متجه التعبير

يجب أن يحتوي ناقل التعبير على العناصر اللازمة للتعبير الجيني. قد تشمل هذه العناصر مُحفِّزًا ، وتسلسل بدء الترجمة الصحيح مثل موقع ارتباط الريبوسوم وكودون البدء ، وكودون الإنهاء ، وتسلسل إنهاء النسخ . ^{[ 2 ]} توجد اختلافات في آلية تخليق البروتين بين بدائيات النوى وحقيقيات النوى، لذا يجب أن تحتوي نواقل التعبير على العناصر المناسبة للتعبير في الكائن المضيف المُختار. على سبيل المثال، تحتوي نواقل التعبير في بدائيات النوى على تسلسل شاين-دالغارنو في موقع بدء الترجمة لربط الريبوسومات، بينما تحتوي نواقل التعبير في حقيقيات النوى على تسلسل كوزاك المتفق عليه .

يبدأ المحفز عملية النسخ، وبالتالي فهو نقطة التحكم في التعبير عن الجين المستنسخ. عادةً ما تكون المحفزات المستخدمة في نواقل التعبير قابلة للتحفيز ، أي أن تخليق البروتين لا يبدأ إلا عند الحاجة إليه بإدخال محفز مثل IPTG . مع ذلك، قد يكون التعبير الجيني مستمرًا (أي أن البروتين يُعبَّر عنه باستمرار) في بعض نواقل التعبير. وقد يحدث مستوى منخفض من تخليق البروتين المستمر حتى في نواقل التعبير ذات المحفزات الخاضعة لتحكم دقيق.

بعد التعبير عن ناتج الجين، قد يكون من الضروري تنقية البروتين المُعبَّر عنه؛ إلا أن فصل البروتين المطلوب عن غالبية بروتينات الخلية المضيفة قد يستغرق وقتًا طويلاً. ولتسهيل عملية التنقية، يمكن إضافة علامة تنقية إلى الجين المستنسخ. قد تكون هذه العلامة علامة هيستيدين (His) ، أو ببتيدات دلالية أخرى، أو بروتينات اندماجية مثل ناقلة الغلوتاثيون S أو بروتين ربط المالتوز . ^{[ 3 ]} قد تُسهم بعض هذه البروتينات الاندماجية أيضًا في زيادة ذوبان بعض البروتينات المُعبَّر عنها. كما يمكن لبروتينات اندماجية أخرى، مثل البروتين الفلوري الأخضر، أن تعمل كجين مُبلِّغ لتحديد الجينات المستنسخة بنجاح، أو يمكن استخدامها لدراسة التعبير البروتيني في التصوير الخلوي . ^{[ 4 ] [ 5 ]}

يتم تحويل ناقل التعبير أو نقله إلى الخلية المضيفة لتخليق البروتين. قد تحتوي بعض نواقل التعبير على عناصر للتحويل أو إدخال الحمض النووي في كروموسوم الخلية المضيفة، على سبيل المثال جينات vir لتحويل النباتات ، ومواقع الإنتغراز للتكامل الكروموسومي.

قد تتضمن بعض النواقل تسلسل استهداف قد يستهدف البروتين المعبر عنه إلى موقع محدد مثل الفضاء المحيط بالبلازما في البكتيريا.

تُعدّ بكتيريا الإشريكية القولونية (Escherichia coli) المضيف الأمثل لإنتاج العديد من البروتينات، إذ يتميز إنتاج البروتينات غير المتجانسة فيها بالسهولة واليسر، فضلاً عن سرعته وانخفاض تكلفته. كما يتوفر عدد كبير من بلازميدات التعبير الخاصة بالإشريكية القولونية لتلبية احتياجات متنوعة. ومن البكتيريا الأخرى المستخدمة في إنتاج البروتينات بكتيريا العصوية الرقيقة (Bacillus subtilis ).

