التشريح المجهري بالتقاط الليزر

📅 آخر تحديث: ٢٥ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٥ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 3 صور
الموسوعة الحرة
نقل خلايا ظهارية نقية من قنوات الثدي بتقنية التشريح المجهري بالليزر . تُظهر اللوحة اليسرى مقطعًا نسيجيًا مع إزالة خلايا مُختارة. تُظهر اللوحة اليمنى خلايا ظهارية معزولة على غشاء النقل.

التشريح المجهري بالتقاط الليزر ( LCM )، والذي يسمى أيضًا التشريح المجهري ، أو التشريح المجهري بالليزر ( LMD )، أو التشريح المجهري بمساعدة الليزر ( LMD أو LAM )، هو طريقة لعزل خلايا معينة ذات أهمية من مناطق مجهرية من الأنسجة / الخلايا / الكائنات الحية [ 1 ] [ 2 ] ( التشريح على نطاق مجهري بمساعدة الليزر ).

مبدأ

التشريح المجهري بالليزر (LCM) هو أسلوبٌ لاستخلاص مجموعات فرعية من خلايا الأنسجة تحت رؤية مجهرية مباشرة. تُمكّن تقنية LCM من استخلاص الخلايا المطلوبة مباشرةً، أو عزل خلايا مُحددة عن طريق إزالة الخلايا غير المرغوب فيها، ما يُنتج مجموعات خلوية نقية نسيجيًا. تتعدد تطبيقات هذه التقنية، منها: تحديد النمط الجيني للحمض النووي (DNA) وتحليل فقدان التغاير الزيجوتي (LOH)، وتحديد خصائص نسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) ، وإنشاء مكتبات الحمض النووي التكميلي (cDNA) ، واكتشاف البروتينات ، وتحديد مسارات الإشارات الخلوية. يستغرق تنفيذ هذا البروتوكول عادةً من ساعة إلى ساعة ونصف. [ 3 ]

اِستِخلاص

يُوصل شعاع ليزر بالمجهر ، ويُركز على النسيج الموجود على الشريحة. وبتحريك الليزر بواسطة العدسات أو المنصة، يتبع التركيز مسارًا محددًا مسبقًا من قِبل المستخدم. يُقطع هذا المسار، الذي يُسمى أيضًا العنصر ، ويُفصل عن النسيج المجاور. بعد عملية القطع، يجب إجراء عملية استخراج إذا لزم الأمر. وتستخدم التقنيات الحديثة التشريح المجهري غير التلامسي.

توجد عدة طرق لاستخلاص الأنسجة من شريحة مجهرية عليها عينة نسيجية مرضية . إحدى هذه الطرق هي الضغط على سطح لاصق على العينة ثم نزعها. تستخلص هذه الطريقة المنطقة المطلوبة، ولكنها قد تزيل أيضًا جزيئات أو أنسجة غير مرغوب فيها من السطح، لأن السطح غير انتقائي. طريقة أخرى هي صهر غشاء بلاستيكي على العينة ثم نزعه. يتم تسخين الغشاء، على سبيل المثال، باستخدام ليزر أحمر أو ليزر تحت أحمر، بعد تلوينه بصبغة ماصة. ولأن هذا يلتصق بالغشاء، كما هو الحال مع أي غشاء يوضع بالقرب من سطح العينة النسيجية المرضية، فقد يتم استخلاص بعض الشوائب. ومن المخاطر الأخرى الحرارة المُطبقة: فبعض الجزيئات، مثل الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA والبروتينات، لا تتحمل التسخين المفرط أو حتى التسخين على الإطلاق بهدف عزلها بأعلى درجة نقاء ممكنة.

للنقل دون تلامس، توجد ثلاث طرق مختلفة: النقل بالجاذبية باستخدام مجهر عمودي (يُسمى GAM، التشريح المجهري بمساعدة الجاذبية )، أو النقل بواسطة مقلاع ضغط الليزر ؛ ويستخدم أحدث جيل تقنية تعتمد على النقل الأمامي المُحفز بالليزر (LIFT). في طريقة القطع والالتقاط، يُوضع غطاء مُغطى بمادة لاصقة مباشرةً على مقطع  نسيجي رقيق (5-8 ميكرومتر)، حيث يستقر المقطع نفسه على غشاء رقيق (بولي إيثيلين نافثالين). يُسخن ليزر الأشعة تحت الحمراء المادة اللاصقة على الغطاء برفق، مما يؤدي إلى دمجه مع النسيج الأساسي، بينما يقطع ليزر الأشعة فوق البنفسجية النسيج والغشاء الأساسي. يلتصق كيان الغشاء والنسيج الآن بالغطاء، ويمكن استخدام الخلايا الموجودة على الغطاء في تطبيقات لاحقة (تحليل الحمض النووي DNA، والحمض النووي الريبوزي RNA، والبروتين). [ 4 ]

