بناء الحمض النووي

التركيب الجيني هو قطعة من الحمض النووي مصممة اصطناعياً محمولة على ناقل ، ويمكن استخدامها لإدخال مادة وراثية في نسيج أو خلية مستهدفة . ^{[ 1 ]} يحتوي التركيب الجيني على قطعة من الحمض النووي ، تُسمى الجين المنقول ، يتم إدخالها عبر ناقل تحويل يسمح بتكرار تسلسل القطعة و/أو التعبير عنه في الخلية المستهدفة. يمكن استنساخ هذا الجين من جين موجود طبيعياً، ^{[ 2 ]} أو تصنيعه اصطناعياً. ^{[ 3 ]} يمكن إدخال الناقل باستخدام طرق فيزيائية أو كيميائية أو فيروسية. ^{[ 4 ]} عادةً، تحتوي النواقل المستخدمة في التركيبات الجينية على منشأ تضاعف ، وموقع استنساخ متعدد ، وعلامة اختيارية . ^{[ 2 ]} يمكن لبعض النواقل أن تحمل عناصر تنظيمية إضافية بناءً على نظام التعبير المستخدم. ^{[ 5 ]}

يمكن أن تكون تركيبات الحمض النووي صغيرة جدًا، لا تتجاوز بضعة آلاف من أزواج القواعد (kbp) من الحمض النووي الحامل لجين واحد، باستخدام نواقل مثل البلازميدات أو العاثيات ، أو كبيرة جدًا، تصل إلى مئات من أزواج القواعد (kbp) للدراسات الجينومية واسعة النطاق باستخدام كروموسوم اصطناعي. ^{[ 2 ]} قد تُعبّر تركيبات الحمض النووي عن البروتين الطبيعي، أو تمنع التعبير عن جينات معينة عن طريق التعبير عن جينات منافسة أو مثبطة، أو تُعبّر عن بروتينات طافرة، مثل طفرات الحذف أو طفرات تغيير المعنى . تُستخدم تركيبات الحمض النووي على نطاق واسع في أبحاث البيولوجيا الجزيئية لتقنيات مثل تسلسل الحمض النووي، والتعبير عن البروتين، ودراسات الحمض النووي الريبوزي (RNA). ^{[ 5 ]}

صُمم أول ناقل قياسي، وهو pBR220، في عام 1977 من قبل باحثين في مختبر هربرت بوير. يحتوي البلازميد على مواقع إنزيمات تقييد متنوعة وجين مقاومة مستقر للمضادات الحيوية خالٍ من أنشطة الترانسبوزون. ^{[ 6 ]}

في عام 1982، وصف جيفري فييرا ويواكيم ميسينغ تطوير نواقل pUC المشتقة من M13mp7، والتي تتكون من موقع استنساخ متعدد، مما يسمح بتسلسل واستنساخ أكثر كفاءة باستخدام مجموعة من بادئات M13 العامة. وبعد ثلاث سنوات، قام نفس العلماء بهندسة بلازميد pUC19 الشائع حاليًا. ^{[ 7 ]}

يمكن استنساخ الجين الموجود على تسلسل الحمض النووي المطلوب إما من تسلسل موجود أو تطويره صناعيًا. لاستنساخ تسلسل طبيعي في كائن حي، يُقطع الحمض النووي للكائن أولًا باستخدام إنزيمات التقييد ، التي تتعرف على تسلسلات الحمض النووي وتقطعها حول الجين المستهدف. بعد ذلك، يمكن تضخيم الجين باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). عادةً، تتضمن هذه العملية استخدام تسلسلات قصيرة تُعرف باسم البادئات للتهجين المبدئي مع التسلسل المستهدف؛ بالإضافة إلى ذلك، يمكن إدخال طفرات نقطية في تسلسلات البادئات ثم نسخها في كل دورة لتعديل التسلسل المستهدف. ^{[ 2 ]}

من الممكن أيضًا تصنيع شريط DNA مستهدف لبنية DNA. يمكن تطوير سلاسل DNA قصيرة تُعرف باسم قليل النوكليوتيدات باستخدام التخليق القائم على الأعمدة، حيث تُضاف القواعد واحدة تلو الأخرى إلى شريط DNA مُثبَّت على طور صلب. تحتوي كل قاعدة على مجموعة حماية لمنع الارتباط، ولا تُزال هذه المجموعة إلا عند جاهزية القاعدة التالية للإضافة، مما يضمن ارتباطها بالتسلسل الصحيح. يمكن أيضًا تصنيع قليل النوكليوتيدات على مصفوفة دقيقة، مما يسمح بتصنيع عشرات الآلاف من التسلسلات دفعة واحدة، لتقليل التكلفة. ^{[ 3 ]} لتصنيع جين أكبر، تُطوَّر قليل النوكليوتيدات بتسلسلات متداخلة على الأطراف ثم تُربط معًا. تُسمى الطريقة الأكثر شيوعًا بتجميع دورة البوليميراز (PCA): حيث تتهجن القطع في المناطق المتداخلة وتُمدد، وتُنشأ قطع أكبر في كل دورة. ^{[ 2 ]}

