توحيد لطخة ويسترن

عند استخدام الأجسام المضادة الفلورية لتصوير البروتينات في لطخات ويسترن، تتطلب عملية المعايرة تحديد الحدين الأعلى والأدنى للقياس الكمي، وتوصيف العلاقة الخطية بين شدة الإشارة وحجم كتلة العينة لكل مستضد . ^{[ 1 ]} يجب أن يتألق كل من البروتين المستهدف وعنصر التحكم في المعايرة ضمن النطاق الديناميكي للكشف. ^{[ 1 ]} تُعبَّر العديد من بروتينات HKP بمستويات عالية، ويُفضَّل استخدامها مع البروتينات المستهدفة عالية التعبير. ^{[ 1 ]} يصعب الكشف عن البروتينات منخفضة التعبير على نفس اللطخة. ^{[ 1 ]}

تتوفر الأجسام المضادة الفلورية تجارياً، ويُنصح باستخدام الأجسام المضادة ذات الخصائص المحددة بالكامل لضمان اتساق النتائج. ^{[ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]}

عند عدم استخدام الكشف الفلوري، يجب أن يختلف بروتين التحكم في التحميل والبروتين المراد دراسته اختلافًا كبيرًا في الوزن الجزيئي حتى يتم فصلهما بشكل كافٍ بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي لإجراء تحليل دقيق. ^{[ 1 ]}

عند الكشف عن عدة بروتينات مستهدفة على نفس اللطخة، يجب إزالة الأجسام المضادة من الأغشية وإعادة فحصها باستخدام مجموعة جديدة منها. ^{[ 6 ]} قد تؤدي عملية الإزالة غير الفعالة إلى إشارة ضعيفة من البروتين المستهدف. ^{[ 6 ]} ولمنع فقدان المستضد، يُوصى بثلاث عمليات إزالة فقط لكل غشاء. ^{[ 6 ]} قد يصعب التخلص تمامًا من إشارة البروتينات عالية الوفرة، لذا يُوصى بالكشف عن البروتينات منخفضة التعبير أولًا. ^{[ 6 ]}

نظرًا لأن مستويات بروتين HKP قد تختلف بين الأنسجة، يمكن للعلماء التحكم في البروتين المطلوب عن طريق إضافة بروتين خارجي نقي بتركيز معروف ضمن النطاق الخطي للأجسام المضادة. ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]} وبالمقارنة مع بروتين HKP، تتوفر مجموعة أوسع من البروتينات للتحكم في مستوى البروتين. ^{[ 14 ]}

تُستخدم الأصباغ الأنيونية مثل بونسو إس وكوماسي الأزرق اللامع ، والأصباغ الفلورية مثل سيبرو روبي وديب بيربل، قبل إضافة الأجسام المضادة لأنها لا تؤثر على الكشف المناعي اللاحق. ^{[ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]}

بونسو إس صبغة عكسية سالبة الشحنة، تُلوّن البروتينات بلون وردي محمر، وتُزال بسهولة بالغسل بالماء. ^{[ 21 ] [ 22 ]} تتناقص شدة تلوين بونسو إس بسرعة مع مرور الوقت، لذا ينبغي توثيق النتائج بسرعة. ^{[ 5 ]} يُذكر أن نطاق تركيز  بونسو إس يصل إلى 140 ميكروغرام، مع ضعف قابلية التكرار نظرًا لاعتماد شدة التلوين بشكل كبير على الوقت وانخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء . ^{[ 21 ] [ 22 ]}

تتميز الأصباغ الفلورية، مثل صبغة سيبرو روبي، بنطاق خطي واسع وحساسية أعلى من الأصباغ الأنيونية. ^{[ 22 ]} وهي أصباغ دائمة وثابتة ضوئيًا، ويمكن رؤيتها باستخدام جهاز إضاءة فوق بنفسجية أو زرقاء قياسي، أو باستخدام ماسح ليزري. ^{[ 1 ] [ 22 ]} ويمكن بعد ذلك توثيق الأغشية إما على فيلم أو رقميًا باستخدام كاميرا CCD . ^{[ 23 ]} تستغرق عملية تلوين لطخة سيبرو روبي وقتًا طويلاً، وتميل إلى التشبع عند تجاوز 50 ميكروغرام من البروتين لكل مسار. ^{[ 22 ]}

يُعدّ أميدو بلاك صبغة أنيونية دائمة شائعة الاستخدام بعد الكشف المناعي، وهي أكثر حساسية من بونسو إس. ^{[ 24 ]} تُستخدم هذه الصبغة بعد الكشف المناعي. ^{[ 24 ]}

تعتمد تقنية التصوير الخالية من الصبغة على تفاعل كيميائي داخل الهلام. ^{[ 22 ] [ 25 ] [ 26 ]} لا يؤثر هذا التفاعل الكيميائي على نقل البروتين أو ارتباط الأجسام المضادة اللاحقة. ^{[ 27 ]} كما أنه لا يتطلب خطوات التلوين/إزالة التلوين، وتبقى شدة الحزم ثابتة مع مرور الوقت. ^{[ 28 ]}

لا تستطيع تقنية الكشف بدون صبغة الكشف عن البروتينات التي لا تحتوي على بقايا التربتوفان . يلزم وجود اثنين من التربتوفان على الأقل لتمكين الكشف. ^{[ 5 ]} يصل النطاق الخطي للتطبيع بدون صبغة إلى 80  ميكروغرام من البروتين لكل مسار في هلامات Criterion متوسطة الحجم ذات 18 بئراً، وإلى 100  ميكروغرام لكل مسار في هلامات Criterion متوسطة الحجم ذات 12 بئراً. يتوافق هذا النطاق مع أحمال البروتين النموذجية في لطخات ويسترن الكمية، ويتيح حسابات التحكم في التحميل عبر نطاق واسع من تحميل البروتين. ^{[ 29 ] [ 4 ]} وقد توفرت مؤخراً طريقة أكثر كفاءة للكشف بدون صبغة. ^{[ 30 ] [ 31 ]} عند استخدام أحمال بروتين عالية، أثبتت تقنية الكشف بدون صبغة نجاحاً أكبر من استخدام الصبغات. ^{[ 29 ]}