إجراء

التشريح المجهري بالتقاط الليزر

باستخدام المجهر وبرنامج حاسوبي، تُفحص شريحة نسيجية (يتراوح سمكها عادةً بين 5 و50 ميكرومترًا)، وتُحدد الخلايا المفردة أو تجمعات الخلايا إما يدويًا أو بطرق شبه آلية أو آلية بالكامل، مما يسمح بتصوير الخلايا ثم اختيارها تلقائيًا لعزلها. توجد حاليًا ست تقنيات أساسية لعزل الخلايا وجمعها، تستخدم المجهر وجهازًا خاصًا. أربع من هذه التقنيات تستخدم عادةً ليزرًا نبضيًا فوق بنفسجيًا (355  نانومترًا) لقطع الأنسجة مباشرةً أو الأغشية/الفيلم، وأحيانًا بالاشتراك مع ليزر الأشعة تحت الحمراء المسؤول عن تسخين/إذابة بوليمر لاصق لضمان التصاق الخلايا وعزلها. يوفر ليزر الأشعة تحت الحمراء طريقةً ألطف للتشريح المجهري. أما التقنية الخامسة، فتعتمد على الليزر فوق البنفسجي وتستخدم شرائح خاصة مطلية بطبقة ناقلة للطاقة، والتي عند تنشيطها بنبضة الليزر، تدفع النسيج أو الخلايا إلى غطاء التجميع.

عادةً ما يكون عرض القطع بالليزر أقل من 1  ميكرومتر، وبالتالي لا تتأثر الخلايا المستهدفة بشعاع الليزر. حتى الخلايا الحية لا تتضرر من القطع بالليزر، وتبقى قابلة للحياة بعد القطع للاستنساخ وإعادة الاستزراع حسب الحاجة. [ 5 ]

تختلف التقنيات المختلفة في عملية جمع العينات، وطرق التصوير المتاحة ( المجهر الفلوري / المجهر ذو المجال الساطع / مجهر التباين التفاضلي التداخلي / مجهر التباين الطوري /إلخ)، وأنواع الحوامل وتحضير الأنسجة اللازمة قبل التصوير والعزل. معظمها أنظمة مخصصة للتشريح المجهري، ويمكن استخدام بعضها كمجاهر بحثية أيضًا، بينما تستخدم تقنية واحدة فقط (رقم 2 هنا، لايكا) مجهرًا رأسيًا، مما يحدّ من بعض إمكانيات التعامل مع العينات، خاصةً عند العمل على الخلايا الحية.

تعتمد التقنية الأولى (المستخدمة في جهاز كارل زايس بالم) على قطع العينة ثم جمعها بتقنية "القذف". تُقذف العينة من شريحة أو طبق زراعة خاص بواسطة نبضة ليزر فوق بنفسجي غير مركزة، تولد قوة ضوئية تدفع المادة بعيدًا عن الشريحة/الطبق، وهي تقنية تُعرف أحيانًا باسم القذف بالضغط في التشريح المجهري بالليزر (LMPC). تُرسل المادة المُشَرَّحة لأعلى (حتى عدة ملليمترات) إلى غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق أو أي جامع آخر يحتوي إما على محلول منظم أو مادة لاصقة متخصصة في غطاء الأنبوب تلتصق بها الأنسجة. تتجنب عملية القذف النشطة هذه بعض المشاكل الثابتة التي تحدث عند استخدام الشرائح المطلية بغشاء. [ 6 ]

تعتمد عملية أخرى على طريقة التشريح المجهري بمساعدة الجاذبية، حيث تُستخدم الجاذبية لجمع العينات في غطاء الأنبوب أسفل الشريحة المستخدمة (كما هو الحال في نظام ION LMD من شركة Jungwoo F&B). في هذا النظام، تُحرّك المنصة الآلية لقطع الخلايا المستهدفة مع تثبيت شعاع الليزر. ويستخدم النظام ليزر الحالة الصلبة بطول موجي  355 نانومتر ( UV-A )، وهو الطريقة الأكثر أمانًا لقطع الأنسجة دون إتلاف الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو الحمض النووي (DNA). [ 7 ]

هناك عملية أخرى وثيقة الصلة بتقنية فصل الخلايا بالليزر (تستخدمها شركة لايكا) تقوم بقطع العينة من الأعلى، ثم تسقط العينة بفعل الجاذبية (التشريح المجهري بمساعدة الجاذبية) في جهاز التقاط أسفلها. [ 8 ] ويكمن الاختلاف عن العملية السابقة في أن شعاع الليزر هنا يتحرك لقطع الأنسجة بواسطة مرآة ثنائية اللون متحركة.

