مصفوفة البروتين

تُعدّ مصفوفة البروتين (أو رقاقة البروتين ) طريقةً عالية الإنتاجية تُستخدم لتتبّع تفاعلات البروتينات ونشاطها، وتحديد وظائفها على نطاق واسع. ^{[ 1 ]} وتكمن ميزتها الرئيسية في إمكانية تتبّع أعداد كبيرة من البروتينات بالتوازي. تتكوّن الرقاقة من سطح داعم، مثل شريحة زجاجية أو غشاء نيتروسليلوز أو خرزة أو صفيحة معايرة دقيقة ، تُثبّت عليه مصفوفة من بروتينات الالتقاط. ^{[ 2 ]} تُضاف جزيئات المجس ، التي تُوسَم عادةً بصبغة فلورية، إلى المصفوفة. يُصدر أي تفاعل بين المجس والبروتين المُثبّت إشارة فلورية تُقرأ بواسطة ماسح ليزري . ^{[ 3 ]} تتميّز مصفوفات البروتين بالسرعة والأتمتة والاقتصادية والحساسية العالية، إذ تستهلك كميات صغيرة من العينات والكواشف. ^{[ 4 ]} طُرح مفهوم ومنهجية المصفوفات الدقيقة للبروتين لأول مرة ووُضِّح في المصفوفات الدقيقة للأجسام المضادة (المعروفة أيضًا باسم مصفوفة الأجسام المضادة ) عام 1983 في منشور علمي ^{[ 5 ]} وسلسلة من براءات الاختراع. ^{[ 6 ]} كان تطوير تقنية الإنتاجية العالية الكامنة وراء المصفوفة الدقيقة للبروتين سهلًا نسبيًا، نظرًا لاعتمادها على التقنية المُطوَّرة للمصفوفات الدقيقة للحمض النووي ، ^{[ 7 ]} والتي أصبحت المصفوفات الدقيقة الأكثر استخدامًا على نطاق واسع .

طُوِّرت المصفوفات الدقيقة للبروتينات نظرًا لمحدودية استخدام المصفوفات الدقيقة للحمض النووي لتحديد مستويات التعبير الجيني في علم البروتينات . فكمية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) في الخلية غالبًا لا تعكس مستويات التعبير عن البروتينات التي يُمثلها. ولأن البروتين، وليس الحمض النووي الريبوزي الرسول، هو الذي يؤدي الدور الوظيفي في استجابة الخلية، فقد برزت الحاجة إلى نهج جديد. إضافةً إلى ذلك، فإن التعديلات اللاحقة للترجمة ، والتي غالبًا ما تكون حاسمة لتحديد وظيفة البروتين، لا تظهر على المصفوفات الدقيقة للحمض النووي. ^{[ 8 ]} تحل المصفوفات الدقيقة للبروتينات محل تقنيات علم البروتينات التقليدية، مثل الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد أو الاستشراب ، والتي كانت تستغرق وقتًا طويلاً وتتطلب جهدًا كبيرًا، كما أنها غير مناسبة لتحليل البروتينات قليلة الوفرة.

تُرتب البروتينات على سطح صلب، مثل شرائح المجهر أو الأغشية أو الخرز أو صفائح المعايرة الدقيقة. وظيفة هذا السطح هي توفير دعامة لتثبيت البروتينات. يجب أن يُظهر هذا السطح أعلى خصائص ارتباط، مع الحفاظ على البروتين في بنيته الأصلية لضمان قدرته على الارتباط. تُعد شرائح المجهر المصنوعة من الزجاج أو السيليكون خيارًا شائعًا نظرًا لتوافقها مع أجهزة الترتيب الآلية والماسحات الضوئية الليزرية المتوفرة بسهولة، والتي طُوّرت لتقنية مصفوفات الحمض النووي الدقيقة. تُعتبر شرائح أغشية النيتروسليلوز على نطاق واسع أفضل ركيزة لارتباط البروتينات في تطبيقات مصفوفات البروتينات الدقيقة.

