التسلسل التنظيمي

يمكن زيادة التعبير الجيني في الثدييات عند نقل الإشارات إلى المحفزات المرتبطة بالجينات. ويمكن لتسلسلات الحمض النووي التنظيمية المجاورة (cis -regulatory DNA)، الموجودة في مناطق الحمض النووي البعيدة عن محفزات الجينات، أن تُحدث تأثيرات كبيرة على التعبير الجيني، حيث قد يرتفع التعبير عن بعض الجينات بمقدار يصل إلى 100 ضعف نتيجةً لوجود مثل هذه التسلسلات التنظيمية المجاورة . ^{[ 3 ]} تشمل هذه التسلسلات التنظيمية المجاورة المُعززات ، والمثبطات ، والعوازل ، وعناصر الربط. ^{[ 4 ]} ومن بين هذه المجموعة من التسلسلات، تلعب المُعززات وبروتينات عوامل النسخ المرتبطة بها دورًا رئيسيًا في تنظيم التعبير الجيني. ^{[ 5 ]}

المُعززات هي تسلسلات في الجينوم تُعدّ عناصر تنظيمية رئيسية للجينات. تتحكم المُعززات في برامج التعبير الجيني الخاصة بنوع الخلية، وذلك غالبًا عن طريق الالتفاف عبر مسافات طويلة للوصول إلى قرب فيزيائي من مُحفزات جيناتها المستهدفة. ^{[ 6 ]} في دراسة أجريت على خلايا عصبية في قشرة الدماغ، وُجد 24937 التفافًا، تربط المُعززات بالمُحفزات. ^{[ 3 ]} تتشابك مُعززات متعددة، غالبًا ما يكون كل منها على بُعد عشرات أو مئات الآلاف من النيوكليوتيدات من جيناتها المستهدفة، مع مُحفزات جيناتها المستهدفة وتنسق فيما بينها للتحكم في التعبير عن جينها المستهدف المشترك. ^{[ 6 ]}

يوضح الرسم التخطيطي في هذا القسم حلقةً من المُحسِّن تلتف حول مُحفِّز الجين المستهدف لتقترب منه فيزيائيًا. تُثبَّت هذه الحلقة بواسطة ثنائي من بروتين رابط (مثل ثنائي CTCF أو YY1 )، حيث يرتبط أحد جزئي الثنائي بموقع ارتباطه على المُحسِّن، بينما يرتبط الجزء الآخر بموقع ارتباطه على المُحفِّز (مُمثَّل بالخطوط الحمراء المتعرجة في الرسم). ^{[ 7 ]} ترتبط العديد من بروتينات عوامل النسخ الخاصة بوظائف الخلية (أشار لامبرت وآخرون في عام 2018 إلى وجود حوالي 1600 عامل نسخ في الخلية البشرية ^{[ 8 ]} ) عادةً بمواقع محددة على المُحسِّن ^{[ 9 ]} ، وتتحكم مجموعة صغيرة من عوامل النسخ المرتبطة بالمُحسِّن، عند تقريبها من المُحفِّز بواسطة حلقة من الحمض النووي، في مستوى نسخ الجين المستهدف. يقوم الوسيط (المنشط المساعد) (وهو مركب يتكون عادةً من حوالي 26 بروتينًا في بنية متفاعلة) بنقل الإشارات التنظيمية من عوامل النسخ المرتبطة بالحمض النووي المحسن مباشرة إلى إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي II (RNAP II) المرتبط بالمحفز. ^{[ 10 ]}

تُنسخ المُعززات، عند تنشيطها، عادةً من كلا شريطي الحمض النووي بواسطة بوليميرازات الحمض النووي الريبي التي تعمل في اتجاهين مختلفين، مُنتجةً جزيئين من الحمض النووي الريبي المُعزز (eRNA) كما هو موضح في الشكل. ^{[ 11 ]} قد يرتبط مُعزز غير نشط بعامل نسخ غير نشط. قد يؤدي فسفرة عامل النسخ إلى تنشيطه، ثم يقوم عامل النسخ المُنشط بتنشيط المُعزز المرتبط به (انظر النجمة الحمراء الصغيرة التي تُمثل فسفرة عامل النسخ المرتبط بالمُعزز في الرسم التوضيحي). ^{[ 12 ]} يبدأ المُعزز المُنشط بنسخ الحمض النووي الريبي الخاص به قبل تنشيط المُحفز لبدء نسخ الحمض النووي الريبي الرسول من جينه المستهدف. ^{[ 13 ]}