عندما تكون الخلايا المختارة (على شريحة أو طبق زراعة خاص) في مركز مجال الرؤية، يختار المشغل الخلايا المطلوبة باستخدام برنامج الجهاز. يتم عزل المنطقة المراد عزلها إما بتسليط ليزر الأشعة تحت الحمراء القريبة لتنشيط غشاء النقل الموجود على غطاء موضوع على عينة النسيج، مما يؤدي إلى إذابة المادة اللاصقة التي تدمج الغشاء مع الخلايا المختارة الموجودة أسفله (انظر أنظمة أركتوروس)؛ أو بتنشيط ليزر الأشعة فوق البنفسجية لقطع الخلية المطلوبة. بعد ذلك، تُرفع الخلايا عن شريحة النسيج الرقيقة، تاركةً جميع الخلايا غير المرغوب فيها. ثم تُفحص الخلايا المطلوبة وتُوثق قبل استخلاصها. [ 9 ]

تُقدّم التقنية الرابعة القائمة على الأشعة فوق البنفسجية (المستخدمة من قبل شركة Molecular Machines and Industries AG) اختلافًا طفيفًا عن التقنية الثالثة هنا، حيث تقوم أساسًا بإنشاء ما يشبه الساندويتش، مع شريحة > عينة > وغشاء يغطي العينة، وذلك باستخدام شريحة إطار يتم قطع سطح غشائها بواسطة الليزر، ثم يتم التقاطها من الأعلى بواسطة غطاء لاصق خاص. [ 10 ]

تعتمد تقنية خامسة على الأشعة فوق البنفسجية، وتستخدم شرائح زجاجية قياسية مطلية بطبقة خاملة لنقل الطاقة، ونظام تشريح دقيق بالليزر يعمل بالأشعة فوق البنفسجية (عادةً ما يكون جهاز Leica LMD أو PALM من Zeiss). تُثبّت مقاطع الأنسجة فوق طبقة نقل الطاقة. عند اصطدام الليزر بالأشعة فوق البنفسجية بالطبقة، تتحول الطاقة إلى طاقة حركية، مما يؤدي إلى تبخيرها ودفع أجزاء محددة من الأنسجة فورًا إلى أنبوب التجميع. توفر الشرائح المطلية بتقنية نقل الطاقة، والتي تُسوّق تجاريًا تحت الاسم التجاري DIRECTOR slides من قِبل شركة Expression Pathology Inc. (روكفيل، ماريلاند)، العديد من المزايا في مجال علم البروتينات. كما أنها لا تُظهر تألقًا ذاتيًا، مما يسمح باستخدامها في تطبيقات تعتمد على الصبغات الفلورية، أو تقنية التباين التفاضلي التداخلي (DIC)، أو الضوء المستقطب. [ 11 ]

بالإضافة إلى مقاطع الأنسجة، يمكن إجراء تقنية فصل الخلايا بالليزر على الخلايا الحية/الكائنات الحية، ومسحات الخلايا، وتحضيرات الكروموسومات، والأنسجة النباتية.

التطبيقات

لا تُغيّر عملية التشريح المجهري بالليزر أو تُلحق الضرر ببنية أو تركيب العينة المجمعة، ولا بالخلايا المحيطة بها. ولذلك، تُعدّ هذه التقنية طريقةً فعّالةً لجمع خلايا مُختارة لتحليل الحمض النووي (DNA ) والحمض النووي الريبوزي (RNA) و/أو البروتينات . كما استُخدمت هذه التقنية لعزل التراكيب غير الخلوية، مثل لويحات الأميلويد . [ 12 ] يُمكن إجراء التشريح المجهري بالليزر على مجموعة متنوعة من عينات الأنسجة ، بما في ذلك مسحات الدم ، والتحضيرات الخلوية، [ 13 ] ومزارع الخلايا، وعينات من الأنسجة الصلبة. كما يُمكن استخدام الأنسجة المحفوظة المجمدة والمُضمنة في البارافين. [ 14 ]

الأنظمة

اعتبارًا من عام 2025، يوجد مزودان رئيسيان لأنظمة التشريح المجهري بمساعدة الليزر: لايكا مايكروسيستمز وإم إم آي. أما المزودان الرئيسيان السابقان زايس وأركتوروس فقد أوقفا إنتاج أنظمتهما.

