الحمض النووي المنقول

الحمض النووي المنقول (يُختصر إلى T-DNA ) هو الحمض النووي المنقول من البلازميد المُحفِّز للأورام (Ti) / المُحفِّز للجذور (Ri) للبكتيريا الممرضة للنباتات، مثل Agrobacterium tumefaciens و Rhizobium rhizogenes و Allorhizobium vitis (جميعها تُصنَّف ضمن جنس Agrobacterium ). ^{[ 1 ]} ينتقل الحمض النووي T-DNA من البكتيريا إلى جينوم الحمض النووي النووي للنبات المضيف . ^{[ 2 ]} تُعزى قدرة هذا البلازميد المُحفِّز للأورام (Ti) المُتخصص إلى منطقتين أساسيتين ضروريتين لنقل الحمض النووي إلى الخلية المضيفة. يُحاط الحمض النووي T-DNA بتكرارات مكونة من 25 زوجًا من القواعد النيتروجينية على كل طرف. يبدأ النقل من الحد الأيمن وينتهي عند الحد الأيسر. يتطلب النقل جينات vir الخاصة بالبلازميد Ti، والتي لا تنتقل إلى النبات.

يبلغ طول الحمض النووي T-DNA الخاص ببكتيريا Agrobacterium fabrum C58 حوالي 24000 زوج قاعدي ^{[ 3 ] [ 4 ]} ، ويحتوي على جينات مُعبر عنها في النبات تُشفّر إنزيمات تُصنّع الأوبينات والهرمونات النباتية . بنقل الحمض النووي T-DNA إلى جينوم النبات، تُعيد البكتيريا برمجة خلايا النبات لتنمو وتُشكّل ورمًا، مُنتجةً مصدرًا غذائيًا فريدًا للبكتيريا. يُتيح تخليق هرموني الأوكسين والسيتوكينين بواسطة الإنزيمات المُشفّرة في الحمض النووي T-DNA لخلايا النبات النمو المفرط، مُشكّلةً بذلك أورام التاج التي تُسببها عادةً عدوى بكتيريا Agrobacterium . الأوبينات هي مشتقات من الأحماض الأمينية تستخدمها البكتيريا كمصدر للكربون والطاقة، وتقع جينات الاستخدام على أجزاء من البلازميد غير المنقولة إلى النبات. ^{[ 5 ]} تُسبب بكتيريا Rhizobium rhizogenes عدوى مُشابهة تُعرف باسم مرض الجذور الشعرية . يحتوي على جينات مماثلة لتخليق الأوبين ولكن جينات مختلفة تسبب فرط النمو. ^{[ 1 ]}

تُستخدم هذه العملية الطبيعية لنقل الجينات الأفقي في النباتات كأداة للبحوث الأساسية والتطبيقية في علم الأحياء النباتية من خلال تحويل الجينات الأجنبية بواسطة بكتيريا الأجروبكتيريوم والطفرات الإدخالية. ^{[ 6 ] [ 7 ]} يمكن هندسة جينومات النباتات باستخدام الأجروبكتيريوم لتوصيل التسلسلات الموجودة في نواقل T-DNA الثنائية ، والتي تفصل جينات vir عن T-DNA.

تحتوي بعض بلازميدات Ti/Ri على قطعتين من الحمض النووي T-DNA محاطتين بتكرارات، وليس قطعة واحدة. يتم نقل كلتا القطعتين إلى النبات. يُطلق على هذا النوع من التركيب اسم T _L -DNA و T _R -DNA. ^{[ 1 ]}