يُغطى السطح الصلب المُختار بطبقة طلاء يجب أن تؤدي وظائف متعددة في آنٍ واحد، وهي تثبيت البروتين، ومنع تمسخه ، وتوجيهه في الاتجاه المناسب لضمان سهولة الوصول إلى مواقع ارتباطه، وتوفير بيئة محبة للماء لحدوث تفاعل الارتباط. كما يجب أن تُظهر هذه الطبقة أقل قدر من الارتباط غير النوعي لتقليل التشويش في أنظمة الكشف. علاوة على ذلك، يجب أن تكون متوافقة مع أنظمة الكشف المختلفة. تشمل عوامل التثبيت طبقات من الألومنيوم أو الذهب، والبوليمرات المحبة للماء، وهلامات البولي أكريلاميد ، أو المعالجة بالأمينات أو الألدهيدات أو الإيبوكسي . تُستخدم تقنيات الأغشية الرقيقة، مثل الترسيب الفيزيائي للبخار (PVD) والترسيب الكيميائي للبخار (CVD)، لتطبيق الطلاء على سطح الدعامة.

يُعدّ توفير بيئة مائية أمرًا ضروريًا في جميع مراحل تصنيع وتشغيل المصفوفات لمنع تلف البروتينات. ولذلك، تحتوي محاليل العينات على نسبة عالية من الجلسرين (لخفض درجة التجمد)، ويتم ضبط رطوبة بيئة التصنيع بدقة. تتميز الحُجيرات الدقيقة بميزة مزدوجة، فهي توفر بيئة مائية وتمنع التلوث المتبادل بين العينات.

في النوع الأكثر شيوعًا من مصفوفات البروتين، تقوم الروبوتات بوضع أعداد كبيرة من البروتينات أو روابطها على دعامة صلبة مطلية بنمط محدد مسبقًا. يُعرف هذا باسم الطباعة الروبوتية التلامسية أو التبقع الروبوتي. وهناك طريقة تصنيع أخرى هي الطباعة النفاثة للحبر ، وهي طريقة غير تلامسية تعتمد على التقطير عند الطلب لتوزيع بوليمرات البروتين على السطح الصلب بالنمط المطلوب. ^{[ 9 ]} أما التبقع الكهروإجهادي فهو طريقة مشابهة للطباعة النفاثة للحبر. يتحرك رأس الطباعة عبر المصفوفة، ويستخدم في كل نقطة تحفيزًا كهربائيًا لتوصيل جزيئات البروتين إلى السطح عبر نفاثات دقيقة. وهذه أيضًا عملية غير تلامسية. ^{[ 10 ]} وتُعد الطباعة الضوئية طريقة رابعة لترتيب البروتينات على السطح. يُستخدم الضوء مع أقنعة ضوئية ، وهي عبارة عن ألواح معتمة بها ثقوب أو أجزاء شفافة تسمح بمرور الضوء بنمط محدد. ثم تُمكّن سلسلة من المعالجات الكيميائية من ترسيب البروتين بالنمط المطلوب على المادة الموجودة أسفل القناع الضوئي. ^{[ 11 ]}

قد تكون جزيئات الالتقاط المرتبة على السطح الصلب أجسامًا مضادة ، أو مستضدات ، أو أبتاميرات (روابط قائمة على الأحماض النووية)، أو أفيبوديات (جزيئات صغيرة مصممة لمحاكاة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة)، أو بروتينات كاملة الطول. تشمل مصادر هذه البروتينات أنظمة التعبير الخلوية للبروتينات المؤتلفة ، والتنقية من مصادر طبيعية، والإنتاج في المختبر بواسطة أنظمة الترجمة الخالية من الخلايا ، والطرق التركيبية للببتيدات . يمكن أتمتة العديد من هذه الطرق لإنتاج كميات كبيرة، ولكن يجب توخي الحذر لتجنب ظروف التخليق أو الاستخلاص التي تؤدي إلى بروتين مُشوَّه، والذي، نظرًا لأنه لم يعد يتعرف على شريكه الرابط، يجعل المصفوفة عديمة الفائدة.