تُعبَّر معظم البروتينات غير المتجانسة في سيتوبلازم بكتيريا الإشريكية القولونية . مع ذلك، قد لا تكون جميع البروتينات المُشكَّلة قابلة للذوبان في السيتوبلازم، وقد تُشكِّل البروتينات المطوية بشكل خاطئ في السيتوبلازم تجمعات غير قابلة للذوبان تُسمى أجسام الإدراج . تتطلب هذه البروتينات غير القابلة للذوبان إعادة طي، وهي عملية معقدة وقد لا تُنتج بالضرورة كمية كبيرة. ^{[ 6 ]} غالبًا ما تعجز البروتينات التي تحتوي على روابط ثنائية الكبريتيد عن الطي بشكل صحيح بسبب البيئة المُختزلة في السيتوبلازم التي تمنع تكوين هذه الروابط، ويتمثل أحد الحلول الممكنة في توجيه البروتين إلى الحيز المحيط بالبلازما باستخدام تسلسل إشارة في الطرف الأميني . ثمة احتمال آخر يتمثل في التلاعب ببيئة الأكسدة والاختزال في السيتوبلازم. ^{[ 7 ]} يجري أيضًا تطوير أنظمة أخرى أكثر تطورًا؛ قد تسمح هذه الأنظمة بالتعبير عن بروتينات كان يُعتقد سابقًا استحالة إنتاجها في بكتيريا الإشريكية القولونية ، مثل البروتينات المُغلْكَزة . ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]}

تعتمد المحفزات المستخدمة في هذه النواقل عادةً على محفز أوبيرون اللاكتوز أو محفز T7 ، ^{[ 11 ]} ويتم تنظيمها عادةً بواسطة مُشغِّل اللاكتوز . قد تكون هذه المحفزات أيضًا هجينة من محفزات مختلفة، على سبيل المثال، محفز Tac هو هجين من محفزي trp و lac . ^{[ 12 ]} تجدر الإشارة إلى أن معظم محفزات اللاكتوز أو المشتقة منه شائعة الاستخدام تعتمد على طفرة lac UV5 غير الحساسة لتثبيط الكاتابوليت . تسمح هذه الطفرة بالتعبير عن البروتين تحت سيطرة محفز اللاكتوز عندما يحتوي وسط النمو على الجلوكوز، حيث أن الجلوكوز سيثبط التعبير الجيني إذا تم استخدام محفز اللاكتوز من النوع البري. ^{[ 13 ]} ومع ذلك، يمكن استخدام وجود الجلوكوز لتقليل التعبير الخلفي من خلال التثبيط المتبقي في بعض الأنظمة. ^{[ 14 ]}

من أمثلة نواقل التعبير في بكتيريا الإشريكية القولونية سلسلة نواقل pGEX حيث يُستخدم إنزيم ناقل الغلوتاثيون S كشريك اندماجي ويخضع التعبير الجيني لسيطرة محفز tac، ^{[ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]} وسلسلة نواقل pET التي تستخدم محفز T7 . ^{[ 18 ]}

من الممكن التعبير عن بروتينين أو أكثر في بكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بلازميدات مختلفة. مع ذلك، عند استخدام بلازميدين أو أكثر، يجب أن يستخدم كل بلازميد مضادًا حيويًا مختلفًا، بالإضافة إلى منشأ تضاعف مختلف، وإلا فقد لا يتم الحفاظ على استقرار أحد البلازميدات. تعتمد العديد من البلازميدات الشائعة الاستخدام على مُضاعِف ColE1 ، وبالتالي فهي غير متوافقة مع بعضها البعض؛ ولكي يتعايش بلازميد قائم على ColE1 مع آخر في الخلية نفسها، يجب أن يكون الآخر من مُضاعِف مختلف، مثل بلازميد قائم على مُضاعِف p15A كسلسلة بلازميدات pACYC. ^{[ 19 ]} يتمثل نهج آخر في استخدام ناقل واحد ثنائي الجينات أو تصميم تسلسلات الترميز بشكل متسلسل كبنية ثنائية أو متعددة الجينات. ^{[ 20 ] [ 21 ]}

تُعدّ خميرة Pichia pastoris من الخمائر الشائعة الاستخدام في إنتاج البروتين . ^{[ 22 ]} ومن أمثلة نواقل التعبير في خميرة Pichia سلسلة نواقل pPIC، التي تستخدم مُحفِّز AOX1 القابل للتحفيز بالميثانول . ^{[ 23 ]} قد تحتوي البلازميدات على عناصر لإدخال الحمض النووي الغريب في جينوم الخميرة، بالإضافة إلى تسلسل إشارة لإفراز البروتين المُعبَّر عنه. ويمكن إنتاج البروتينات ذات الروابط ثنائية الكبريتيد والبروتينات المُغلْكَزة بكفاءة عالية في الخميرة. ومن الخمائر الأخرى المستخدمة في إنتاج البروتين خميرة Kluyveromyces lactis ، حيث يُعبَّر عن الجين بواسطة مُتحوِّل من مُحفِّز اللاكتيز القوي LAC4. ^{[ 24 ]}

تُستخدم خميرة Saccharomyces cerevisiae على نطاق واسع في دراسات التعبير الجيني في الخميرة، على سبيل المثال في نظام التفاعل الثنائي للخميرة لدراسة تفاعل البروتين-بروتين. ^{[ 25 ]} تحتوي النواقل المستخدمة في نظام التفاعل الثنائي للخميرة على شركاء اندماج لجينين مستنسخين، مما يسمح بنسخ جين مُخبِر عند حدوث تفاعل بين البروتينين المُعبَّر عنهما من الجينات المستنسخة.