يبلغ طول مواقع ارتباط عوامل النسخ داخل المُحسِّنات (انظر الشكل أعلاه) عادةً حوالي 10 أزواج قاعدية، مع إمكانية اختلافها من بضعة أزواج إلى حوالي 20 زوجًا قاعديًا. ^{[ 14 ]} تحتوي المُحسِّنات عادةً على حوالي 10 مواقع ارتباط لعوامل النسخ ضمن موقع مُحسِّن متوسط ​​يبلغ طوله حوالي 204 أزواج قاعدية. ^{[ 15 ]} عند فحص التفاعلات التنظيمية بين المُحسِّنات والجينات في 352 نوعًا من الخلايا والأنسجة، تم العثور على أكثر من 13 مليون مُحسِّن نشط. ^{[ 16 ]}

مُعزز فائق

بينما تُعدّ المُعززات ضرورية لنسخ الجينات في الخلية بمستويات أعلى من المستويات المنخفضة، فإنّ مجموعة من المُعززات، تُعرف باسم المُعزز الفائق، يُمكنها أن تُحفّز نسخ الجين المستهدف بمستويات أعلى. عادةً ما تُحفّز المُعززات الفائقة الجينات اللازمة لهوية الخلية للتعبير عنها بمستويات عالية. ^{[ 17 ] [ 18 ]} في السرطانات، قد يُحفّز المُعزز الفائق أيضًا جينًا ورميًا مُعينًا للتعبير عنه بمستوى عالٍ. ^{[ 17 ] [ 18 ]}

يُعرَّف المُعزِّز الفائق بأنه مجموعة من المُعزِّزات النموذجية المتقاربة جينيًا (يتراوح طولها بين 9000 ^{[ 17 ]} و22000 ^{[ 19 ]} زوجًا قاعديًا تقريبًا) والتي تُنظِّم مجتمعةً التعبير عن جين مُستهدف. ^{[ 20 ]} وتُعبَّر الجينات التي يُحفِّزها المُعزِّز الفائق بمستويات أعلى بكثير من التعبير عن الجينات الخاضعة لسيطرة المُعزِّزات النموذجية. ^{[ 20 ]}

يوضح الشكل في هذا القسم مخططًا للمُحسِّن الفائق. في هذا الشكل، يبلغ طول المُحسِّن الفائق 12000 نيوكليوتيد، ويحتوي على أربعة مُحسِّنات نموذجية ضمن طوله. يتصل كل مُحسِّن نموذجي بمنطقة المُحفِّز لنفس الجين المستهدف في آنٍ واحد. يحتوي كل مُحسِّن نموذجي داخل المُحسِّن الفائق على أنماط DNA متعددة ترتبط بها عوامل النسخ. يرتبط كل مُحسِّن نموذجي أيضًا بمُركَّب وسيط مُكوَّن من 26 مُكوِّنًا ، ينقل الإشارات من عوامل النسخ المرتبطة بالمُحسِّن إلى مُحفِّز الجين المستهدف المُشترك. يُشكِّل البروتين BRD4 مُركَّبًا مع كل مُحسِّن نموذجي في المُحسِّن الفائق، ويُساعد على تثبيت بنية المُحسِّن الفائق. ^{[ 21 ]} بالإضافة إلى ذلك، يُساعد البروتين البنائي YY1 (المُشار إليه بخطوط متعرجة حمراء مُزدوجة) في الحفاظ على ترابط الحلقات التي تربط المُحسِّنات النموذجية بجينها المستهدف في المُحسِّن الفائق. ^{[ 7 ]} لذلك، توجد العديد من البروتينات المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بمنطقة مُحسِّنة فائقة. تحتوي هذه البروتينات عمومًا على نطاق مُهيكل بالإضافة إلى ذيل يحتوي على منطقة غير مُنظَّمة جوهريًا (IDR). ^{[ 22 ]} تتفاعل العديد من المناطق غير المُنظَّمة جوهريًا لهذه البروتينات مع بعضها البعض، مما يُشكِّل هلامًا مانعًا للماء أو مُكثَّفًا مُنفصل الطور حول المنطقة المُحسِّنة الفائقة. ^{[ 22 ]}

