موقع استنساخ متعدد

📅 آخر تحديث: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 5 صور
الموسوعة الحرة

ناقل استنساخ pUC19 يوضح تسلسل مواقع الاستنساخ المتعددة مع مواقع إنزيمات التقييد

موقع الاستنساخ المتعدد ( MCS )، ويُسمى أيضًا الرابط المتعدد ، هو جزء قصير من الحمض النووي يحتوي على العديد من مواقع التقييد (حتى 20 موقعًا تقريبًا) ، وهي سمة قياسية للبلازميدات المُهندسة . [ 1 ] عادةً ما تكون مواقع التقييد داخل موقع الاستنساخ المتعدد فريدة، إذ لا تتكرر إلا مرة واحدة في البلازميد الواحد. والغرض من موقع الاستنساخ المتعدد في البلازميد هو السماح بإدخال قطعة من الحمض النووي في تلك المنطقة. [ 2 ]

توجد مواقع الاستنساخ المتعددة (MCSs) في مجموعة متنوعة من النواقل، بما في ذلك نواقل الاستنساخ لزيادة عدد نسخ الحمض النووي المستهدف، وفي نواقل التعبير لإنتاج بروتين. [ 3 ] في نواقل التعبير، يقع موقع الاستنساخ المتعدد (MCS) في اتجاه مجرى المحفز لتمكين نسخ الجين. [ 2 ] غالبًا ما يُدرج موقع الاستنساخ المتعدد (MCS) داخل جين غير أساسي، مثل lacZα، مما يُسهل عملية الفرز الأزرق والأبيض لاختيار المُعاد تركيبه. [ 4 ] من خلال تضمين تسلسلات التعرف لمجموعة متنوعة من إنزيمات التقييد، يُعزز موقع الاستنساخ المتعدد (MCS) بشكل كبير المرونة والكفاءة في عمليات الاستنساخ الجزيئي، مما يسمح بإدخال الحمض النووي بدقة في البيولوجيا التركيبية ، والهندسة الوراثية، وتطوير الكائنات المعدلة وراثيًا. [ 1 ] [ 4 ]

إنشاء موقع استنساخ متعدد

في بعض الحالات، قد لا يحتوي الناقل على موقع استنساخ متعدد (MCS). بدلاً من ذلك، يمكن إضافة موقع استنساخ متعدد إلى الناقل. [ 5 ] تتمثل الخطوة الأولى في تصميم تسلسلات أوليغونوكليوتيدية مكملة تحتوي على مواقع إنزيمات تقييد ، بالإضافة إلى قواعد إضافية في نهايتها مكملة للناقل بعد هضمه. بعد ذلك، يمكن تهجين تسلسلات الأوليغونوكليوتيدات وربطها بالناقل المهضوم والمنقى. يُقطع الناقل المهضوم باستخدام إنزيم تقييد يُكمل النهايات البارزة لإدخال الأوليغونوكليوتيد. بعد الربط، يُنقل الناقل إلى البكتيريا ويُتحقق من الإدخال عن طريق التسلسل. يمكن استخدام هذه الطريقة أيضًا لإضافة مواقع تقييد جديدة إلى موقع استنساخ متعدد.

رسم تخطيطي يوضح عملية إدخال موقع استنساخ متعدد في ناقل بلازميد

اعتبارات التصميم لمواقع الاستنساخ المتعددة

صُممت مواقع الاستنساخ المتعددة استراتيجياً لزيادة المرونة إلى أقصى حد مع الحفاظ على سلامة الناقل. ويتمثل الاعتبار الأساسي في تضمين تسلسلات تعرف فريدة لإنزيمات التقييد، ما يعني أن كل موقع تقييد يظهر مرة واحدة فقط في هيكل البلازميد لمنع القطع غير المستهدف أثناء الهضم. وقد اختيرت هذه الإنزيمات لتوفير مجموعة من خيارات القطع (مثل النهايات غير اللاصقة مقابل النهايات اللاصقة)، وتأكد من عدم ظهور مواقع تعرفها في عناصر الناقل الأساسية أو في تسلسل الإدخال نفسه لتجنب التجزئة غير المرغوب فيها. [ 6 ]

يُعدّ الاستنساخ الموجه استراتيجية تصميم رئيسية أخرى، حيث يستخدم إنزيمين تقييد مختلفين يحيطان بمنطقة الإدخال لضمان دمج الجين في اتجاه واحد. تقلل هذه الطريقة من الحاجة إلى فحص الاتجاه، وهو أمر ضروري في الاستنساخ غير الموجه باستخدام موقع تقييد واحد. [ 7 ]

بالنسبة لنواقل التعبير، غالبًا ما تُوضع مواقع التسلسل المتعددة (MCSs) في إطار القراءة مع علامات الطرف الأميني أو الكربوكسيلي، مما يضمن بقاء التسلسلات المشفرة المُدرجة في إطار القراءة المفتوح الصحيح. يمكن إضافة نيوكليوتيدات إضافية للحفاظ على استمرارية إطار القراءة، خاصةً في تركيبات البروتينات المدمجة . بالإضافة إلى ذلك، تُساعد تسلسلات التخزين المؤقت القصيرة المحيطة بمواقع التقييد على تحسين نشاط الإنزيم من خلال توفير كمية كافية من الحمض النووي للارتباط والقطع بشكل صحيح. [ 8 ]