تتضمن عملية إصابة الخلية المضيفة بـ T-DNA واندماجها في نواتها عدة خطوات. أولًا، تتكاثر البكتيريا في عصارة الجرح قبل الإصابة، ثم تلتصق بجدران الخلايا النباتية. يتم تنشيط التعبير عن جينات ضراوة البكتيريا، والتي يبلغ عددها حوالي 10 أوبرونات، عن طريق استشعار المركبات الفينولية، مثل أسيتوسيرينجون، المنبعثة من أنسجة النبات المصابة، وذلك بعد التلامس بين الخلايا. ثم تستمر هذه العملية بانتقال الجزيئات الكبيرة من بكتيريا الأجروبكتيريوم إلى سيتوبلازم الخلية المضيفة، وانتقال T-DNA مع البروتينات المرتبطة به (المعروفة باسم معقد T ) إلى نواة الخلية المضيفة، يليه تفكك معقد T، واندماج T-DNA بشكل مستقر في جينوم النبات المضيف ، والتعبير النهائي عن الجينات المنقولة . يتضمن اندماج T-DNA في جينوم المضيف تكوين شق أحادي السلسلة في الحمض النووي عند الحد الأيمن لبلازميد Ti. يُحدث هذا القطع منطقة من الحمض النووي أحادي السلسلة تمتد من الحافة اليسرى لجين الحمض النووي المنقول (T-DNA) إلى الحافة اليمنى المقطوعة. بعد ذلك، ترتبط بروتينات ربط أحادية السلسلة بالحمض النووي أحادي السلسلة. يؤدي تخليق الحمض النووي إلى إزاحة المنطقة أحادية السلسلة، ثم يُحدث قطع ثانٍ عند منطقة الحافة اليسرى، مُحررًا قطعة الحمض النووي المنقول (T-DNA) أحادية السلسلة. يمكن دمج هذه القطعة لاحقًا في جينوم الكائن المضيف. ^{[ 8 ]}

من المعروف أن بكتيريا الأغروبكتيريوم طورت نظام تحكم يستخدم عوامل النبات المضيف والعمليات الخلوية في مسارات متعددة للاستجابة الدفاعية للنبات المضيف لغزو نواة الخلية المضيفة. ولدمج الحمض النووي المنقول (T-DNA) في جينوم النبات المضيف المستهدف، تُجري الأغروبكتيريوم تفاعلات متعددة مع عوامل النبات المضيف. ^{[ 8 ]} وللتفاعل مع بروتينات النبات المضيف، تُشفّر العديد من بروتينات ضراوة الأغروبكتيريوم بواسطة جينات vir. ويحدث التعبير عن جينات vir في الأغروبكتيريوم عبر مستشعر VirA-VirG، مما ينتج عنه توليد نسخة متحركة من الحمض النووي المنقول أحادي السلسلة (T-strand). ويُعد الشكل المُعالَج من VirB2 المكون الرئيسي لمركب T-complex اللازم للتحول. أما VirD2 فهو البروتين الذي يُغطي الطرف 5′ من T-strand المنقول برابطة تساهمية، ثم يُنقل إلى سيتوبلازم الخلية المضيفة. ^{[ 9 ] [ 10 ]} يُعدّ VirE2 بروتينًا رابطًا للحمض النووي أحادي السلسلة، ويُفترض أنه يُغطي السلسلة T في سيتوبلازم الخلية المضيفة عبر ارتباط تعاوني . ثم يُوجّه إلى النواة من خلال تفاعلات مع بروتينات الخلية المضيفة، مثل إمبورتين ألفا، وبروتين VirE3 البكتيري، والبروتينات الشبيهة بالداينين. وهناك العديد من عوامل ضراوة البكتيريا الأخرى، مثل VirB5 وVirB7 (المكونات الثانوية للمركب T) وVirD5 وVirE2 وVirE3 وVirF، التي قد تتفاعل أيضًا مع بروتينات خلايا النبات المضيف. ^{[ 11 ]}