تُحفز بعض المُعززات الفائقة مستويات عالية جدًا من النسخ، مثل مُعزز ألفا غلوبين الفأر الفائق ^{[ 23 ]} ومُعزز Wap الفائق ^{[ 24 ]} . يحتوي مُعزز ألفا غلوبين الفأر الفائق على خمسة مُعززات نموذجية داخله. وعندما تعمل هذه المُعززات معًا، فإنها تزيد من نسخ جين ألفا غلوبين بمقدار 450 ضعفًا ^{[ 23 ]} . في مثال آخر، يحتوي مُعزز Wap الفأر الفائق على ثلاثة مُعززات نموذجية. وعندما تعمل هذه المُعززات الثلاثة معًا، فإنها تزيد من نسخ جين Wap بمقدار 1000 ضعف ^{[ 24 ] .}

تعمل المحفزات داخل المحفزات الفائقة الموصوفة أعلاه بشكل تآزري. مع ذلك، في نوع ثانٍ من المحفزات الفائقة، تعمل المحفزات المكونة لها بشكل تراكمي. وفي مجموعة ثالثة، يبدو أن المحفزات الفائقة تعمل "لوجستيًا" حيث يصل نشاط المحفز إلى حد معين. فحصت إحدى الدراسات 773 جينًا مستهدفًا مقترنة بمجموعات قريبة من المحفزات الفائقة المحتملة (مع وجود 2-20 محفزًا متقاربًا يُحتمل أن تعمل كمحفزات فائقة). في هذه الدراسة، تبين أن 277 و92 و250 من المحفزات الفائقة المحتملة تعمل وفقًا للنماذج التراكمية والتآزرية واللوجستية على التوالي. ^{[ 25 ]}

قد تشغل المُعززات الفائقة مناطق من الجينوم يتراوح طولها بين 10,000 و60,000 نيوكليوتيد. ^{[ 26 ]} بينما يبلغ طول كل مُعزز نموذجي حوالي 204 أزواج قاعدية. ^{[ 15 ]} عند تقييم 8 أنواع من الخلايا، شكلت المُعززات الفائقة ما بين 2.5% إلى 10.9% من المُعززات التي تُحفز عملية النسخ، بينما شكلت المُعززات النموذجية غالبية المُعززات التي تُحفز عملية النسخ. تراوح عدد المُعززات الفائقة بين 257 و1,099 مُعززًا في هذه الأنواع الثمانية من الخلايا، بينما تراوح عدد المُعززات النموذجية بين 5,512 و23,869 مُعززًا. ^{[ 27 ]}

على الرغم من أن المعززات الفائقة لا تنشط إلا في حوالي 2.5% إلى 10.9% من مواقع النسخ النشطة في الخلية، إلا أنها تستقطب آليات النسخ بشكل أكثر فعالية من المعززات الفردية التقليدية. تستخدم المعززات الفائقة في الخلية ما بين 12% إلى 36% من بوليميرازات الحمض النووي الريبي، والبروتينات الوسيطة، وبروتينات BRD4، وغيرها من آليات النسخ في الخلية. ^{[ 17 ]}

5-ميثيل سيتوزين (5-mC) هو شكل مثيل لقاعدة السيتوزين في الحمض النووي (انظر الشكل). يُعد 5-mC علامة فوق جينية توجد بشكل رئيسي على السيتوزينات ضمن ثنائيات نيوكليوتيدات CpG، والتي تتكون من سيتوزين متبوع بجوانين، وتقرأ في الاتجاه من 5' إلى 3' على طول شريط الحمض النووي ( مواقع CpG ). يوجد حوالي 28 مليون ثنائي نيوكليوتيد CpG في الجينوم البشري . ^{[ 28 ]} في معظم أنسجة الثدييات، يكون 70% إلى 80% من سيتوزينات CpG مثيلة (مكونةً 5-ميثيل-CpG، أو 5-mCpG). ^{[ 29 ]} غالبًا ما توجد السيتوزينات المثيلة ضمن تسلسلات CpG في مجموعات تُسمى جزر CpG . تحتوي حوالي 59% من تسلسلات المحفز على جزيرة CpG، بينما تحتوي حوالي 6% فقط من تسلسلات المُعزز على جزيرة CpG. ^{[ 30 ]} تشكل جزر CpG تسلسلات تنظيمية، لأنه إذا تم مثيلة جزر CpG في محفز الجين، فإن ذلك يمكن أن يقلل أو يكبت التعبير الجيني. ^{[ 31 ]}

