التجزئة في المختبر

📅 آخر تحديث: ١ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ١ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 1 صور
الموسوعة الحرة

التجزئة الخلوية في المختبر ( IVC ) هي تقنية تعتمد على المستحلبات لتوليد حجيرات شبيهة بالخلايا في المختبر . تُصمم هذه الحجيرات بحيث لا تحتوي كل منها على أكثر من جين واحد. عند نسخ الجينو/أو ترجمته ، تُحصرنواتج ترجمته ( الحمض النووي الريبوزي و/أو البروتينات ) مع الجين المُشفِّر داخل الحجيرة. من خلال ربط النمط الجيني ( الحمض النووي ) بالنمط الظاهري (الحمض النووي الريبوزي، البروتين)، تسمح التجزئة الخلوية بانتقاء النمط الظاهري وتطويره.

تاريخ

طُوِّرت طريقة التجزئة المختبرية لأول مرة على يد دان توفيق وأندرو غريفيث. [ 1 ] وانطلاقًا من فكرة أن التطور الدارويني يعتمد على ارتباط النمط الجيني بالنمط الظاهري، صمّم توفيق وغريفيث حجيرات مائية من مستحلبات الماء في الزيت (w/o) لمحاكاة الحجيرات الخلوية التي تربط بين النمط الجيني والنمط الظاهري . تكوّنت مستحلبات الحجيرات الشبيهة بالخلايا بإضافة مزيج تفاعل النسخ / الترجمة المختبري إلى زيت معدني مُحَرَّك يحتوي على مواد فعالة سطحية . وقد قُيس متوسط ​​قطر القطيرات باستخدام حيود الليزر، فكان 2.6 ميكرومتر. ولإثبات صحة المفهوم، صمّم توفيق وغريفيث تجربة انتقاء باستخدام مجموعة من تسلسلات الحمض النووي، بما في ذلك الجين المُشفِّر لإنزيم ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي HaeIII (M.HaeIII) بوجود فائض مقداره 10⁷ من الجينات المُشفِّرة لإنزيم مختلف يُدعى folA. صُممت النهاية 3' لكل تسلسل من تسلسلات الحمض النووي خصيصًا لتحتوي على موقع تعرف لإنزيم HaeIII ، والذي، في وجود إنزيم ميثيل ترانسفيراز المُعبَّر عنه، سيخضع لعملية الميثيل، وبالتالي يصبح مقاومًا لهضم إنزيمات التقييد . ومن خلال اختيار تسلسلات الحمض النووي التي تنجو من هضم الإندونوكلياز، وجد توفيق وغريفيث أن جينات M.HaeIII قد زادت بنسبة 1000 ضعف على الأقل مقارنةً بجينات folA خلال الجولة الأولى من الاختيار. 

طريقة

مقارنة بين تجزئة الخلايا داخل الجسم الحي (يسار) وتجزئة الخلايا في المختبر (يمين) باستخدام قطرات مستحلب مزدوج وفرز فلوري . 1) في النظام داخل الجسم الحي ، تُحوَّل مكتبة من الجينات إلى بكتيريا لإنتاج متغيرات البروتين، ثم تُوزَّع في مستحلب ماء في زيت (w/o) بحيث تحتوي كل قطرة على خلية واحدة كحد أقصى. 2) في النظام في المختبر ، لا تُستخدم خلايا، بل تُنتَج متغيرات البروتين عبر النسخ/الترجمة في المختبر بحيث تحتوي كل قطرة على جين واحد. 3، 4) في كلتا الحالتين، تُعلَّق القطرات في الماء لتكوين مستحلب ماء في زيت في ماء (w/o/w)، ويُضاف إليها ركيزة فلورية، ثم تُمرَّر أمام الليزر والكاشف في جهاز فرز الخلايا المُنشَّط بالفلورة. يؤدي هذا إلى عزل الجينات التي تشفر متغيرات البروتين النشطة وتضخيمها، وتسلسلها واستخدامها في جولات أخرى من الانتقاء أو التطور الموجه. [ 2 ]