تُعدّ البروتينات شديدة الحساسية للتغيرات في بيئتها الدقيقة، مما يُشكّل تحديًا في الحفاظ على استقرار مصفوفات البروتينات لفترات طويلة. تعتمد طرق التصنيع الموضعي ، التي ابتكرها ونشرها مينغيو هي ومايكل تاوسيج عام 2001 ^{[ 12 ] [ 13 ]} ، على تصنيع البروتينات على رقاقة إلكترونية عند الحاجة، مباشرةً من الحمض النووي باستخدام أنظمة التعبير البروتيني الخالية من الخلايا. ولأن الحمض النووي جزيء شديد الاستقرار، فإنه لا يتلف بمرور الوقت، مما يجعله مناسبًا للتخزين طويل الأمد. كما يتميز هذا النهج بتجاوزه لعمليات تنقية البروتينات واستنساخ الحمض النووي المنفصلة ، ​​وهي عمليات شاقة ومكلفة في كثير من الأحيان، حيث يتم تصنيع البروتينات وتثبيتها في خطوة واحدة على سطح الرقاقة. ومن أمثلة تقنيات التصنيع الموضعي: مصفوفة البروتينات الموضعية (PISA)، ومصفوفة البروتينات القابلة للبرمجة بواسطة الحمض النووي (NAPPA )، ومصفوفة البروتينات من الحمض النووي (DAPA).

هناك ثلاثة أنواع من المصفوفات الدقيقة للبروتينات التي تستخدم حاليًا لدراسة الأنشطة البيوكيميائية للبروتينات.

تُعرف المصفوفات الدقيقة التحليلية أيضًا باسم مصفوفات الالتقاط. في هذه التقنية، تُرتب مكتبة من الأجسام المضادة أو الأبتاميرات أو الأفيبوديات على سطح الدعامة. تُستخدم هذه الجزيئات كجزيئات التقاط، حيث يرتبط كل منها ببروتين معين على وجه التحديد. تُفحص المصفوفة بمحلول بروتيني معقد، مثل مستخلص خلوي . يُمكن لتحليل تفاعلات الارتباط الناتجة، باستخدام أنظمة كشف متنوعة، أن يوفر معلومات حول مستويات التعبير عن بروتينات معينة في العينة، بالإضافة إلى قياسات ألفة الارتباط وخصوصيته. يُعد هذا النوع من المصفوفات الدقيقة مفيدًا بشكل خاص في مقارنة التعبير البروتيني في محاليل مختلفة. على سبيل المثال، يُمكن تحديد استجابة الخلايا لعامل معين من خلال مقارنة مستخلصات الخلايا المعالجة بمواد محددة أو التي نُمت في ظروف معينة مع مستخلصات الخلايا الضابطة. ومن التطبيقات الأخرى تحديد وتوصيف الأنسجة المريضة.

تعتمد تقنية المصفوفات البروتينية ذات الطور العكسي (RPPA) على عينات معقدة، مثل مستخلصات الأنسجة. تُعزل الخلايا من أنسجة مختلفة ذات أهمية وتُحلل. يُرتب المستخلص على المصفوفة ويُفحص باستخدام أجسام مضادة ضد البروتين المستهدف. تُكشف هذه الأجسام المضادة عادةً باستخدام فحوصات كيميائية ضوئية أو فلورية أو لونية . تُطبع ببتيدات مرجعية على الشرائح لتمكين تحديد كمية البروتين في مستخلصات العينات. تسمح تقنية RPA بتحديد وجود بروتينات متغيرة أو عوامل أخرى قد تكون ناتجة عن مرض. على وجه التحديد، يمكن الكشف عن التعديلات ما بعد الترجمة، التي تتغير عادةً نتيجةً للمرض، باستخدام تقنية RPA. ^{[ 14 ]}

تُصنع المصفوفات الدقيقة للبروتينات الوظيفية (المعروفة أيضًا باسم مصفوفات البروتينات المستهدفة) عن طريق تثبيت أعداد كبيرة من البروتينات النقية، وتُستخدم لتحديد تفاعلات البروتين-بروتين، والبروتين-DNA، والبروتين- RNA ، والبروتين- فوسفوليبيد ، والبروتين-جزيئات صغيرة، ولتحليل النشاط الإنزيمي، والكشف عن الأجسام المضادة وإثبات خصوصيتها. وهي تختلف عن المصفوفات التحليلية في أن مصفوفات البروتينات الوظيفية تتكون من مصفوفات تحتوي على بروتينات وظيفية كاملة الطول أو نطاقات بروتينية. تُستخدم هذه الرقائق البروتينية لدراسة الأنشطة البيوكيميائية للبروتيوم بأكمله في تجربة واحدة.