يُستخدم نقل الحمض النووي T-DNA بواسطة بكتيريا Agrobacterium على نطاق واسع كأداة في مجال التقنية الحيوية . ولأكثر من عقدين، استُخدمت بكتيريا Agrobacterium tumefaciens لإدخال الجينات إلى النباتات لأغراض البحث الأساسي، وكذلك لإنتاج المحاصيل المعدلة وراثيًا تجاريًا . ^{[ 12 ]} في الهندسة الوراثية ، تُزال الجينات المُحفزة للأورام وجينات تخليق الأوبين من الحمض النووي T-DNA، وتُستبدل بجين مُستهدف و/أو علامة اختيار، وهو أمر ضروري لتحديد النباتات التي تم تحويلها بنجاح. ومن أمثلة علامات الاختيار: فوسفوتراز النيوميسين ، وفوسفوتراسفيراز الهيغروميسين B (اللذان يقومان بفسفرة المضادات الحيوية) ، وأسيتيل ترانسفيراز الفوسفينوثريسين (الذي يقوم بأستلة وتعطيل الفوسفينوثريسين ، وهو مُثبط قوي لإنزيم سينثيتاز الغلوتامين )، أو تركيبات مبيدات الأعشاب مثل Basta أو Bialophos. ^{[ 13 ]} من أنظمة الانتقاء الأخرى التي يمكن استخدامها استخدام المؤشرات الأيضية مثل إنزيم فوسفومانوز إيزوميراز. ^{[ 14 ]} تُستخدم بكتيريا الأغروبكتيريوم كناقل لنقل الحمض النووي T المُهندس إلى خلايا النبات حيث يندمج في جينوم النبات. يمكن استخدام هذه الطريقة لإنتاج نباتات مُعدلة وراثيًا تحمل جينًا غريبًا. تتميز بكتيريا الأغروبكتيريوم توميفاسينز بقدرتها على نقل الحمض النووي الغريب إلى كل من النباتات أحادية الفلقة وثنائية الفلقة بكفاءة عالية، مع مراعاة عوامل بالغة الأهمية مثل النمط الجيني للنباتات، وأنواع وأعمار الأنسجة المُلقحة، ونوع الناقلات، وسلالات الأغروبكتيريوم ، وجينات مؤشرات الانتقاء، وعوامل الانتقاء، وظروف زراعة الأنسجة المختلفة. ^{[ 5 ]}

يمكن استخدام نفس إجراء نقل الحمض النووي T-DNA لتعطيل الجينات عبر الطفرات الإدخالية . ^{[ 7 ]} لا يقتصر دور تسلسل الحمض النووي T-DNA المُدخل على إحداث طفرة فحسب، بل إن إدخاله يُوسم أيضًا ^{[ 15 ]} الجين المتأثر، مما يسمح بعزله كتسلسلات مجاورة للحمض النووي T-DNA. يمكن ربط جين مُخبِر بالطرف الأيمن من الحمض النووي T-DNA المراد تحويله، إلى جانب مُضاعِف بلازميد وجين مقاومة للمضادات الحيوية (مثل الهيغروميسين ) قابل للاختيار، ويمكنه إظهار كفاءة متوسطة تبلغ حوالي 30% عند نجاح إدخال الحمض النووي T-DNA في إحداث اندماجات جينية في نبات رشاد أذن الفأر (Arabidopsis thaliana) . ^{[ 16 ]}

يتضمن علم الوراثة العكسي اختبار الوظيفة المفترضة لجين معروف عن طريق تعطيله، ثم البحث عن تأثير الطفرة المُستحدثة على النمط الظاهري للكائن الحي. أما طفرات الوسم باستخدام الحمض النووي المنقول (T-DNA) فتتضمن فحص مجموعات من الكائنات الحية عن طريق طفرات إدخال الحمض النووي المنقول. توفر مجموعات طفرات الحمض النووي المنقول المعروفة موارد لدراسة وظائف الجينات الفردية، كما هو الحال في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا النموذجي . ^{[ 17 ] [ 18 ]} تشمل أمثلة طفرات إدخال الحمض النووي المنقول في الأرابيدوبسيس ثاليانا تلك المرتبطة بالعديد من فئات الأنماط الظاهرية، بما في ذلك موت الشتلات، واختلافات الحجم، واختلافات الصبغة، وعيوب الأجنة، وانخفاض الخصوبة، والنباتات ذات الشذوذ المورفولوجي أو الفيزيولوجي. ^{[ 19 ]}

• نظام الحمض النووي المنقول الثنائي