يُستخدم فيروس الباكولوفيروس ، وهو فيروس عصوي الشكل يُصيب خلايا الحشرات، كناقل للتعبير الجيني في هذا النظام. ^{[ 26 ]} وتُستخدم سلالات خلايا الحشرات المُشتقة من حرشفيات الأجنحة (العث والفراشات)، مثل دودة الذرة الخريفية (Spodoptera frugiperda )، كمضيف. وتُعد سلالة الخلايا المُشتقة من دودة الملفوف ذات أهمية خاصة، إذ طُوّرت لتنمو بسرعة ودون الحاجة إلى المصل باهظ الثمن الذي يُستخدم عادةً لتحفيز نمو الخلايا. ^{[ 27 ] [ 28 ]} يُسمى ناقل النقل البلازميد، ويخضع التعبير الجيني لسيطرة مُحفز قوي يُسمى pPolh. ^{[ 29 ]} كما استُخدم فيروس الباكولوفيروس مع سلالات خلايا الثدييات في نظام BacMam . ^{[ 30 ]}

يُستخدم الفيروس الباكولوفيروس عادةً لإنتاج البروتينات السكرية ، على الرغم من أن عملية الغلكزة قد تختلف عن تلك الموجودة في الفقاريات. وبشكل عام، يُعد استخدامه أكثر أمانًا من الفيروسات الثديية نظرًا لنطاق عوائله المحدود وعدم قدرته على إصابة الفقاريات دون تعديلات.

تعتمد العديد من نواقل التعبير الجيني النباتية على بلازميد Ti الخاص ببكتيريا Agrobacterium tumefaciens . ^{[ 31 ]} في هذه النواقل، يُستنسخ الحمض النووي المراد إدخاله في النبات في الحمض النووي T ، وهو تسلسل من الحمض النووي محاط بتسلسل تكراري مباشر بطول 25 زوجًا قاعديًا من كلا الطرفين، ويمكنه الاندماج في جينوم النبات. يحتوي الحمض النووي T أيضًا على الواسم الانتقائي. توفر بكتيريا Agrobacterium آلية للتحويل ، والاندماج في جينوم النبات، ويمكن أيضًا استخدام محفزات جيناتها الفيروسية للجينات المستنسخة. مع ذلك، أدت المخاوف بشأن انتقال المادة الوراثية البكتيرية أو الفيروسية إلى النبات إلى تطوير نواقل تُسمى النواقل داخل الجينومية، حيث تُستخدم فيها مكافئات وظيفية لجينوم النبات، بحيث لا يحدث انتقال للمادة الوراثية من نوع غريب إلى النبات. ^{[ 32 ]}

يمكن استخدام الفيروسات النباتية كناقلات نظرًا لأن طريقة الأجروبكتيريوم لا تُجدي نفعًا مع جميع النباتات. ومن أمثلة الفيروسات النباتية المستخدمة فيروس تبرقش التبغ (TMV)، وفيروس البطاطا X ، وفيروس تبرقش اللوبيا . ^{[ 33 ]} يمكن التعبير عن البروتين كبروتين مُدمج مع البروتين الغلافي للفيروس، ويُعرض على سطح الجسيمات الفيروسية المُجمّعة، أو كبروتين غير مُدمج يتراكم داخل النبات. غالبًا ما يكون التعبير في النبات باستخدام النواقل النباتية مُستمرًا، ^{[ 34 ]} ومن المُحفزات المُستمرة الشائعة الاستخدام في نواقل التعبير النباتية مُحفز فيروس تبرقش القرنبيط (CaMV) 35S. ^{[ 35 ] [ 36 ]}