ينظم مثيلة الحمض النووي التعبير الجيني من خلال التفاعل مع بروتينات نطاق ربط الميثيل (MBD)، مثل MeCP2 وMBD1 وMBD2. ترتبط هذه البروتينات بقوة بجزر CpG عالية المثيلة . ^{[ 32 ]} تحتوي هذه البروتينات على نطاق ربط ميثيل-CpG ونطاق كبح النسخ. ^{[ 32 ]} ترتبط هذه البروتينات بالحمض النووي المثيل وتوجه معقدات البروتين ذات النشاط في إعادة تشكيل الكروماتين و/أو تعديل الهيستون إلى جزر CpG المثيلة. تعمل بروتينات MBD عمومًا على كبح الكروماتين الموضعي من خلال آليات مثل تحفيز إدخال علامات الهيستون الكابتة أو خلق بيئة كروماتينية كابتة شاملة من خلال إعادة تشكيل النيوكليوسومات وإعادة تنظيم الكروماتين. ^{[ 32 ]}

عوامل النسخ هي بروتينات ترتبط بتسلسلات محددة من الحمض النووي (DNA) لتنظيم التعبير الجيني. يبلغ طول تسلسل ارتباط عامل النسخ في الحمض النووي عادةً حوالي 10 أو 11 نيوكليوتيدًا. يوجد ما يقارب 1400 عامل نسخ مختلف مُشفّر في الجينوم البشري، وهي تُشكّل حوالي 6% من جميع الجينات البشرية المُشفّرة للبروتينات. ^{[ 33 ]} يقع حوالي 94% من مواقع ارتباط عوامل النسخ المرتبطة بالجينات المُستجيبة للإشارات في المُعززات، بينما يقع حوالي 6% فقط من هذه المواقع في المُحفزات. ^{[ 9 ]}

يُعدّ EGR1 عامل نسخ مهمًا لتنظيم مثيلة جزر CpG. غالبًا ما يقع موقع ارتباط عامل النسخ EGR1 في تسلسلات المُعزز أو المُحفز. ^{[ 34 ]} يوجد حوالي 12000 موقع ارتباط لـ EGR1 في جينوم الثدييات، ويقع نصف هذه المواقع تقريبًا في المُحفزات والنصف الآخر في المُعززات. ^{[ 34 ]} لا يتأثر ارتباط EGR1 بموقع ارتباطه المستهدف في الحمض النووي بمثيلة السيتوزين في الحمض النووي. ^{[ 34 ]}

على الرغم من أن كميات ضئيلة فقط من بروتين EGR1 قابلة للكشف في الخلايا غير المحفزة، إلا أن ترجمة EGR1 إلى بروتين ترتفع بشكل ملحوظ بعد ساعة واحدة من التحفيز. ^{[ 35 ]} يمكن تحفيز التعبير عن EGR1 في أنواع مختلفة من الخلايا بواسطة عوامل النمو، والنواقل العصبية، والهرمونات، والإجهاد، والإصابة. ^{[ 35 ]} في الدماغ، عند تنشيط الخلايا العصبية، تزداد مستويات بروتينات EGR1، وترتبط (تستقطب) إنزيمات TET1 الموجودة مسبقًا، والتي تُعبر عنها الخلايا العصبية بكثرة. تستطيع إنزيمات TET تحفيز إزالة مجموعة الميثيل من 5-ميثيل سيتوزين. عندما تجلب عوامل النسخ EGR1 إنزيمات TET1 إلى مواقع ارتباط EGR1 في المحفزات، تستطيع إنزيمات TET إزالة مجموعة الميثيل من جزر CpG الميثيلية في تلك المحفزات. بعد إزالة مجموعة الميثيل، تستطيع هذه المحفزات بدء نسخ جيناتها المستهدفة. يتم التعبير عن مئات الجينات في الخلايا العصبية بشكل مختلف بعد تنشيط الخلايا العصبية من خلال استقطاب EGR1 لـ TET1 إلى التسلسلات التنظيمية الميثيلية في محفزاتها. ^{[ 34 ]}