تقنية المستحلب

تُحضّر مستحلبات الماء في الزيت (w/o) بمزج الطورين المائي والزيتي باستخدام مواد فعالة سطحية. يتكون مستحلب IVC النموذجي أولًا بتحضير مزيج الزيت والمادة الفعالة سطحيًا عن طريق التحريك، ثم إضافة الطور المائي تدريجيًا إلى هذا المزيج. ولتكوين مستحلب مستقر، يلزم مزيج من المواد الفعالة سطحيًا ذات التوازن الهيدروفيلي-الدهوني ( HLB ) ومواد فعالة سطحية ذات قيمة HLB منخفضة. [ 3 ] من بين تركيبات المواد الفعالة سطحيًا المستخدمة لتحضير مزيج الزيت والمادة الفعالة سطحيًا: الزيت المعدني / 0.5% توين 80 / 4.5% سبان 80 / ديوكسيكولات الصوديوم [ 1 ] ، ونسخة أكثر استقرارًا حراريًا: الزيت المعدني الخفيف / 0.4% توين 80 / 4.5% سبان 80 / 0.05% تريتون X-100 . [ 4 ] يتم إضافة الطور المائي الذي يحتوي على مكونات النسخ و/أو الترجمة ببطء إلى المواد الخافضة للتوتر السطحي الزيتية، ويتم تسهيل تكوين الماء في الزيت عن طريق التجنيس أو التحريك أو استخدام جهاز البثق اليدوي.

يمكن تحديد جودة المستحلب باستخدام المجهر الضوئي و/أو تقنيات تشتت الضوء الديناميكي . يتميز المستحلب بتنوعه الكبير، وتساعد سرعات التجنيس العالية على إنتاج قطرات أصغر ذات توزيع حجمي أضيق. مع ذلك، يجب التحكم في سرعات التجنيس، إذ أن السرعات التي تتجاوز 13500 دورة في الدقيقة تؤدي إلى فقدان ملحوظ في نشاط الإنزيم على مستوى النسخ. تُنتج عملية تكوين المستحلب الأكثر شيوعًا قطرات بقطر متوسط ​​يتراوح بين 2 و3 ميكرومتر، وحجم متوسط ​​يبلغ حوالي 5 فيمتولتر، أو 10^ 10 قطرة مائية لكل مل من المستحلب. [ 5 ] تم تصميم نسبة الجينات إلى القطرات بحيث لا تحتوي معظم القطرات إحصائيًا على أكثر من جين واحد.

النسخ/الترجمة في المختبر

تُمكّن تقنية الحوسبة في المختبر (IVC) من تصغير التقنيات واسعة النطاق، بحيث يُمكن إجراؤها الآن على المستوى الميكروي، بما في ذلك تجارب النسخ والترجمة في المختبر (IVTT). يُتيح تبسيط ودمج عمليتي النسخ والترجمة تصميمات تجريبية سريعة وقابلة للتحكم بدرجة عالية. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] يُمكن إجراء تجارب IVTT في كلٍ من المستحلبات الكبيرة والقطرات الميكروية باستخدام تقنية الموائع الدقيقة القائمة على القطرات . وقد استُخدمت القطرات الميكروية، التي يتراوح حجمها من البيكو إلى الفيمتولتر، بنجاح كأوعية لجزيء DNA واحد. [ 9 ] [ 10 ] تُتيح هذه التقنية تحليلًا عالي الإنتاجية مع العديد من ضغوط الانتقاء المختلفة في إعداد تجريبي واحد. [ 6 ] [ 10 ] يُفضّل استخدام تقنية IVTT في القطرات الميكروية عندما يكون الإفراط في التعبير عن بروتين مُحدد سامًا للخلية المضيفة، مما يُقلل من فائدة آليات النسخ والترجمة. [ 11 ]