الاستخدامات

تُعدّ مواقع الاستنساخ المتعددة ميزةً تسمح بإدخال الحمض النووي الغريب دون التأثير على باقي البلازميد، مما يجعلها بالغة الأهمية في مجالات التقنية الحيوية والهندسة الحيوية وعلم الوراثة الجزيئية . [ 1 ] يُمكن لمواقع الاستنساخ المتعددة أن تُساعد في إنتاج الكائنات المُعدّلة وراثيًا، والمعروفة أيضًا بالكائنات المُعدّلة وراثيًا (GMO)، باستخدام الهندسة الوراثية. للاستفادة من مواقع الاستنساخ المتعددة في الهندسة الوراثية، يجب إضافة الجين المطلوب إلى الناقل أثناء عملية الإنتاج عند فتح موقع الاستنساخ المتعدد. [ 9 ] بعد إنشاء موقع الاستنساخ المتعدد وربطه، سيحتوي على الجين المطلوب، ويمكن تضخيمه لزيادة عدد نسخ الجين في البكتيريا المُضيفة. بعد تكاثر البكتيريا، يُمكن استخلاص الجين المطلوب منها. في بعض الحالات، يُمكن استخدام ناقل تعبير لإنتاج بروتين. بعد عزل المنتجات، يكون لها استخدامات متنوعة مثل إنتاج الأنسولين ، وصنع اللقاحات ، وإنتاج المضادات الحيوية ، وصنع العلاجات الجينية.

التحديات والقيود في استخدام أنظمة دعم الدورة الدموية الميكانيكية

على الرغم من فائدتها، فإن مواقع الاستنساخ المتعددة تنطوي على عدة قيود. ومن المشكلات الشائعة محدودية توافر مواقع التقييد الفريدة المتوافقة مع كل من الناقل والجين المُدخل. إذا احتوى الجين المُدخل على تسلسلات تعرف داخلية للإنزيمات في موقع الاستنساخ المتعدد، فقد يُقطع أثناء عملية الهضم، مما يستلزم استخدام الطفرات الموجهة للموقع أو استراتيجيات استنساخ بديلة. [ 10 ]

بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي وجود مواقع تقييد متجاورة متعددة أحيانًا إلى تكوين بنى ثانوية مثل حلقات الشعر أو الحلقات الجذعية في نسخة mRNA . هذه البنى، وخاصة في المنطقة غير المترجمة 5' (UTR)، قد تعيق ارتباط الريبوسوم وتقلل من كفاءة ترجمة الجين المُدخل. [ 11 ]

يتمثل قيد آخر في تباين سياق التسلسل. قد ينتج عن إدخالات مستنسخة في مواقع تقييد مختلفة ضمن نفس التسلسل المتعدد المواقع (MCS) مناطق غير مترجمة مختلفة في اتجاهي 5' أو 3'، مما يؤثر على استقرار الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، أو إنهاء النسخ، أو التعبير البروتيني. [ 12 ] كما وُجد أن بعض تصميمات التسلسل المتعدد المواقع (MCS) تُدخل عن غير قصد تسلسلات تنظيمية خفية أو إزاحات إطار قراءة، خاصة عند تعديل الإدخالات أو تكديسها، مما قد يعيق إمكانية تكرار النتائج في التجارب المختلفة.

السمات الهيكلية في أنواع المتجهات

تتميز أنظمة MCS بخصائص هيكلية مميزة تعتمد على نوع المتجه الذي تُستخدم فيه.

في نواقل الاستنساخ ، تُوضع مواقع الاستنساخ المتعددة (MCSs) عادةً ضمن علامة اختيار ، مثل جين lacZα في نواقل pUC. يتيح هذا التكوين فحصًا فعالًا للبلازميدات المُعاد تركيبها، لأن إدخال الحمض النووي الغريب في موقع الاستنساخ المتعدد يُعطّل جين العلامة، مما يسمح بإجراء فحص أزرق-أبيض أو طرق اختيار أخرى. [ 4 ] يوفر موقع الاستنساخ المتعدد في هذه المنطقة العديد من مواقع التقييد التي يمكن استخدامها لتمكين إدخال الحمض النووي الغريب في الناقل. عند هذا الإدخال، ينقطع استمرار علامة الاختيار، مما يجعلها غير وظيفية، ويسمح بالاختيار للإدخال. [ 4 ] يُدخل الجين المطلوب في موقع الاستنساخ المتعدد في هذا النوع من النواقل، ثم يُنقل لاحقًا إلى البكتيريا لتكاثرها ونشرها. يسمح هذا الناقل بالتراكم السريع لتسلسلات الحمض النووي المحددة للاستخدام التجريبي. [ 13 ]

