مستخلصات متجانسة خالية من الخلايا.

تُستخدم هذه التقنية لتجانس الخلايا والأنسجة، وإطلاق العضيات السليمة ، وإعداد أغشية الخلايا ، وإطلاق المواد الكيميائية الحيوية غير المستقرة ، وإنتاج متجانسات موحدة وقابلة للتكرار دون تعريض العينة لإجهاد كيميائي أو فيزيائي شديد.

تُعدّ هذه الطريقة مناسبةً بشكلٍ خاص لمعالجة خلايا الثدييات والخلايا الأخرى ذات الأغشية الخلوية. ^{[ 14 ]} كما استُخدمت بنجاحٍ في معالجة الخلايا النباتية ، وإطلاق الفيروسات من البويضات المخصبة ، ومعالجة البكتيريا الهشة . لا يُنصح باستخدامها مع الخلايا البكتيرية غير المعالجة. لا تستجيب الخميرة والفطريات والأبواغ وغيرها من المواد ذات الجدران الخلوية الصلبة بشكلٍ جيد لهذه الطريقة.