يُعدّ الحفاظ على البنية الأصلية للبروتينات المُرَصَّصة عنصرًا أساسيًا في أي تحليل وظيفي قائم على المصفوفات الدقيقة للبروتينات، وذلك لضمان حدوث تفاعلات وظيفية فعّالة على سطح المصفوفة. وتتمثل مزايا التحكم الدقيق في طريقة ارتباط البروتينات بالسطح باستخدام علامة تقارب مناسبة في أن البروتينات المُثبَّتة ستتمتع بتوجيه متجانس، مما ينتج عنه نشاط نوعي أعلى ونسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى في التحليلات، مع تقليل التداخل الناتج عن التفاعلات غير النوعية. ^{[ 15 ] [ 16 ]}

يجب أن توفر طرق الكشف عن مصفوفات البروتينات إشارة عالية وخلفية منخفضة. الطريقة الأكثر شيوعًا واستخدامًا للكشف هي الوسم الفلوري، وهي طريقة حساسة للغاية وآمنة ومتوافقة مع الماسحات الضوئية الليزرية للمصفوفات الدقيقة المتوفرة بسهولة. يمكن استخدام وسوم أخرى، مثل وسوم التقارب أو الوسوم الكيميائية الضوئية أو وسوم النظائر المشعة. تُربط هذه الوسوم بالمسبار نفسه، وقد تتداخل مع تفاعل المسبار مع البروتين المستهدف. لذلك، يتوفر عدد من طرق الكشف الخالية من الوسوم، مثل رنين البلازمون السطحي (SPR)، وأنابيب الكربون النانوية، ومستشعرات أسلاك الكربون النانوية (حيث يتم الكشف عن طريق التغيرات في الموصلية)، وأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة (MEMS). ^{[ 17 ]} جميع طرق الكشف الخالية من الوسوم هذه حديثة نسبيًا، وليست مناسبة بعد للكشف عالي الإنتاجية عن تفاعلات البروتينات؛ ومع ذلك، فهي واعدة جدًا في المستقبل. وقد أظهرت المقايسات المناعية على هياكل الأعمدة الدقيقة المصنوعة من "الورق الاصطناعي" الثيول-إين توليد إشارة فلورية فائقة. ^{[ 18 ]}

يمكن استخدام الكشف الفلوري بالأشعة تحت الحمراء القريبة في قياس كمية البروتين على شرائح زجاجية مطلية بالنيتروسليلوز . وهذا يحد من التداخلات الناتجة عن التألق الذاتي للنيتروسليلوز عند أطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة في مجسات الكشف الفلوري القياسية. ^{[ 19 ]}

هناك خمسة مجالات رئيسية يتم فيها تطبيق مصفوفات البروتين: التشخيص، وعلم البروتينات، والتحليل الوظيفي للبروتين، وتوصيف الأجسام المضادة، وتطوير العلاج.

يشمل التشخيص الكشف عن المستضدات والأجسام المضادة في عينات الدم؛ وتحليل الأمصال لاكتشاف مؤشرات حيوية جديدة للأمراض ؛ ومراقبة حالات المرض والاستجابات للعلاج في الطب الشخصي؛ ومراقبة البيئة والغذاء. يُعدّ التحليل الحيوي الرقمي مثالًا على استخدام مصفوفة البروتينات الدقيقة لأغراض التشخيص. في هذه التقنية، تُزرع مصفوفة من الآبار الدقيقة على شريحة زجاجية/بوليمرية بخرزات مغناطيسية (مغطاة بأجسام مضادة موسومة بصبغات فلورية)، وتُعرَّض لمستضدات مُستهدفة، ثم تُفحص بواسطة المجهر من خلال عدّ الآبار المتألقة. وقد تمّ مؤخرًا إثبات فعالية منصة تصنيع منخفضة التكلفة (باستخدام بوليمرات OSTE ) لمثل هذه المصفوفات الدقيقة، وتمّ توصيف نظام نموذج التحليل الحيوي بنجاح. ^{[ 20 ]}

علم البروتينات يتعلق بتحديد التعبير البروتيني، أي ما هي البروتينات التي يتم التعبير عنها في مستخلص خلية معينة.