في نواقل التعبير الجيني ، تُوضع مواقع الربط المتعددة (MCSs) بين المحفز والمنهي لتنظيم التعبير الجيني . يمكن أن يكون المحفز العلوي إما تكوينيًا أو قابلًا للتحفيز، ويستجيب لمحفزات كيميائية محددة، بينما يُسهّل المنهي السفلي إنهاء النسخ بشكل صحيح ويعزز استقرار البلازميد. [ 4 ] يسمح موقع الربط المتعدد في هذا النوع من النواقل بإدخال جين مُراد التعبير عنه لاحقًا ( النسخ والترجمة ). وبوجوده بين المحفز والمنهي، يُسهّل وضع موقع الربط المتعدد إنشاء جين مُعبَّر عنه وظيفيًا، مع تسلسلات بدء وإنهاء. [ 4 ] تُحضَّر هذه النواقل وتُدخَل في خلايا بدائية النواة أو حقيقية النواة لتحفيز التعبير عن جينات معينة داخل تلك الخلية. [ 14 ]

في نواقل التعبير الجيني ، يُوضع موقع تسلسل متعدد (MCS) عادةً بالقرب من جين مُبلِّغ ، مثل البروتين الفلوري ( GFP ) أو إنزيم لوسيفيراز أو جين lacZ . يسمح هذا بإضافة تسلسلات المحفز إلى موقع التسلسل المتعدد لتسهيل دراسة نشاط المحفز وتنظيم الجينات من خلال مراقبة تعبير الجين المُبلِّغ. [ 4 ] يتيح موقع التسلسل المتعدد إدخال أنواع مختلفة من المحفزات بسهولة ومرونة، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لدراسة مستويات تعبير الجين المُبلِّغ لفهم ديناميكيات محفزات محددة. [ 4 ]

توجيهات متعددة لمواقع الاستنساخ في بنى بلازميدية بكتيرية مختلفة. من كتاب "فن هندسة النواقل: نحو بناء أدوات جينية من الجيل التالي". [ 15 ] يظهر هنا القسم ب من الشكل 2.

دمج تقنية MCS في النواقل الفيروسية للعلاج الجيني

تُستخدم مواقع الاستنساخ المتعددة على نطاق واسع في النواقل الفيروسية لتسهيل إدخال الجينات العلاجية. في نواقل الفيروسات الغدية المرتبطة (AAV)، يُدرج موقع الاستنساخ المتعدد (MCS) عادةً بين المحفز وإشارة إضافة ذيل عديد الأدينين ضمن التكرارات الطرفية المعكوسة (ITRs)، مما يسمح بالاستنساخ السلس للجينات المطلوبة للتعبير النسيجي النوعي. [ 16 ]

تتميز النواقل الفيروسية البطيئة، الشائعة الاستخدام لنقل الجينات بشكل مستقر في الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة، بوجود موقع متعدد النسخ مركزي لاستيعاب إضافات متنوعة، بما في ذلك المؤشرات الفلورية، وعوامل النسخ ، أو كاسيتات التعبير عن الحمض النووي الريبي القصير المتداخل (shRNA) . [ 17 ] يتيح وجود موقع متعدد النسخ إمكانية تخصيص الهياكل الأساسية للفيروسات البطيئة بسرعة دون الحاجة إلى إعادة تصميم الناقل، مما يعزز تنوع أساليب العلاج الجيني .

بالإضافة إلى ذلك، تحتوي بلازميدات النقل الفيروسي الغدي على مناطق MCS تحل محل منطقتي E1 أو E3 المحذوفتين من الجينوم الفيروسي، مما يسهل إدخال الجينات المنقولة. تُعاد تركيب هذه البلازميدات المعيارية مع الهياكل الفيروسية الغدية لإنتاج نواقل غير قادرة على التضاعف. [ 18 ] وبذلك، تعمل منطقة MCS كموقع إدخال عالمي عبر أنظمة توصيل فيروسية متنوعة.

خلفية تاريخية

التطورات المبكرة لناقلات الاستنساخ

صورة لستانلي نورمان كوهين في عام 2016. وقد أرست تجاربه مع هربرت دبليو بوير في عام 1973 الأساس لتطوير موقع الاستنساخ المتعدد.
ستانلي نورمان كوهين 2016 "ستانلي نورمان كوهين DSC 2027" بواسطة أوثا دي واين هاوس مرخص بموجب CC BY-SA 3.0.

أجرى ستانلي ن. كوهين وهربرت و. بوير تجارب في عام 1973 أثبتت إمكانية إدخال جينات من أنواع بكتيرية مختلفة إلى الخلايا البكتيرية والتعبير عنها. [ 19 ] استخدموا البلازميد pSC101 ، وهو بلازميد طبيعي من نوع بكتيريا السالمونيلا البنمية ، وقاموا بتعديله ليحتوي على موقع تقييد واحد لإنزيم EcoRI وجين مقاومة للتتراسيكلين . [ 19 ] لم يكن للبلازميد pSC101 موقع استنساخ متعدد رسمي، لكن تصميمه أبرز فائدة مواقع التقييد في إدخال الجينات، مما شكل الأساس لتوسيع تركيبات إنزيمات التقييد في النواقل لزيادة مرونة مواقع الاستنساخ. [ 20 ]

إدخال البلازميد pBR322 ومواقع الاستنساخ المحسّنة

استنادًا إلى أبحاث سابقة، قام العالمان فرانسيسكو بوليفار وريموند ل. رودريغيز في عام 1977 ببناء بلازميد pBR322 . [ 21 ] ورغم أنه ليس موقع استنساخ متعدد رسميًا، إلا أن هذا البلازميد كان من أوائل النواقل التي تحتوي على أكثر من موقع تقييد فريد. [ 21 ] أُدخلت هذه المواقع في مواقع استراتيجية ضمن تسلسله، مثل جين مقاومة المضادات الحيوية أو جين lacZ ، حيث يمكن استخدامها لتعطيل الإدخال لتحديد المستنسخات المؤتلفة . [ 21 ] [ 22 ] وقد أتاح ذلك مرونة أكبر في إدخال شظايا الحمض النووي الغريبة ، وشكّل تقدمًا ملحوظًا نحو وجود مناطق استنساخ متعددة محددة في النواقل المستقبلية، مثل مواقع pUC.