بعد عزل التسلسل، يجب إدخاله في ناقل . أسهل طريقة للقيام بذلك هي قطع الحمض النووي للناقل باستخدام إنزيمات القطع؛ فإذا استُخدمت نفس الإنزيمات لعزل التسلسل المستهدف، فسيتم إنشاء نفس التسلسلات المتدلية على كل طرف، مما يسمح بالتهجين. بمجرد تهجين الجين المستهدف مع الحمض النووي للناقل، يمكن ربطهما باستخدام إنزيم ربط الحمض النووي . ^{[ 2 ]} تعتمد استراتيجية بديلة على إعادة التركيب بين المواقع المتماثلة على الجين المستهدف وتسلسل الناقل، مما يلغي الحاجة إلى إنزيمات القطع. ^{[ 8 ]}

توجد ثلاث فئات عامة لتوصيل تركيبات الحمض النووي: الطرق الفيزيائية، والكيميائية، والفيروسية. ^{[ 4 ]} تشمل الطرق الفيزيائية، التي تُوصل الحمض النووي عن طريق اختراق الخلية، الحقن المجهري ، والتحفيز الكهربائي ، والقذف الجيني . ^{[ 9 ]} تعتمد الطرق الكيميائية على التفاعلات الكيميائية لتوصيل الحمض النووي، وتشمل التحويل الخلوي باستخدام فوسفات الكالسيوم، بالإضافة إلى التوصيل عبر الجسيمات النانوية الدهنية. ^{[ 10 ] [ 11 ]} تستخدم الطرق الفيروسية مجموعة متنوعة من النواقل الفيروسية لتوصيل الحمض النووي، بما في ذلك الفيروس الغدي ، والفيروس البطيء ، وفيروس الهربس البسيط. ^{[ 12 ]}

بالإضافة إلى الجين المستهدف، يحتوي الناقل على ثلاثة عناصر أساسية: منشأ التضاعف، وعلامة اختيارية، وموقع استنساخ متعدد. منشأ التضاعف هو تسلسل الحمض النووي الذي يبدأ عملية تضاعف الحمض النووي، مما يسمح للناقل باستنساخ نفسه. يحتوي موقع الاستنساخ المتعدد على مواقع ارتباط لعدة إنزيمات تقييد، مما يُسهّل إدخال تسلسلات مختلفة من الحمض النووي في الناقل. تُضفي العلامة الاختيارية سمةً يمكن اختيارها بسهولة في الخلية المضيفة، بحيث يُمكن تحديد ما إذا كان التحويل ناجحًا. من أكثر العلامات الاختيارية شيوعًا جينات مقاومة المضادات الحيوية، بحيث تموت الخلايا المضيفة التي لا تحمل التركيبة عند تعرضها للأجسام المضادة، وتبقى فقط الخلايا المضيفة التي تحمل التركيبة. ^{[ 2 ]}

• البلازميدات البكتيرية عبارة عن أجزاء دائرية من الحمض النووي تتضاعف طبيعيًا في البكتيريا. ^{[ 2 ]} تستطيع البلازميدات استيعاب إضافات يصل طولها إلى حوالي 20 كيلو قاعدة. تحتوي هذه الأنواع من التركيبات عادةً على جين يُكسب البكتيريا مقاومة للمضادات الحيوية، ومنشأ تضاعف، وعناصر تنظيمية مثل مثبطات اللاكتوز ، ورابط متعدد ، وعلامة بروتينية تُسهّل تنقية البروتين. ^{[ 14 ]}
• ناقلات العاثيات هي فيروسات يمكنها إصابة البكتيريا وتكرار حمضها النووي الخاص. ^{[ 2 ]}
• تُستخدم الكروموسومات الاصطناعية على نطاق واسع في دراسات مشاريع الجينوم لقدرتها على استيعاب إدخالات يصل طولها إلى 350 كيلو قاعدة. تُشتق هذه النواقل من بلازميد F ، مستفيدةً من الاستقرار العالي والقدرة على الاقتران التي يوفرها عامل F. ^{[ 15 ]}
• الفوسميدات هي هجين بين بلازميدات F البكتيرية وتقنيات استنساخ العاثيات λ. تُعبأ القطع المُدخلة مسبقًا في جسيمات العاثيات، ثم تُدخل في الخلية المضيفة، وتبلغ سعتها حوالي 45 كيلو قاعدة. تُستخدم عادةً لإنشاء مكتبة الحمض النووي نظرًا لزيادة استقرارها. ^{[ 16 ]}

يمكن استخدام تركيبات الحمض النووي لإنتاج البروتينات، بما في ذلك البروتينات الطبيعية والبروتينات المُهندسة المُطفرة. ويمكن استخدام هذه البروتينات في صناعة منتجات علاجية، مثل الأدوية والأجسام المضادة. كما يمكن لتركيبات الحمض النووي تغيير مستويات التعبير الجيني لجينات أخرى من خلال التعبير عن تسلسلات تنظيمية مثل المحفزات والمثبطات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تركيبات الحمض النووي في الأبحاث، مثل إنشاء مكتبات جينومية، وتسلسل الحمض النووي المُستنسخ، ودراسة التعبير عن الحمض النووي الريبوزي والبروتين. ^{[ 5 ]}

• ناقل (علم الأحياء الجزيئي)