التشريح المجهري باستخدام شعاع الليزر الدقيق (نظام LMD، شركة لايكا مايكروسيستمز)

يجمع نظام LMD بين مجهر عمودي وليزر فوق بنفسجي. وباستخدام تقنية التشريح المجهري بالليزر (LMD)، يمكن استئصال مناطق محددة من مقطع نسيجي، وصولاً إلى الخلايا المفردة أو الكروموسومات، دون تلامس باستخدام ليزر فوق بنفسجي نابض. يتم توجيه شعاع ليزر مركز على طول محيط المناطق المختارة. في نظام Leica LMD، تُنقل المادة المُشَرَّحة دون تلامس إلى مُجمِّع بفعل الجاذبية. ويمكن استخدام مواد استهلاكية متنوعة كحوامل للشرائح حسب التطبيق المقصود.

نظام MMI

تعتمد تقنية التشريح المجهري بالليزر، المستخدمة من قبل شركة Molecular Machines and Industries GmbH (MMI) والمصممة للاستخدام مع المجاهر المقلوبة، على ليزر فوق بنفسجي. يتضمن تحضير العينة "طريقة الساندويتش"، حيث توضع العينة بين شريحة غشائية خاملة وشريحة زجاجية. يقوم ليزر الأشعة فوق البنفسجية بقطع المنطقة المستهدفة بدقة. ثم تُرفع العينة المعزولة، مع الغشاء، بواسطة "غطاء لاصق" - وهو غطاء لاصق لوعاء التفاعل. ونظرًا لأن العينة لا تلامس الغطاء اللاصق أبدًا بفضل بنية الساندويتش، يتم ضمان جمع عينة خالية من التلوث.

يدعم نظام MMI عزل العينات بشكل آلي بالكامل، ويمكن إجراؤه إما باستخدام أغطية لاصقة أو مباشرةً في صفيحة ذات 96 بئراً. هذه التقنية مناسبة لتحليل الخلايا المفردة. يستطيع برنامج مدعوم بالذكاء الاصطناعي تحديد الخلايا الفردية على الشريحة ثم عزلها تلقائياً باستخدام تقنية التشريح المجهري بالليزر.

مقارنة بين نظام MMI ونظام Leica Microsystems

أجرت دراسة مقارنة عام 2024 فحصاً لكفاءة جمع العينات في نظام MMI مقابل نظام Leica Microsystems القائم على الجاذبية. أظهر نظام MMI كفاءة استعادة عينات بنسبة 100%، بينما أظهر نظام Leica فقداناً متكرراً للعينات. [ 15 ]