بناء متجهات pUC والتعريف الرسمي لـ MCS

تم تطوير سلسلة متجهات pUC عام 1982 على يد جيفري فييرا ويواكيم ميسينغ، بدءًا من M13mp7. [ 23 ] احتوت هذه المتجهات على منطقة محددة تتميز بوجود العديد من مواقع التقييد المستقلة، مما يُرسي مفهوم التسلسل المتعدد المواقع (MCS). [ 23 ] سهّلت متجهات pUC عملية التسلسل والاستنساخ، مما حسّن بشكل ملحوظ إجراءات الاستنساخ الجزيئي . [ 23 ]

التصميم الحديث وتحسين نظام التحكم متعدد الوسائط

لقد جعلت التطورات الحالية في تصميم MCS عملية الاستنساخ أكثر كفاءة ومرونة وسهولة في التنفيذ، مما يجعلها تستخدم بشكل متكرر في البيولوجيا الجزيئية.

تطورات في تصميم أنظمة التحكم متعددة المكونات لعلم الأحياء التركيبي

أدى علم الأحياء التركيبي الحديث إلى ابتكارات في بنية الاستنساخ متعدد الأجزاء (MCS) لتمكين التجميع الجيني المعياري والقابل للتطوير. وقد ريّد معيار BioBrick استخدام مواقع التقييد الجانبية (مثل EcoRI وXbaI وSpeI وPstI) لتوحيد وصلات الأجزاء، مما يسمح باستنساخ العناصر الجينية كالمحفزات والجينات والمنهيات بشكل تبادلي ضمن إطار عمل مشترك. وانطلاقًا من ذلك، تستخدم أنظمة أحدث، مثل الاستنساخ المعياري (MoClo) وتجميع البوابة الذهبية ، إنزيمات التقييد من النوع IIS التي تقطع خارج مواقع التعرف الخاصة بها، مما يتيح إدخال أجزاء متعددة بشكل موجه ودون ترك أي أثر في تفاعل واحد. [ 6 ] عادةً ما تصمم هذه الأنظمة مناطق الاستنساخ متعدد الأجزاء (MCS) بمواقع BsaI أو BsmBI جانبية لتمكين التجميع السلس متعدد الأجزاء.

أدخلت بعض المنصات وحدات تسلسل متعددة عالمية، وهي عبارة عن تسلسلات قصيرة مُحسَّنة محاطة بأذرع متماثلة أو مواقع فريدة تُتيح التوافق عبر هياكل النواقل، أو مضيفات التعبير، أو طرق التجميع. [ 24 ] تُبسِّط هذه الوحدات النمطية عمليات الاستنساخ، وتقلل الأخطاء، وتُحسِّن التوحيد القياسي في مختبرات البيولوجيا التركيبية.

تصميم MCS

بلازميد pUC19 يُظهر MCS

يُحسّن تحديد مواقع التقييد واختيارها الاستراتيجي في أنظمة الاستنساخ المتعددة (MCSs) المرونة والتوافق، ويُقلل من مشاكل الاستنساخ المحتملة. كما يُسهّل ذلك سهولة الاستخدام والتنوع لاستيعاب نطاق واسع من التجارب والتطبيقات. في نظام الاستنساخ المتعدد، يُتيح وجود مواقع تقييد فريدة متعددة ومتقاربة تقليل القيود المفروضة على اختيار الإنزيم. [ 4 ] يُتيح هذا التصميم القطع الإنزيمي في مواقع محددة، مما يسمح بإدخالات وتغييرات مُخصصة في نظام الاستنساخ المتعدد لتطبيقات متنوعة. [ 4 ] تحتوي البلازميدات شائعة الاستخدام، مثل pUC19 وبلازميدات pUC الأخرى، على مواقع تقييد مُحددة في نظام الاستنساخ المتعدد لتسهيل الاستنساخ الفعال، مما يُساهم في مرونة نظام الاستنساخ المتعدد في الاستخدام الجزيئي. [ 25 ]