استخدمت شركة IVC مستخلصات الخلايا البكتيرية، وجنين القمح، وخلايا الشبكية الأرنبية (RRL) في عمليتي النسخ والترجمة. كما يُمكن استخدام نظام ترجمة بكتيري مُعاد تكوينه، مثل PURE، حيث تُنقى مكونات الترجمة بشكل فردي ثم تُدمج لاحقًا. عند التعبير عن البروتينات حقيقية النواة أو البروتينات المعقدة، يُفضل استخدام أنظمة ترجمة حقيقية النواة، مثل مستخلص جنين القمح، أو بديل أفضل، وهو مستخلص خلايا الشبكية الأرنبية (RRL). لاستخدام RRL في النسخ والترجمة، لا يُمكن استخدام تركيبة المستحلب التقليدية لأنها تُعيق عملية الترجمة. بدلاً من ذلك، طُوّرت تركيبة مستحلب جديدة: 4% Abil EM90 / زيت معدني خفيف، وثبتت فعاليتها في التعبير عن إنزيم لوسيفيراز وإنزيم تيلوميراز البشري . [ 12 ]

كسر المستحلب وربط النمط الجيني والنمط الظاهري

بمجرد اكتمال عملية النسخ و/أو الترجمة في القطرات، يتم فصل المستحلب عبر خطوات متتالية لإزالة الزيت المعدني والمواد الفعالة سطحيًا، مما يسمح بالاختيار اللاحق. في هذه المرحلة، من الضروري وجود طريقة لتتبع كل منتج جيني إلى الجين المشفر له، حيث يصبح حرًا في مجموعة غير متجانسة من الجزيئات. هناك ثلاث طرق رئيسية لتتبع كل نمط ظاهري إلى نمطه الجيني. [ 13 ] الطريقة الأولى هي ربط كل جزيء DNA بمجموعة بيوتين وتسلسل ترميز إضافي للستربتافيدين (عرض STABLE). [ 14 ] ستكون جميع البروتينات/الببتيدات المتكونة حديثًا مندمجة مع جزيئات الستربتافيدين وترتبط بتسلسل الترميز البيوتينيلي الخاص بها. أما النسخة المحسنة، فتربط جزيئين من البيوتين بنهايتي جزيء DNA لزيادة قوة الارتباط بين جزيء DNA والببتيدات المندمجة مع الستربتافيدين، وتستخدم جين ستربتافيدين اصطناعي منخفض المحتوى GC لزيادة الكفاءة والنوعية أثناء تضخيم PCR. [ 15 ] الطريقة الثانية هي الربط التساهمي بين الحمض النووي والبروتين. وقد تم إثبات استراتيجيتين. الأولى هي تكوين بروتينات اندماجية مع M.HaeIII. [ 16 ] سيكون كل بروتين/ببتيد مُعبَّر عنه مُندمجًا مع نطاق ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي Hae III، القادر على الارتباط تساهميًا بقطع الحمض النووي التي تحتوي على التسلسل 5′-GGC*-3′، حيث C* هو 5-فلورو-2-ديوكسي سيتيدين. أما الاستراتيجية الثانية فهي استخدام طفرة أحادية من إنزيم VirD2. [ 17 ] عند التعبير عن بروتين/ببتيد مُندمجًا مع بروتين VirD2 من بكتيريا الأجروبكتيريوم، فإنه سيرتبط بتسلسل ترميز الحمض النووي الخاص به والذي يحتوي على نتوء أحادي السلسلة يتضمن تسلسلات التعرف على حدود T لـ VirD2. أما الطريقة الثالثة فهي ربط النمط الظاهري بالنمط الجيني عبر الخرز. [ 18 ] سيتم تغليف الخرز المستخدم بالستربتافيدين للسماح بربط الحمض النووي البيوتيني، بالإضافة إلى ذلك، ستعرض الخرز أيضًا شريك ربط متجانس لعلامة التقارب التي سيتم التعبير عنها بالاندماج مع البروتين / الببتيد.