التحليل الوظيفي للبروتين هو تحديد التفاعلات بين البروتينات (على سبيل المثال تحديد أعضاء مركب البروتين)، والتفاعلات بين البروتين والفوسفوليبيد، وأهداف الجزيئات الصغيرة، والركائز الإنزيمية (وخاصة ركائز الكينازات ) وروابط المستقبلات.

توصيف الأجسام المضادة هو توصيف التفاعل المتبادل والنوعية وتحديد مواقع المستضدات .

يمكن أيضاً استخدام المصفوفات الدقيقة للكشف عن الأجسام المضادة الذاتية، وذلك باستخدام مصفوفات المستضدات الذاتية لفحص العديد من المستضدات أو المستضدات المحتملة بالتوازي. ^{[ 21 ] [ 22 ] [ 23 ]}

يتضمن تطوير العلاج تطوير علاجات خاصة بالمستضدات لأمراض المناعة الذاتية والسرطان والحساسية؛ وتحديد أهداف الجزيئات الصغيرة التي يمكن استخدامها كأدوية جديدة.

على الرغم من الاستثمارات الضخمة التي ضختها العديد من الشركات، لم تغزو رقائق البروتينات السوق بعد. فقد وجد المصنّعون أن البروتينات صعبة التعامل معها. إن إنتاج بروتينات موثوقة ومتسقة وعالية الإنتاجية، ذات بنية وظيفية سليمة، محفوف بالصعوبات، إذ غالبًا ما ينتج عنه انخفاض في كمية البروتينات بسبب انخفاض الذوبان وتكوّن أجسام مُدمجة. تتطلب رقاقة البروتين خطوات أكثر بكثير في تصنيعها مقارنةً برقاقة الحمض النووي .

توجد عدة طرق لحل هذه المشكلة، وتختلف هذه الطرق اختلافًا جوهريًا بحسب ما إذا كانت البروتينات تُثبَّت عبر تفاعلات غير محددة وغير واضحة المعالم، أو عبر مجموعة محددة من التفاعلات المعروفة. تتميز الطريقة الأولى ببساطتها، وهي متوافقة مع البروتينات النقية المشتقة من مصادر طبيعية أو مُعاد تركيبها ^{[ 24 ] [ 25 ]} ، ولكنها تنطوي على عدد من المخاطر. أبرز هذه المخاطر تتعلق بالطبيعة غير المنضبطة للتفاعلات بين كل بروتين والسطح؛ ففي أحسن الأحوال، قد يؤدي ذلك إلى ظهور مجموعة غير متجانسة من البروتينات، حيث تُحجب المواقع النشطة أحيانًا بواسطة السطح؛ وفي أسوأ الأحوال، قد يؤدي ذلك إلى فقدان النشاط تمامًا نتيجةً لفك طي البروتين المُثبَّت جزئيًا أو كليًا بفعل السطح.

تشمل التحديات ما يلي: 1) إيجاد سطح وطريقة ربط تسمح للبروتينات بالحفاظ على بنيتها الثانوية أو الثلاثية ، وبالتالي نشاطها البيولوجي وتفاعلاتها مع الجزيئات الأخرى، 2) إنتاج مصفوفة ذات عمر تخزين طويل بحيث لا تتلف البروتينات الموجودة على الشريحة خلال فترة قصيرة، 3) تحديد وعزل الأجسام المضادة أو جزيئات الالتقاط الأخرى لكل بروتين في الجينوم البشري، 4) قياس مستويات البروتين المرتبط مع ضمان الحساسية وتجنب التشويش، 5) استخلاص البروتين المكتشف من الشريحة لمزيد من التحليل، 6) تقليل الارتباط غير النوعي بواسطة عوامل الالتقاط، 7) يجب أن تكون سعة الشريحة كافية للسماح بتصوير تمثيل كامل قدر الإمكان للبروتيوم؛ إذ أن البروتينات الوفيرة تطغى على اكتشاف البروتينات الأقل وفرة مثل جزيئات الإشارة والمستقبلات، والتي عادةً ما تكون ذات أهمية علاجية أكبر. ^{[ 26 ]}

• الطباعة الدقيقة وتشكيل طاقة السطح

• تقنيات الكشف الخالية من العلامات للمصفوفات الدقيقة للبروتين