إزالة مواقع التقييد غير المرغوب فيها

تُتيح التحسينات في المعلوماتية الحيوية والتقنيات الجزيئية تحديد مواقع التقييد غير المرغوب فيها وإزالتها، مما يُبسط عملية الاستنساخ. تُساعد أدوات المعلوماتية الحيوية في فحص وتحديد مواقع التقييد غير المرغوب فيها في هيكل ناقل الاستنساخ المتعدد (MCS) أو ناقل الاستنساخ. [ 4 ] قد تُسبب مواقع التقييد غير المرغوب فيها تباينًا كبيرًا في التعبير البروتيني اعتمادًا على موقعها، ويفرض بعضها تقييدًا شديدًا للتعبير عن جين مُستهدف إذا وُجدت في هيكل ناقل الاستنساخ المتعدد. [ 4 ] من خلال استهداف هذه المواقع الإشكالية وإزالتها، يتمكن الباحثون من إنشاء هياكل ناقل استنساخ متعددة للحصول على تعبير بروتيني موحد وفعال. [ 4 ]

التصميم المعياري والمرونة

صُممت أنظمة MCS الحديثة مع مراعاة مبدأ التنميط، مما يُسهّل دمج العناصر الجينية واستبدالها، وهو أمرٌ بالغ الأهمية في مجال البيولوجيا التركيبية. تسمح التسلسلات الجينية المحيطة الموحدة في بناء أنظمة MCS باستبدال العناصر الجينية بسهولة. [ 4 ] يُمكّن التصميم المعياري من التجميع السريع وتخصيص النواقل لتلبية احتياجات بحثية محددة. [ 4 ] يتيح نظام MoClo التجميع الفعال لقطع الحمض النووي في تركيبات متعددة الجينات بتصميم معياري. [ 26 ] [ 27 ] يُسهّل النظام ربط قطع الحمض النووي (الخالية من التسلسلات غير المرغوب فيها) لجعل العملية فعالة من حيث الحجم والكفاءة. [ 26 ] على سبيل المثال، يسمح نظام MoClo بالربط الفعال لجينين، مثل تسلسل المحفز وتسلسل الترميز، كلٌ منهما من نظام MCS مختلف، في تركيب جيني واحد متعدد الجينات دون دمج تسلسلات غير مرغوب فيها. [ 26 ]

التوافق مع تقنيات الاستنساخ المتقدمة

صُممت مواقع الاستنساخ المتعددة الحديثة لتكون متوافقة مع تقنيات الاستنساخ المتقدمة، مما يُحسّن دقة وكفاءة التعديلات الجينية. تُسهّل تصاميم مواقع الاستنساخ المتعددة الحديثة استخدام تقنيات مثل تجميع جيبسون ، واستنساخ البوابة الذهبية، ومواقع الاستنساخ المتعددة الشاملة، والتي تتميز بمزايا تفوق البروتوكولات التقليدية القائمة على إنزيمات التقييد، مثل التجميع المتوازي لقطع الحمض النووي المتعددة. [ 4 ] [ 28 ] يُعزز هذا التوافق كفاءة منطقة مواقع الاستنساخ المتعددة وفائدتها. يُعد هذا التوافق أساسيًا في الهندسة الوراثية وعلم الأحياء التركيبي، حيث يُعد التجميع الفعال والدقيق لمختلف المكونات الجينية ضروريًا لبناء دوائر جينية معقدة أو مسارات أيضية. [ 4 ]

تحسين سياق التسلسل

يضمن الاهتمام الدقيق بسياق التسلسل بالقرب من مواقع الاستنساخ المتعددة (MCSs) استنساخًا فعالًا وتعبيرًا جينيًا سليمًا. ويمنع استبعاد البنى الثانوية المحتملة بين مكونات الحمض النووي في مواقع الاستنساخ المتعددة (مثل المحفزات وأطر القراءة المفتوحة ) تداخلها مع نشاط إنزيمات التقييد ، مما يُحسّن وظائف مواقع الاستنساخ المتعددة. [ 25 ] فعلى سبيل المثال، قد تمنع البنى الثانوية داخل المنطقة غير المترجمة 5' ارتباط الريبوسوم ، مما يقلل من كفاءة ترجمة الجين المُدخل. [ 25 ] إضافةً إلى ذلك، فإن منع وضع كودونات التوقف المبكرة ومنع انقطاع أطر القراءة يُزيل أخطاء النسخ أو الترجمة غير المرغوب فيها، مثل كودونات التوقف المبكرة التي قد تُؤدي إلى بتر البروتين الناتج، مما يُحسّن موثوقية مواقع الاستنساخ المتعددة في النواقل. [ 25 ]

التحديات والقيود

على الرغم من التحسينات والتطورات، لا تزال بعض التحديات قائمة في تصميم مواقع الاستنساخ المتعددة (MCS)، مما يستدعي استمرار البحث والابتكار. إحدى هذه المشكلات هي وجود مواقع تقييد داخلية في الجينات أو النواقل، والتي قد تتداخل مع نشاط إنزيمات التقييد وكفاءة الاستنساخ. [ 25 ] علاوة على ذلك، قد تُضفي البيئة البنيوية لمواقع الاستنساخ المتعددة خصائص تنظيمية غير مقصودة. [ 25 ] على سبيل المثال، قد يؤدي إدخال مواقع الاستنساخ المتعددة بعيدًا جدًا عن مناطق المحفز إلى تكوين بنية ثانوية ، مما يعيق التعبير الجيني في موقع الاستنساخ المتعدد. [ 25 ] بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي تباين سياق التسلسل (مثل الاختلافات في القرب من المحفزات أو العناصر التنظيمية المجاورة) إلى تعبير جيني غير متساوٍ. [ 4 ] ينشأ هذا التباين نتيجةً للاختلافات في التسلسلات المحيطة، والتي قد تتداخل مع كفاءة النسخ، أو استقرار الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، أو بدء الترجمة. [ 4 ] من أجل تقليل هذا التباين، هناك حاجة إلى ابتكارات تتجاوز مجرد هندسة تصميمات موحدة لمواقع الاستنساخ المتعددة تُحقق أداءً موحدًا في تركيبات جينية متنوعة. [ 4 ]