توفر نواقل التعبير في الخلايا الثديية مزايا كبيرة للتعبير عن البروتينات الثديية مقارنةً بأنظمة التعبير البكتيرية، وذلك من حيث الطي الصحيح، والتعديلات اللاحقة للترجمة، والنشاط الإنزيمي المناسب. وقد تكون هذه النواقل أكثر ملاءمةً من أنظمة حقيقية النواة غير الثديية الأخرى، حيث قد لا تحتوي البروتينات المُعبر عنها على الغلكزة الصحيحة. وهي مفيدة بشكل خاص في إنتاج البروتينات المرتبطة بالغشاء التي تتطلب بروتينات مُرافقة للطي الصحيح والاستقرار، بالإضافة إلى احتوائها على العديد من التعديلات اللاحقة للترجمة. مع ذلك، يتمثل العيب في انخفاض إنتاجية المنتج مقارنةً بالنواقل بدائية النواة، فضلاً عن ارتفاع تكلفة التقنيات المستخدمة. كما أن تعقيد تقنيتها، واحتمالية تلوثها بالفيروسات الحيوانية، قد حدّ من استخدامها في الإنتاج الصناعي واسع النطاق. ^{[ 37 ]}

يمكن استخدام خطوط الخلايا الثديية المستزرعة، مثل خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) وخلايا COS ، بما في ذلك خطوط الخلايا البشرية مثل خلايا HEK وخلايا HeLa، لإنتاج البروتين. تُنقل النواقل إلى الخلايا، وقد يندمج الحمض النووي في الجينوم عن طريق إعادة التركيب المتماثل في حالة النقل المستقر، أو قد تُنقل الخلايا بشكل مؤقت. تشمل أمثلة نواقل التعبير في الثدييات النواقل الفيروسية الغدية ، ^{[ 38 ]} وسلسلة نواقل البلازميد pSV وpCMV، ونواقل فيروس الوقس والفيروسات القهقرية ، ^{[ 39 ]} بالإضافة إلى فيروسات الباكولوفيروس. ^{[ 30 ]} تُستخدم محفزات الفيروس المضخم للخلايا (CMV) وفيروس SV40 بشكل شائع في نواقل التعبير في الثدييات لتوجيه التعبير الجيني. كما تُعرف محفزات غير فيروسية، مثل محفز عامل الاستطالة (EF)-1. ^{[ 40 ]}

يُستخدم مستخلص خلايا الإشريكية القولونية ، الذي يحتوي على المكونات الخلوية اللازمة لعمليتي النسخ والترجمة، في هذه الطريقة المخبرية لإنتاج البروتين. وتكمن ميزة هذا النظام في إمكانية إنتاج البروتين بسرعة أكبر بكثير من إنتاجه داخل الخلايا الحية، إذ لا يتطلب وقتًا لزراعة الخلايا، ولكنه في الوقت نفسه أكثر تكلفة. ويمكن استخدام النواقل المستخدمة للتعبير في الإشريكية القولونية في هذا النظام، مع العلم أن هناك نواقل مصممة خصيصًا لهذا الغرض. كما يمكن استخدام مستخلصات الخلايا حقيقية النواة في أنظمة أخرى خالية من الخلايا، مثل أنظمة التعبير الخالية من الخلايا في جنين القمح . ^{[ 41 ]} وقد تم إنتاج أنظمة خالية من الخلايا في الثدييات أيضًا. ^{[ 42 ]}

يُعدّ استخدام ناقل التعبير في مضيف التعبير الطريقة المعتادة في المختبرات لإنتاج البروتينات لأغراض البحث. تُنتَج معظم البروتينات في بكتيريا الإشريكية القولونية ، ولكن بالنسبة للبروتينات المُغلْكَزة وتلك التي تحتوي على روابط ثنائية الكبريتيد، يُمكن استخدام الخميرة والفيروسات الباكولية وأنظمة الثدييات.

