ترانسبوزاز

إنزيم الترانسبوزاز هو أي إنزيم من فئة الإنزيمات القادرة على الارتباط بنهاية الترانسبوزون وتحفيز انتقاله إلى جزء آخر من الجينوم ، عادةً عن طريق آلية القص واللصق أو آلية التضاعف، في عملية تُعرف باسم النقل. وقد صاغ مصطلح "الترانسبوزاز" الباحثون الذين استنسخوا الإنزيم اللازم لنقل الترانسبوزون Tn3 . ^{[ 1 ]} افترضت باربرا مكلينتوك وجود الترانسبوزونات في أواخر الأربعينيات من القرن العشرين ، عندما كانت تدرس وراثة الذرة ، ولكن الأساس الجزيئي الفعلي للنقل وُصف من قبل مجموعات لاحقة. اكتشفت مكلينتوك أن بعض أجزاء الكروموسومات تُغير موضعها، فتنتقل بين مواقع جينية مختلفة أو من كروموسوم إلى آخر. وقد سمح إعادة تموضع هذه الترانسبوزونات (التي تُشفّر اللون) بالتعبير عن جينات أخرى للصبغة. ^{[ 2 ]} يُسبب النقل في الذرة تغيرات في اللون. مع ذلك، في كائنات حية أخرى، مثل البكتيريا، قد يُسبب ذلك مقاومة للمضادات الحيوية . ^{[ 2 ]} كما أن الانتقال الجيني مهم في خلق التنوع الجيني داخل الأنواع وتوليد القدرة على التكيف مع الظروف المعيشية المتغيرة. ^{[ 3 ]}

تُصنَّف الترانسبيوزازات تحت رقم EC 2.7.7. وتنتشر الجينات التي تُشفِّر الترانسبيوزازات على نطاق واسع في جينومات معظم الكائنات الحية، وهي أكثر الجينات وفرةً المعروفة. ^{[ 4 ]} وخلال مسيرة التطور البشري، انتقل ما يصل إلى 40% من الجينوم البشري عبر آليات مثل نقل الترانسبيوزونات. ^{[ 2 ]}

إن ترانسبوزاز (Tnp) Tn5 هو أحد أفراد عائلة البروتينات الفائقة RNase ، والتي تشمل إنزيمات دمج الفيروسات القهقرية . يوجد Tn5 في بكتيريا شيوانيلا وإشريكية القولون . ^{[ 5 ]} يحمل هذا الترانسبوزون جين مقاومة للمضادات الحيوية، مثل الكاناميسين ومضادات الأمينوغليكوزيد الأخرى. ^{[ 3 ] [ 6 ]}

تُعدّ Tn5 وغيرها من الترانسبيوزازات غير نشطة بشكل ملحوظ. ولأنّ عمليات نقل الحمض النووي تُسبب الطفرات بطبيعتها، فإنّ انخفاض نشاط الترانسبيوزازات ضروري لتقليل خطر حدوث طفرة قاتلة في الخلية المضيفة، وبالتالي القضاء على العنصر القابل للنقل . أحد أسباب عدم تفاعل Tn5 هو تقارب طرفيه الأميني والكربوكسيلي، مما يؤدي إلى تثبيط أحدهما للآخر. وقد تبيّن ذلك من خلال دراسة العديد من الطفرات التي نتج عنها أشكال مفرطة النشاط من الترانسبيوزازات. إحدى هذه الطفرات، L372P، هي طفرة في الحمض الأميني رقم 372 في ترانسبيوزاز Tn5. هذا الحمض الأميني هو عادةً بقايا الليوسين في منتصف حلزون ألفا. عند استبدال الليوسين بالبرولين، ينكسر حلزون ألفا، مما يُحدث تغييرًا في بنية نطاق الطرف الكربوكسيلي، ويفصله عن نطاق الطرف الأميني بما يكفي لتعزيز نشاط البروتين. ^{[ 3 ]} غالبًا ما تتطلب عملية نقل الترانسبوزون ثلاثة عناصر فقط: الترانسبوزون نفسه، وإنزيم الترانسبوزاز، والحمض النووي المستهدف لإدخال الترانسبوزون. ^{[ 3 ]} هذا هو الحال مع Tn5، الذي يستخدم آلية القص واللصق لنقل الترانسبوزونات. ^{[ 3 ]}

يحتوي Tn5 ومعظم أنواع الترانسبيوزاز الأخرى على وحدة DDE، وهي الموقع النشط الذي يحفز حركة الترانسبيوزون. يتكون الموقع النشط من ثلاثة أحماض أمينية حمضية: الأسبارتات-97، والأسبارتات-188، والغلوتامات-326. ^{[ 7 ]} يُقال إن وحدة DDE تُنسق أيونات المعادن ثنائية التكافؤ، وغالبًا ما تكون المغنيسيوم والمنغنيز، وهي مهمة في التفاعل التحفيزي. ^{[ 7 ]} نظرًا لأن الترانسبيوزاز غير نشط للغاية، يتم تحوير منطقة DDE ليصبح الترانسبيوزاز مفرط النشاط ويحفز حركة الترانسبيوزون. ^{[ 7 ]} يتحول الغلوتامات إلى أسبارتات، ويتحول الأسبارتاتان إلى غلوتامات. ^{[ 7 ]} من خلال هذه الطفرة، يصبح من الممكن دراسة Tn5، ولكن بعض خطوات العملية التحفيزية تُفقد نتيجة لذلك. ^{[ 3 ]}