مثال

يُعدّ البلازميد البكتيري pUC18 أحد البلازميدات المستخدمة في الهندسة الوراثية كناقل استنساخ بلازميدي. تتكون منطقة الربط المتعددة فيه من عدة مواقع تعرف لإنزيمات القطع، والتي تم هندستها في مجموعة واحدة (منطقة الربط المتعددة). يحتوي هذا البلازميد على مواقع قطع لإنزيمات قطع متنوعة، منها EcoRI و BamHI و PstI . يُستخدم ناقل آخر في الهندسة الوراثية هو pUC19 ، وهو مشابه لـ pUC18، ولكن منطقة الربط المتعددة فيه معكوسة. كما تُستخدم بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli) بشكل شائع كمضيف بكتيري نظرًا لتوافرها وسرعة نموها وتعدد استخداماتها. ومن الأمثلة على نواقل الاستنساخ البلازميدية التي تُعدّل البروتين المُدخل، بلازميد pFUSE-Fc .

لهندسة الأنسولين وراثيًا، تتمثل الخطوة الأولى في قطع موقع النسخ المتعدد (MCS) في البلازميد المستخدم. [ 29 ] بمجرد قطع موقع النسخ المتعدد، يُضاف جين الأنسولين البشري، مما يجعل البلازميد معدلًا وراثيًا. بعد ذلك، يُوضع البلازميد المعدل وراثيًا في البكتيريا المضيفة ويُترك ليتكاثر. ولإنتاج الكمية المطلوبة، تُوضع الخلايا المضيفة في خزان تخمير كبير يوفر بيئة مثالية لها. تُختتم العملية بترشيح الأنسولين من البكتيريا المضيفة، ثم يُنقى ليُعبأ ويُوزع على مرضى السكري.

تطبيق نظام التحكم متعدد القنوات في التقنيات القائمة على تقنية كريسبر

تلعب مواقع الاستنساخ المتعددة دورًا محوريًا في أنظمة تحرير الجينات بتقنية كريسبر . تحتوي العديد من بلازميدات كريسبر- كاس9 على مواقع استنساخ متعددة تقع مباشرةً أسفل محفز U6، محاطة بمواقع تقييد من النوع IIS مثل BbsI أو BsmBI. يتيح هذا التصميم إدخالًا فعالًا للأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية التي تشفر الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد المكون من 20 نيوكليوتيدًا لتحرير الجينات الموجه. [ 30 ]

تعتمد تقنية التعدد الجيني CRISPR غالبًا على تسلسلات متعددة المواقع (MCSs) المتتالية، حيث يتم استنساخ عدة كاسيتات تعبيرية لجزيئات RNA الدليلية المفردة في ناقل واحد. وباستخدام طريقتي Golden Gate أو Gibson Assembly، يمكن إدخال أدلة متعددة عبر تسلسلات متعددة المواقع موحدة، مما يتيح تعطيل الجينات أو تنظيم عدة مواقع جينية في آن واحد . [ 31 ]

بالإضافة إلى ذلك، تحتوي بلازميدات CRISPR المستخدمة في إصلاح الحمض النووي الموجه بالتماثل (HDR) غالبًا على مواقع ربط متعددة (MCSs) لإدخال قوالب مانحة، مثل المؤشرات الفلورية أو علامات الإبيتوب. يتيح وجود موقع الربط المتعدد تحكمًا دقيقًا في تركيب الإدخال وموضعه، مما يُسهّل تخصيص نواقل تحرير الجينوم للتجارب المعقدة.