اختيار

تُستخدم استراتيجيات اختيار مختلفة تبعًا للنمط الظاهري المراد اختياره. يمكن تقسيم استراتيجية الاختيار إلى ثلاث فئات رئيسية: الاختيار للارتباط، والاختيار للتحفيز، والاختيار للتنظيم. [ 19 ] يتراوح النمط الظاهري المراد اختياره من الحمض النووي الريبي (RNA) إلى الببتيدات إلى البروتينات. عند اختيار الارتباط، تكون الأنماط الظاهرية الأكثر شيوعًا هي الببتيدات/البروتينات التي تتمتع بألفة انتقائية تجاه جسم مضاد أو جزيء DNA محدد. ومن الأمثلة على ذلك اختيار البروتينات ذات الألفة تجاه DNA ذي أصابع الزنك بواسطة سيب وآخرون. [ 20 ] عند اختيار البروتينات/الحمض النووي الريبي المحفز، عادةً ما يتم عزل متغيرات جديدة ذات خصائص إنزيمية جديدة أو محسّنة. على سبيل المثال، تم اختيار متغيرات جديدة من الريبوزيم ذات نشاط ربط ناقل، وقد أظهرت دورات متعددة. [ 21 ] عند اختيار التنظيم، يمكن اختيار مثبطات نوكليازات DNA، مثل مثبطات البروتين لإنزيم كوليسين E7 DNase. [ 22 ]

المزايا

بالمقارنة مع تقنيات العرض المختبري الأخرى ، تتميز تقنية العرض المختبري داخل القطرات (IVC) بميزتين رئيسيتين. الميزة الأولى هي قدرتها على التحكم في التفاعلات داخل القطرات. إذ يُمكن إيصال المكونات الكارهة للماء والمحبة للماء إلى كل قطرة تدريجيًا دون المساس بسلامتها الكيميائية، وبالتالي، من خلال التحكم في نوع المكونات المضافة وتوقيت إضافتها، يُمكن التحكم في التفاعل داخل كل قطرة. إضافةً إلى ذلك، يُمكن تغيير درجة حموضة كل قطرة تبعًا لطبيعة التفاعل المطلوب. ومؤخرًا، استُخدمت ركائز مُغطاة ضوئيًا، وتم تنظيم مشاركتها في التفاعل عن طريق التنشيط الضوئي. [ 19 ] أما الميزة الثانية، فهي أن تقنية العرض المختبري داخل القطرات (IVC) تسمح بانتقاء الجزيئات الحفازة. فعلى سبيل المثال، تمكن غريفيث وزملاؤه من انتقاء متغيرات فوسفوتريستيراز ذات قيمة K cat أعلى، وذلك عن طريق الكشف عن تكوين الناتج وكميته باستخدام الأجسام المضادة للمنتج وقياس التدفق الخلوي على التوالي. [ 23 ]