تُنتَج معظم الأدوية البروتينية حاليًا بتقنية الحمض النووي المؤتلف باستخدام نواقل التعبير. وتشمل هذه الأدوية الببتيدية والبروتينية هرمونات، ولقاحات، ومضادات حيوية، وأجسامًا مضادة، وإنزيمات. ^{[ 43 ]} وقد طُرِح أول بروتين بشري مؤتلف يُستخدم في علاج الأمراض، وهو الأنسولين، عام 1982. ^{[ 43 ]} تُتيح التقنية الحيوية إنتاج هذه الأدوية الببتيدية والبروتينية بكميات كبيرة، والتي كان بعضها نادرًا أو يصعب الحصول عليه سابقًا. كما تُقلل من مخاطر التلوث بالملوثات مثل الفيروسات المضيفة، والسموم، والبريونات . ومن الأمثلة على ذلك تلوث هرمون النمو بالبريونات ، والذي استُخلص من الغدد النخامية المأخوذة من جثث بشرية، مما تسبب في مرض كروتزفيلد-جاكوب لدى المرضى الذين يتلقون علاجًا للتقزم ، ^{[ 44 ]} بالإضافة إلى التلوث الفيروسي في عامل التخثر الثامن المعزول من دم الإنسان، والذي أدى إلى انتقال أمراض فيروسية مثل التهاب الكبد والإيدز . ^{[ 45 ] [ 46 ]} يتم تقليل هذا الخطر أو إزالته تمامًا عندما يتم إنتاج البروتينات في خلايا مضيفة غير بشرية.

في السنوات الأخيرة، استُخدمت نواقل التعبير الجيني لإدخال جينات محددة في النباتات والحيوانات لإنتاج كائنات معدلة وراثيًا ، كما هو الحال في الزراعة لإنتاج نباتات معدلة وراثيًا . وقد استُخدمت هذه النواقل لإدخال بيتا كاروتين، وهو طليعة فيتامين أ ، في نباتات الأرز، ما يُعرف بالأرز الذهبي . كما استُخدمت هذه العملية لإدخال جين في النباتات يُنتج مبيدًا حشريًا يُسمى سم بكتيريا Bacillus thuringiensis ( سم Bt) ، مما يُقلل من حاجة المزارعين لاستخدام المبيدات الحشرية نظرًا لإنتاجه بواسطة الكائن المُعدَّل. إضافةً إلى ذلك، تُستخدم نواقل التعبير الجيني لإطالة فترة نضج الطماطم عن طريق تعديل النبات بحيث يُنتج كمية أقل من المادة الكيميائية المُسببة لتعفن الطماطم. ^{[ 47 ]} وقد أُثير جدل حول استخدام نواقل التعبير الجيني لتعديل المحاصيل نظرًا لاحتمالية وجود مخاطر صحية غير معروفة، وإمكانية قيام الشركات بتسجيل براءات اختراع لبعض المحاصيل الغذائية المعدلة وراثيًا ، فضلًا عن المخاوف الأخلاقية. ومع ذلك، لا تزال هذه التقنية قيد الاستخدام والبحوث المكثفة.

تم إنتاج حيوانات معدلة وراثيًا لدراسة العمليات الكيميائية الحيوية الحيوانية والأمراض البشرية، أو استُخدمت لإنتاج المستحضرات الصيدلانية والبروتينات الأخرى. كما يمكن هندستها وراثيًا لامتلاك سمات مفيدة أو مرغوبة. يُستخدم البروتين الفلوري الأخضر أحيانًا كعلامة، مما ينتج عنه حيوانات قادرة على إصدار الفلورة، وقد استُغلت هذه الخاصية تجاريًا لإنتاج أسماك GloFish الفلورية .

يُعدّ العلاج الجيني علاجًا واعدًا لعدد من الأمراض، حيث يُدخَل جين "سليم" محمول بواسطة ناقل إلى الجينوم، ليحل محل جين "غير سليم" أو لتعزيز التعبير عن جين معين. تُستخدم النواقل الفيروسية بشكل عام، ولكن يجري تطوير طرق أخرى غير فيروسية لإيصال الجينات. لا يزال هذا العلاج خيارًا محفوفًا بالمخاطر نظرًا للناقل الفيروسي المستخدم الذي قد يُسبب آثارًا جانبية، مثل حدوث طفرات إدخالية قد تؤدي إلى الإصابة بالسرطان. ^{[ 48 ] [ 49 ]} ومع ذلك، فقد ظهرت نتائج واعدة. ^{[ 50 ] [ 51 ]}

تُعدّ نواقل التعبير أدوات أساسية في البيولوجيا الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية لتوجيه التعبير عن الجينات المستنسخة في الخلايا المضيفة، مما يُتيح دراسة وظيفة الجينات وإنتاج البروتينات المؤتلفة. ونظرًا لاستخدامها الواسع في البحوث، تُحفظ نواقل التعبير المرجعية في مراكز الموارد البيولوجية العامة والمستودعات غير الربحية، مما يُسهّل وصول العلماء في جميع أنحاء العالم إلى مواد موحدة؛ ومن هذه المستودعات BCCM/GeneCorner وAddgene.