مراجع

  1. 1 2 3 كلارك دي بي (2005). البيولوجيا الجزيئية . دار النشر الأكاديمية. ص  611. ISBN 0-12-175551-7.
  2. 1 2 "Addgene: ما هو البلازميد؟" . www.addgene.org . تم الاطلاع عليه بتاريخ 29-04-2018 .
  3. ↑ كارتر م، شيه جيه سي (2015). دليل تقنيات البحث في علم الأعصاب . إلسيفير. ص 219-237 . 
  4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 نورا إل سي، ويستمان سي إيه، مارتينز-سانتانا إل، ألفيس إل إف، مونتيرو إل إم، غوازاروني إم إي، وآخرون . (يناير 2019). "فن هندسة النواقل: نحو بناء أدوات جينية من الجيل التالي" . التكنولوجيا الحيوية الميكروبية . 12 (1): 125-147 . doi : 10.1111/1751-7915.13318 . PMC 6302727. PMID 30259693 .   
  5. ↑ "كيفية إنشاء نظام MCS مثالي" (ملف PDF) . Addgene . 2018-04-28.
  6. 1 2 ثورينغ ك، شميد ك، كيلر ب، هيلم م (2016-09-01). "تحليل تعديلات الحمض النووي الريبي بواسطة كروماتوغرافيا السائل - مطياف الكتلة الترادفي" . طرق . 107 : 48-56 . doi : 10.1016/j.ymeth.2016.03.019 . ISSN 1046-2023 . PMID 27020891 .  
  7. ↑ أوستوجا-ستارزيفسكي م، ماليارينكو أ (2014-11-08). "ميكانيكا الأوساط المتصلة ما وراء القانون الثاني للديناميكا الحرارية" . وقائع الجمعية الملكية أ: العلوم الرياضية والفيزيائية والهندسية . 470 ( 2171) 20140531. رمز Bibcode : 2014RSPSA.47040531O . doi : 10.1098/rspa.2014.0531 . ISSN 1364-5021 . PMC 4197475. PMID 25383037 .   
  8. ↑ لين ب، بينغ ج، فينغ هـ، لي و، دونغ إكس، تشين واي، وآخرون . (2017-08-01). "تنقية وتوصيف بروتين ألفا-فيتوبروتين نشط بيولوجيًا تنتجه خلايا HEK-293" . التعبير عن البروتين وتنقيته . 136 : 1-6 . doi : 10.1016/j.pep.2017.05.008 . ISSN 1046-5928 . PMID 28554567 .   
  9. ↑ "بي بي سي - سلسلة محاضرات علم الأحياء - إعادة برمجة الميكروبات: مراجعة، الصفحة 2" . مؤرشف من الأصل بتاريخ 28 مارس 2013. تم الاطلاع عليه بتاريخ 29 أبريل 2018 .
  10. ↑ سودهاكارا س، تشادها أ (10-09-2015). "تحليل قائم على مطيافية تحويل فورييه بالأشعة تحت الحمراء (FTIR) لأكسدة الكحولات الأريلية بواسطة فطر المبيضات شبه الاستوائية ATCC 7330" . مجلة التكنولوجيا الحيوية . 209 : 102-107 . doi : 10.1016/j.jbiotec.2015.06.398 . ISSN 0168-1656 . PMID 26100234 .  
  11. ↑ كرينتز إيه دي، مورفي إم دبليو، سارفير إيه إل، غريسولد إم دي، باردويل في جيه، زاركاور دي (2011-08-01). " يعزز DMRT1 تكوين البويضات عن طريق التنشيط النسخي لـ Stra8 في مبيض الجنين الثديي" . علم الأحياء النمائي . 356 (1): 63-70 . doi : 10.1016/j.ydbio.2011.05.658 . ISSN 1095-564X . PMC 3131262. PMID 21621532 .   
  12. ↑ وو ي، لي ك، لي ي، صن ت، ليو س، دونغ س، وآخرون . (2022-03-21). "تقنية التسلسل المُجمّع للفحص المتكامل للنمط الظاهري والنسخ الجيني للأورام العضوية المُستخلصة من المرضى" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 50 (5): e28. doi : 10.1093/nar/gkab1201 . ISSN 0305-1048 . PMC 8934649. PMID 34893868 .    
  13. ↑ كارتر م، إسنر ر، غولدشتاين ن، آير م (2022-01-01)، "الفصل 10 - الاستنساخ الجزيئي وتقنية الحمض النووي المؤتلف" ، في كارتر م، إسنر ر، غولدشتاين ن، آير م (محررون)، دليل تقنيات البحث في علم الأعصاب (الطبعة الثالثة) ، دار النشر الأكاديمية، الصفحات 227-243 ، doi : 10.1016/b978-0-12-818646-6.00014-2 ، ISBN  978-0-12-818646-6تم الاطلاع عليه بتاريخ 31 مارس 2025
  14. ↑ "متجهات التعبير: ماهيتها، وسبب استخدامها، وكيفية عملها" . تقنيات الحمض النووي المتكاملة . تم الاطلاع عليه بتاريخ 31-03-2025 .
  15. ↑ نورا إل سي، ويستمان سي إيه، مارتينز-سانتانا إل، ألفيس إل دي، مونتيرو إل إم، غوازاروني إم إي، وآخرون (2019). " فن هندسة النواقل: نحو بناء أدوات جينية من الجيل التالي" . التكنولوجيا الحيوية الميكروبية . 12 (1): 125-147 . doi : 10.1111/1751-7915.13318 . ISSN 1751-7915 . PMC 6302727. PMID 30259693 .    
  16. ↑ ألترمان جيه إف، غودينيو بي إم، هاسلر إم آر، فيرغسون سي إم، إتشيفيريا دي، ساب إي، وآخرون . (أغسطس 2019). "هيكل كيميائي ثنائي التكافؤ لـ siRNA لتعديل قوي ومستدام للتعبير الجيني في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي" . مجلة Nature Biotechnology . 37 (8): 884-894 . doi : 10.1038/s41587-019-0205-0 . ISSN 1546-1696 . PMC 6879195. PMID 31375812 .    
