التحلل البروتيني المتوازي السريع

يُعد التحليل البروتيني المتوازي السريع ( FASTpp ) طريقة لتحديد الثبات الحراري للبروتينات عن طريق قياس نسبة البروتين التي تقاوم الهضم البروتيني السريع . ^{[ 1 ]}

يُستخدم التحلل البروتيني على نطاق واسع في الكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الخلوي لدراسة بنية البروتين . ^{[ 2 ] [ 3 ]} في "التحلل البروتيني المحدود بالتربسين"، تهضم كميات قليلة من البروتياز البروتينات المطوية وغير المطوية، ولكن بمعدلات مختلفة بشكل كبير: تُقطع البروتينات غير المنظمة بسرعة أكبر، بينما تُقطع البروتينات المنظمة بمعدل أبطأ (أحيانًا بفارق عدة مراتب). مؤخرًا، اقتُرحت عدة طرق أخرى لقياس استقرار البروتين تعتمد على التحلل البروتيني، وتستغل بروتيازات أخرى ذات خصوصية عالية لقطع البروتينات غير المطوية. تشمل هذه الطرق التحلل البروتيني النبضي، ^{[ 4 ]} والمسعرية المسحية البروتينية، ^{[ 5 ]} وFASTpp.

يقيس اختبار FASTpp كمية البروتين المقاوم للهضم في ظروف مختلفة. ولتحقيق ذلك، يُستخدم إنزيم بروتيني مقاوم للحرارة، يقوم بقطع البروتين تحديدًا عند بقايا الأحماض الأمينية الكارهة للماء المكشوفة . يجمع اختبار FASTpp بين خاصية التفكك الحراري، وخصوصية الإنزيم البروتيني المقاوم للحرارة للجزء غير المطوي، وقدرة الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE . ^{[ 6 ]} بفضل هذا المزيج، يستطيع FASTpp رصد التغيرات في الجزء المطوي ضمن نطاق واسع من الظروف الفيزيائية والكيميائية، بما في ذلك درجات حرارة تصل إلى 85  درجة مئوية، ودرجة حموضة تتراوح بين 6 و9، ووجود أو غياب البروتينوم الكامل . تتراوح تطبيقاته من التقنية الحيوية إلى دراسة الطفرات النقطية واختبارات ارتباط الليجاند .

تم استخدام برنامج FASTpp للتحقق من: ^{[ 1 ]}

• تأثير المستخلص على استقرار البروتين
• استقرار البروتينات الحرارية ^{[ 7 ]}
• الطي والربط المزدوج ^{[ 8 ]}
• تأثيرات الليجاند على نسبة الطي والاستقرار ^{[ 9 ]}
• تأثير الطفرات على نسبة الطي والاستقرار (على سبيل المثال ، الطفرة النقطية / الطفرات غير المترادفة ^{[ 9 ] [ 10 ]} )
• استقرار البروتين الحركي ^{[ 11 ]}

أولًا، يتم تحضير مستخلص خلوي باستخدام خرز زجاجي، أو تجانس بالضغط، أو طرق تحلل كيميائية أو فيزيائية لا تُؤدي إلى تغيير طبيعة البروتين (البروتينات) المراد دراستها. (اختياريًا للتحليل المُستهدف) يُنقى البروتين المراد دراسته من هذا المستخلص باستخدام طرق التقارب القائمة على علامات غير منتظمة بنيويًا ^{[ 12 ]} أو استراتيجيات تنقية مناسبة أخرى، والتي غالبًا ما تتضمن عدة خطوات كروماتوغرافية متعامدة.

يُقسّم محلول البروتين (الكلي أو المُنقّى) إلى عدة أنابيب في شريط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تُعرّض جميع الأجزاء بالتوازي في جهاز تدوير حراري متدرج لتفاعل البوليميراز المتسلسل لدرجات حرارة قصوى مختلفة بوجود إنزيم الثيرموليسين المقاوم للحرارة (انظر الشكل). يتم التحكم الآلي في درجة الحرارة في جهاز التدوير الحراري المتدرج (المستخدم عادةً في تفاعلات البوليميراز المتسلسل ). يمكن فصل نواتج التفاعل باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي SDS-PAGE أو تقنية ويسترن بلوت . ^{[ 6 ]} يمكن تعطيل إنزيم الثيرموليسين تمامًا باستخدام EDTA . هذه الخاصية للثيرموليسين تجعل FASTpp متوافقًا مع الهضم اللاحق بالتربسين، على سبيل المثال، لتحليل الطيف الكتلي . ^{[ 13 ] [ 14 ] [ 7 ]}