مراجع

  1. 1 2 توفيق، د. س.، وغريفيث ، أ. د. (يوليو 1998). "حجيرات شبيهة بالخلايا من صنع الإنسان للتطور الجزيئي". مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 16 (7): 652-656 . doi : 10.1038/nbt0798-652 . PMID 9661199. S2CID 25527137 .  
  2. ↑ فيرير م، بيلوكي أ، فييتس ج م، غوازاروني م إ، بيرغر إ، أهاروني أ (يناير 2009). "التفاعل بين علم الجينوم البيئي والتجزئة المختبرية" . التكنولوجيا الحيوية الميكروبية . 2 (1): 31-39 . doi : 10.1111/j.1751-7915.2008.00057.x . PMC 3815420. PMID 21261880 .  
  3. ↑ روث أ، سورجادي ر.ن، باور ب.إ (ديسمبر 2006). "بروتينات جديدة في المستحلبات باستخدام التجزئة المختبرية". اتجاهات في التكنولوجيا الحيوية . 24 (12): 587-92 . doi : 10.1016/j.tibtech.2006.10.007 . PMID 17055094 . 
  4. ↑ غاديسي، ف. ج.، أونغ، ج. ل.، هوليغر، ب. (أبريل 2001). "التطور الموجه لوظيفة البوليميراز من خلال التضاعف الذاتي المُجزأ" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 98 (8): 4552-4557 . Bibcode : 2001PNAS...98.4552G . doi : 10.1073/pnas.071052198 . PMC 31872. PMID 11274352 .  
  5. ^ ميلر الجريدة الرسمية، بيرناث ك، أجرستي جي جي، أميتاي جي، كيلي بريتيش تيليكوم، ماستروباتيستا إي، تالي الخامس، ماجداسي إس، توفيق دي إس، غريفيث م (يوليو 2006). “التطور الموجه عن طريق التقسيم في المختبر”. طرق الطبيعة . 3 (7): 561–70 . دوى : 10.1038/nmeth897 . بميد 16791215 . S2CID 14125396 .  
  6. 1 2 كاسترو-روا د، زينكين ن (سبتمبر 2015). "منهجية لتحليل النسخ والترجمة في أنظمة النسخ المقترن بالترجمة في المختبر" . طرق . 86 : 51-9 . doi : 10.1016/j.ymeth.2015.05.029 . PMID 26080048 . 
  7. ↑ لوك سي جيه (فبراير 2004). "إنتاج السيربين باستخدام أنظمة النسخ/الترجمة السريعة في المختبر". طرق . 32 (2): 191-198 . doi : 10.1016/s1046-2023(03)00211-1 . PMID 14698632 . 
  8. ↑ ثيبرج إيه بي، كورتوا إف، شيرلي واي، فيشليشنر إم، أبيل سي، هولفيلدر إف، هوك دبليو تي (أغسطس 2010). "القطرات الدقيقة في الموائع الدقيقة: منصة متطورة للاكتشافات في الكيمياء والبيولوجيا" (ملف PDF) . Angewandte Chemie . 49 (34): 5846–68 . doi : 10.1002/anie.200906653 . PMID 20572214 . 
  9. ↑ كينتسيس ب، فان فليت ل د، ديفينيش س ر، هولفيلدر ف (أكتوبر 2010). "قطرات الموائع الدقيقة: سير عمل متكامل جديد للتجارب البيولوجية". الرأي الحالي في البيولوجيا الكيميائية . 14 (5): 548-55 . doi : 10.1016/j.cbpa.2010.08.013 . PMID 20869904 . 
  10. 1 2 كورتوا إف، أولغين إل إف، وايت جي، براتون دي، هوك دبليو تي، أبيل سي، هولفيلدر إف (فبراير 2008). "جهاز متكامل لرصد التعبير الجيني المعتمد على الزمن في المختبر من جينات مفردة في قطرات بيكولتر". ChemBioChem . 9 ( 3): 439-446 . doi : 10.1002/cbic.200700536 . PMID 18232037. S2CID 8684268 .  
  11. ↑ كولين بي واي، زينتشينكو أ، هولفيلدر إف (أغسطس 2015). "الهندسة الإنزيمية في الحجيرات المحاكية بيولوجيًا" . الرأي الحالي في البيولوجيا الهيكلية . 33 : 42-51 . doi : 10.1016/j.sbi.2015.06.001 . PMID 26311177 . 