  17. ↑ سانثوش سي في، تاماني إم سي، كامات آر إتش، باتيل في في، موخوباديايا آر (4 يوليو 2008). "ناقل فيروسي عدسي ذو مواقع استنساخ متعددة جديدة: تعبير مستقر عن الجين المنقول في المختبر وفي الجسم الحي" . مجلة الاتصالات البحثية في الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية . 371 (3): 546-550 . doi : 10.1016/j.bbrc.2008.04.106 . ISSN 0006-291X . PMID 18448070 .  
  18. ↑ "عرض غلاف الفيروس الباكولوفيروسي" . العلاج الجزيئي . 8 (5): 702. 2003-11-01. doi : 10.1016/j.ymthe.2003.09.007 . ISSN 1525-0016 . 
  19. 1 2 كوهين إس إن، تشانغ إيه سي، بوير إتش دبليو، هيلينغ آر بي (1973). "بناء بلازميدات بكتيرية وظيفية بيولوجيًا في المختبر" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 70 (11): 3240-3244 . Bibcode : 1973PNAS...70.3240C . doi : 10.1073/pnas.70.11.3240 . PMC 427208. PMID 4594039 .  
  20. ↑ كوهين ، إس. إن. (24 سبتمبر 2013). "استنساخ الحمض النووي: وجهة نظر شخصية بعد 40 عامًا" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 110 (39): 15521-15529 . Bibcode : 2013PNAS..11015521C . doi : 10.1073/pnas.1313397110 . PMC 3785787. PMID 24043817 .  
  21. 1 2 3 بوليفار ف، رودريغيز ر.ل، غرين ب.ج، بيتلاش م.س، هاينيكر هـ.ل، بوير هـ.و، وآخرون (1977). "بناء وتوصيف نواقل استنساخ جديدة. الجزء الثاني: نظام استنساخ متعدد الأغراض". جين . 2 (2): 95-113 . doi : 10.1016/0378-1119(77)90000-2 . ISSN 0378-1119 . PMID 344137 .   
  22. ↑ لونين، دبليو إيه، درايدن، دي تي، رالي، إي إيه، ويلسون، جي جي، موراي، إن إي (2014-01-01). " أبرز خصائص قاطعات الحمض النووي: تاريخ موجز لإنزيمات التقييد" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 42 (1): 3-19 . doi : 10.1093/nar/gkt990 . ISSN 0305-1048 . PMC 3874209. PMID 24141096 .   
  23. 1 2 3 فييرا ج، ميسينغ ج (1982-10-01). "بلازميدات pUC، نظام مشتق من M13mp7 لإدخال الطفرات والتسلسل باستخدام بادئات اصطناعية عالمية" . جين . 19 (3): 259-268 . doi : 10.1016/0378-1119(82)90015-4 . ISSN 0378-1119 . PMID 6295879 .  
  24. ↑ تشين ف، لي يي، يو ييل، داي ج، هوانغ جيل، لين ج (15 مارس 2021). "استنساخ البلازميد المبسط بتصميم MCS عالمي والتجميع البكتيري في الجسم الحي" . BMC Biotechnology . 21 (1): 24. doi : 10.1186/s12896-021-00679-6 . ISSN 1472-6750 . PMC 7962268. PMID 33722223 .   
  25. 1 2 3 4 5 6 7 كروك، ن. س.، فريمان، إ. س.، ألبر، هـ. س. (أغسطس 2011). "إعادة هندسة مواقع الاستنساخ المتعدد لتحسين الوظيفة وسهولة الاستخدام" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 39 (14): e92. doi : 10.1093/nar/gkr346 . PMC 3152365. PMID 21586584 .  
  26. 1 2 3 ويبر إي، إنجلر سي، غروتزنر آر، فيرنر إس، ماريلونيه إس (فبراير 2011). "نظام استنساخ معياري للتجميع الموحد لبنى الجينات المتعددة" . PLOS ONE . 6 (2) e16765. Bibcode : 2011PLoSO...616765W . doi : 10.1371/journal.pone.0016765 . PMC 3041749. PMID 21364738 .  
  27. ↑ سترويك س. "مقدمة في البلازميدات: الاستنساخ المعياري" . blog.addgene.org . تم الاطلاع عليه بتاريخ 28-03-2025 .
  28. ↑ "إحداث ثورة في البحث العلمي: أحدث تقنيات وأساليب استنساخ الحمض النووي" . www.genscript.com . تاريخ الاطلاع: 28 مارس 2025 .
  29. ↑ "ما هي الهندسة الوراثية؟" . تم الاطلاع عليه بتاريخ 29-04-2018 .
  30. ↑ هاينز ن، هينيغ ك، لوي ر (22 يناير 2013). "الاستجابة المتدرجة أو العتبية للتعبير الجيني المتحكم فيه بواسطة التتراسيكلين: كل شيء يعتمد على تركيز المنشط النسخي" . مجلة BMC للتكنولوجيا الحيوية . 13 (1): 5. doi : 10.1186/1472-6750-13-5 . ISSN 1472-6750 . PMC 3556329. PMID 23336718 .   
  31. ↑ فوغت ن (يوليو 2015). "التلاعب الكيميائي الوراثي بالخلايا العصبية" . نيتشر ميثودز . 12 (7): 603. doi : 10.1038/nmeth.3471 . ISSN 1548-7105 . PMID 26339707 .