مراجع

  1. ↑ إيمرت-باك إم آر، بونر آر إف، سميث بي دي، تشواكي آر إف، تشوانغ زد، غولدشتاين إس آر، فايس آر إيه، ليوتا إل إيه (1996). "التشريح المجهري بالتقاط الليزر". مجلة ساينس . 274 (5289): 998-1001 . رمز Bibcode : 1996Sci...274..998E . CiteSeerX 10.1.1.462.2914 . doi : 10.1126/science.274.5289.998 . PMID 8875945. S2CID 32921237 .   رمز الوصول المغلق
  2. ↑ إسبينيا ف، هيبي م، بيروبون م، ليوتا ل.أ. (2007). " تقنية التشريح المجهري بالتقاط الليزر". مجلة الخبراء في التشخيص الجزيئي 7 ( 5): 647-657 . doi : 10.1586/14737159.7.5.647 . PMID 17892370. S2CID 46548538 .  رمز الوصول المغلق
  3. ^ إسبينا الخامس، وولفكولي دينار أردني، كالفرت VS، فانميتر أ، تشو دبليو، كوكوس جي، جيهو دي إتش، بيتريكوين III إي إف، ليوتا لا (2006-07-01). “تشريح مجهري لالتقاط الليزر”. بروتوكولات الطبيعة . 1 (2): 586-603 . سيتيسيركس 10.1.1.462.2914 . دوى : 10.1038/nprot.2006.85 . ردمك 1754-2189 . بميد 17406286 . S2CID 1134441 .    رمز الوصول المغلق
  4. ↑ فريق العمل. "بروتوكول مُحسَّن لتركيب مقاطع الأنسجة على شرائح غشائية من البولي إيثيلين جليكول (البروتوكول رقم 9)" (ملف PDF) . معدات BM . شركة أركتوروس للعلوم البيولوجية. رقم المنتج 14191-00، الإصدار أ. مؤرشف من النسخة الأصلية (ملف PDF) بتاريخ 4 مارس 2016. تاريخ الاطلاع: 19 فبراير 2016 .
  5. ↑ فريق العمل. "الأسئلة الشائعة العامة حول جهاز MMI CellCut Plus/MMI SmartCut Plus" . مجلة الآلات والصناعات الجزيئية. هل يُلحق الليزر ضررًا بالأنسجة المحيطة؟ (مؤرشف من الأصل بتاريخ ١٢ فبراير ٢٠١٣).
  6. ↑ "التشريح المجهري بالليزر والقذف بالضغط (LMPC)" . مركز التصوير الخلوي (CCI) . جامعة غوتنبرغ. 25 نوفمبر 2010. مؤرشف من الأصل في 1 يوليو 2017. تم الاطلاع عليه في 27 أكتوبر 2011 .
  7. ↑ "لماذا يوصف أكيوفيو؟" . 23 يونيو 2017.
  8. ↑ "مرفق التصوير المجهري متحد البؤر" . المركز الطبي بجامعة كانساس. مؤرشف من الأصل في 11 يوليو 2011. تم الاطلاع عليه في 28 أكتوبر 2011 .
  9. ↑ "LCM" . joepham004. 19 مايو 2008. مؤرشف من الأصل في 19 ديسمبر 2021. تم الاسترجاع في 27 يونيو 2012 .
  10. ↑ "التشريح المجهري بالليزر باستخدام نظام MMI" . شركة Molecular Machines and Industries AG. 9 مايو 2012. مؤرشف من الأصل بتاريخ 19 ديسمبر 2021. تم الاطلاع عليه بتاريخ 27 يونيو 2012 .
  11. ↑ "طرق الرفع بالأغشية الرقيقة" . web.psi. مؤرشف من الأصل في 25 أبريل 2012. تم الاطلاع عليه في 27 يونيو 2012 .
  12. ↑ لاروشيل ، س. (ديسمبر 2015). "الدوس على القطع". مجلة نيتشر ميثودز . 12 (12): 1114. doi : 10.1038/nmeth.3679 . PMID 26962581. S2CID 42051029 .  ( التسجيل مطلوب )
  13. ↑ أوربا واي، تاناكا إس، نيشيهارا إتش، كاوامورا إن، إيتوه تي، شيميزو إم، ساوا إتش، ناغاشيما كيه (2003). "تطبيق تقنية التشريح المجهري بالليزر على العينات الخلوية للكشف عن إعادة ترتيب جين السلسلة الثقيلة للغلوبولين المناعي لدى مرضى سرطان الغدد الليمفاوية الخبيث" . مجلة السرطان . 99 (4): 198-204 . doi : 10.1002/cncr.11331 . PMID 12925980 . 
  14. ^ كيهارا آه، موريسكوت AS، فيريرا بي جيه، هاماساكي دي (2005). “حماية الحمض النووي الريبي (RNA) في الأنسجة الثابتة: طريقة بديلة لمستخدمي LCM”. طرق علم الأعصاب ياء . 148 (2): 103– 7. دوى : 10.1016/j.jneumeth.2005.04.019 . بميد 16026852 . S2CID 20606196 .  
  15. ^ شو، يانفن؛ وانغ شي. لي يوان. ماو، يهينج؛ سو، ييران؛ ماو، ييزي؛ يانغ، يون؛ جاو، وينا؛ فو، تشانغيينغ؛ تشن، ويندونغ؛ أنتم، شيويتينغ؛ ليانغ، فوتشاو؛ باي، بانتشو؛ صن، ينغ؛ لي ، شينغ بينغ (2024/11/21). "البروتينات المكانية متعددة الوسائط التي تم حلها بالخلية الواحدة تكشف عن عدم تجانس ورم البنكرياس" . اتصالات الطبيعة . 15 (1): 10100. دوى : 10.1038/s41467-024-54438-0 . ISSN 2041-1723 . بمك 11582669 . بميد 39572534 .   
  • جامعة كارولينا الشرقية: دورة إدارة دورة حياة المنتج للمبتدئين
  • مشروع أطلس النسخ الجيني في جامعة ييل وأريزون باستخدام تقنية التشريح المجهري بالليزر