  12. ↑ غاديسي، ف. ج.، وهوليجر، ب. (مارس 2004). "مزيج مستحلب جديد لتقسيم النسخ والترجمة في المختبر في نظام الخلايا الشبكية للأرانب" . هندسة البروتين، والتصميم، والاختيار . 17 (3): 201-204 . doi : 10.1093/protein/gzh025 . PMID 14990785 . 
  13. ↑ ليمهاوس هـ، شتاين ف، غريفيثس أ.د، هولفيلدر ف (أغسطس 2005). "روابط جديدة بين النمط الجيني والنمط الظاهري للتطور الموجه للبروتينات الوظيفية". الرأي الحالي في البيولوجيا التركيبية . 15 (4): 472-478 . doi : 10.1016/j.sbi.2005.07.006 . PMID 16043338 . 
  14. ↑ يونيزاوا م، دوي ن، هيغاشيناكاغاوا ت، ياناغاوا هـ (مارس 2004). "عرض الحمض النووي للبروتينات النشطة بيولوجيًا لاختيار البروتين في المختبر" . مجلة الكيمياء الحيوية . 135 (3): 285-288 . doi : 10.1093/jb/mvh034 . PMID 15113826 . 
  15. ↑ يونيزاوا م، دوي ن، كاواهاشي ي، هيغاشيناكاغاوا ت، ياناغاوا هـ (أكتوبر 2003). "عرض الحمض النووي للاختيار المختبري لمكتبات الببتيدات المتنوعة" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 31 (19): 118e–118. doi : 10.1093/nar/gng119 . PMC 206484. PMID 14500846 .  
  16. ↑ بيرتشينغر ج، نيري د (سبتمبر 2004). "عرض الحمض النووي التساهمي كأداة جديدة للتطور الموجه للبروتينات في المختبر" . هندسة البروتين، التصميم والاختيار . 17 (9): 699-707 . doi : 10.1093/protein/gzh082 . hdl : 20.500.11850/34052 . PMID 15522920 . 
  17. ↑ دي فيغيريدو، ب.، روبرتس، ر. ل.، نيستر، إ. و. (أكتوبر 2004). "DARTs: تقنية عرض عديد الببتيد في المختبر تعتمد على الحمض النووي". علم البروتينات . 4 (10): 3128-3140 . doi : 10.1002/pmic.200300842 . PMID 15378701. S2CID 24348103 .  
  18. ↑ نورد أو، أولين إم، نيغرين بي إيه (ديسمبر 2003). "عرض البروتينات باستخدام الخرزات الدقيقة من خلال التعبير الخلوي الحر للحمض النووي المرتبط". مجلة التكنولوجيا الحيوية . 106 (1): 1-13 . doi : 10.1016/j.jbiotec.2003.09.002 . PMID 14636705 . 
  19. 1 2 غريفيثز إيه دي، توفيق دي إس (سبتمبر 2006). "تصغير المختبر في قطرات المستحلب". اتجاهات في التكنولوجيا الحيوية . 24 (9): 395-402 . doi : 10.1016/j.tibtech.2006.06.009 . PMID 16843558 . 
  20. ↑ سيب أ، تشو ي (نوفمبر 2005). "اختيار بروتينات ربط الحمض النووي ذات أصابع الزنك باستخدام التجزئة المختبرية في بيئة خالية من الخلايا". مجلة البيولوجيا الجزيئية . 354 (2): 212-219 . doi : 10.1016/j.jmb.2005.09.051 . PMID 16242713 . 
  21. ↑ ليفي م، غريسولد ك.إي، إلينغتون أ.د (أكتوبر 2005). " الاختيار المباشر للريبوزيمات الرابطة المؤثرة عبر التقسيم في المختبر" . RNA . 11 (10): 1555-1562 . doi : 10.1261/rna.2121705 . PMC 1370839. PMID 16131588 .  
  22. ↑ بيرناث ك، ماجداسي س، توفيق د.س. (فبراير 2005). "التطور الموجه لمثبطات البروتين لإنزيمات نوكلياز الحمض النووي عن طريق التجزئة المختبرية (IVC) والتوصيل عبر القطرات النانوية". مجلة البيولوجيا الجزيئية . 345 (5): 1015-26 . doi : 10.1016/j.jmb.2004.11.017 . PMID 15644201 . 
  23. ↑ غريفيثز إيه دي، توفيق دي إس (يناير 2003). "التطور الموجه لإنزيم فوسفوتريستيراز فائق السرعة عن طريق التجزئة المختبرية" . مجلة EMBO . 22 (1): 24-35 . doi : 10.1093/emboj/cdg014 . PMC 140064. PMID 12505981 .