يبدو أن حوالي 600 تسلسل تنظيمي في المحفزات وحوالي 800 تسلسل تنظيمي في المعززات تعتمد على انقطاعات الحمض النووي المزدوجة التي يبدأها إنزيم توبويزوميراز 2β (TOP2B) للتنشيط. ^{[ 36 ] [ 37 ]} ويختلف تحفيز انقطاعات الحمض النووي المزدوجة باختلاف الإشارة المحفزة. فعند تنشيط الخلايا العصبية في المختبر ، يحدث 22 انقطاعًا فقط في الحمض النووي المزدوج ناتجًا عن TOP2B في جينوماتها. ^{[ 38 ]} ومع ذلك، عند إجراء التكييف الشرطي للخوف السياقي في الفئران، يتسبب هذا التكييف في حدوث مئات من انقطاعات الحمض النووي المزدوجة المرتبطة بالجينات في القشرة الجبهية الإنسية والحصين، وهما منطقتان مهمتان للتعلم والذاكرة. ^{[ 39 ]}

تترافق كسور الحمض النووي المزدوجة الناتجة عن TOP2B مع أربعة إنزيمات على الأقل من مسار إصلاح الحمض النووي غير المتجانس (NHEJ) (DNA-PKcs، وKU70، وKU80، وDNA LIGASE IV) (انظر الشكل). تُصلح هذه الإنزيمات كسور الحمض النووي المزدوجة في غضون 15 دقيقة إلى ساعتين تقريبًا. ^{[ 38 ] [ 40 ]} وبالتالي، ترتبط كسور الحمض النووي المزدوجة في المحفز بـ TOP2B وهذه الإنزيمات الأربعة على الأقل. تتواجد هذه البروتينات في آنٍ واحد على نيوكليوسوم واحد في المحفز (يحتوي تسلسل الحمض النووي على حوالي 147 نيوكليوتيدًا ملتفة حول نيوكليوسوم واحد) يقع بالقرب من موقع بدء النسخ لجينها المستهدف. ^{[ 40 ]}

يبدو أن الكسر المزدوج في الحمض النووي الريبوزي الناتج عن إنزيم TOP2B يحرر جزءًا من المحفز عند موقع بدء النسخ المرتبط بإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبوزي، مما يسمح له بالانتقال فعليًا إلى المعزز المرتبط به. وهذا بدوره يسمح للمعزز، بما يرتبط به من عوامل النسخ والبروتينات الوسيطة، بالتفاعل مباشرةً مع إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبوزي الذي كان متوقفًا عند موقع بدء النسخ، لبدء عملية النسخ. ^{[ 38 ] [ 10 ]}

وبالمثل، يبدو أن إنزيمات توبويزوميراز I (TOP1) تتواجد في العديد من المحفزات، وتُفعَّل هذه المحفزات عندما يُحدث TOP1 كسرًا في أحد خيوط الحمض النووي. ^{[ 41 ]} يُسبب TOP1 كسورًا في أحد خيوط الحمض النووي في تسلسلات تنظيمية محددة للمحفزات عند تلقيه إشارة من عامل نسخ مُرتبط بالمحفز. ^{[ 41 ]} ترتبط كسور توبويزوميراز I بعوامل إصلاح الحمض النووي مختلفة عن تلك المحيطة بكسور TOP2B. في حالة TOP1، ترتبط الكسور بشكل مباشر بإنزيمات إصلاح الحمض النووي MRE11 و RAD50 و ATR . ^{[ 41 ]}

التسلسلات التنظيمية لجين الأنسولين هي: ^{[ 43 ]}

• A5
• Z
• العنصر التنظيمي السلبي (NRE) ^{[ 44 ]}
• C2
• E2
• A3
• عنصر استجابة cAMP
• A2
• ربط مُحسِّن CAAT (CEB)
• ج1
• E1
• G1