تتضمن عملية نقل الترانسبوزون عدة خطوات، منها ارتباط Tnp، والتشابك (تكوين معقد تشابكي)، والقطع، والتقاط الهدف، ونقل السلسلة. ثم يرتبط الترانسبوزاز بسلسلة الحمض النووي DNA ويُشكّل حلقةً حول طرف الترانسبوزون، ويندمج في الموقع النشط. بمجرد ارتباط الترانسبوزاز بالترانسبوزون، يُكوّن معقدًا تشابكيًا يرتبط فيه اثنان من الترانسبوزازات بعلاقة cis/trans مع الترانسبوزون. ^{[ 3 ]}

في عملية الانشطار، تُفعّل أيونات المغنيسيوم الأكسجين من جزيئات الماء، مما يُعرّضها للهجوم النيوكليوفيلي. ^{[ 6 ]} يسمح هذا لجزيئات الماء بقطع طرفي السلسلة 3' وتكوين بنية حلقية، تفصل الترانسبوزون عن الحمض النووي المانح. ^{[ 3 ]} بعد ذلك، ينقل الترانسبوزاز الترانسبوزون إلى موقع مناسب. لا يُعرف الكثير عن عملية التقاط الهدف، على الرغم من وجود تحيز تسلسلي لم يُحدد بعد. ^{[ 3 ]} بعد التقاط الهدف، يهاجم الترانسبوزاز الحمض النووي المستهدف على بُعد تسعة أزواج قاعدية، مما يؤدي إلى دمج الترانسبوزون في الحمض النووي المستهدف. ^{[ 3 ]}

كما ذُكر سابقاً، وبسبب طفرات DDE، تُفقد بعض خطوات العملية - على سبيل المثال، عند إجراء هذه التجربة في المختبر ، حيث يؤدي المعالجة الحرارية بـ SDS إلى تغيير طبيعة الترانسبيوزاز. ومع ذلك، لا يزال من غير المؤكد ما يحدث للترانسبيوزاز في الجسم الحي . ^{[ 3 ]}

تُعدّ دراسة الترانسبيوزاز Tn5 ذات أهمية عامة نظراً لتشابهه مع فيروس نقص المناعة البشرية من النوع الأول (HIV -1) وغيره من الأمراض الفيروسية القهقرية. ومن خلال دراسة Tn5، يمكن اكتشاف الكثير عن الترانسبيوزازات الأخرى ووظائفها. ^{[ 3 ]}

استُخدمت تقنية Tn5 في تسلسل الجينوم عام 2010، حيث تقوم بإضافة محولات التسلسل وتجزئة الحمض النووي في تفاعل إنزيمي واحد ^{[ 8 ]} ، مما يقلل الوقت والجهد المطلوبين مقارنةً بتحضير مكتبات التسلسل التقليدية من الجيل التالي . تُبسط استراتيجية Tn5 بروتوكول تحضير المكتبة بشكل كبير، ويمكن دمجها في تفاعل البلمرة المتسلسل المباشر للمستعمرات (PCR) لأعداد كبيرة من العزلات البكتيرية دون تحيز واضح في التغطية ^{[ 8 ]} . من أبرز عيوبها قلة التحكم في حجم التجزئة مقارنةً بالتجزئة الإنزيمية والميكانيكية، بالإضافة إلى ميلها نحو محتوى GC العالي ^{[ 8 ]} . تُستخدم هذه الطريقة أيضًا في تقنية ATAC-seq .

إنزيم ترانسبوزاز Sleeping Beauty (SB) هو إنزيم إعادة التركيب الذي يُشغّل نظام ترانسبوزون Sleeping Beauty . ^{[ 9 ]} ينتمي إنزيم ترانسبوزاز SB إلى عائلة DD[E/D] من إنزيمات الترانسبوزاز، والتي بدورها تنتمي إلى عائلة فائقة كبيرة من إنزيمات نقل عديد النوكليوتيدات، والتي تشمل RNase H، وإنزيم RuvC Holliday resolvase، وبروتينات RAG، وإنزيمات دمج الفيروسات القهقرية. ^{[ 10 ] [ 11 ]} يُستخدم نظام SB بشكل أساسي في الحيوانات الفقارية لنقل الجينات، ^{[ 12 ]} بما في ذلك العلاج الجيني، ^{[ 13 ] [ 14 ]} واكتشاف الجينات. ^{[ 15 ] [ 16 ]} إنزيم SB100X المُهندس هو إنزيم يُوجّه مستويات عالية من دمج الترانسبوزون. ^{[ 17 ] [ 18 ]}

يُعدّ ترانسبوزون Tn7 عنصرًا وراثيًا متنقلًا يوجد في العديد من بدائيات النوى ، مثل الإشريكية القولونية ( E. coli ). وقد اكتُشف لأول مرة كتسلسل DNA في كروموسومات بكتيرية وبلازميدات طبيعية تحمل جينات مقاومة للمضادات الحيوية تريميثوبريم وستربتوميسين . ^{[ 19 ] [ 20 ]} يُصنّف هذا التسلسل تحديدًا كعنصر قابل للنقل (ترانسبوزون)، حيث يمكنه التضاعف والانتقال داخل الجينوم باستخدام إنزيم إعادة تركيب ذاتي التشفير يُسمى ترانسبوزاز، مما يؤدي إلى تأثيرات مثل إحداث طفرات أو عكسها وتغيير حجم الجينوم. وقد طوّر ترانسبوزون Tn7 آليتين لتعزيز انتشاره بين بدائيات النوى. ^{[ 21 ]} ومثل العديد من الترانسبوزونات البكتيرية الأخرى، ينتقل Tn7 بتردد منخفض ويندمج في مواقع مختلفة مع انتقائية موقعية ضئيلة أو معدومة. عبر هذا المسار الأول، يُوجَّه Tn7 بشكل تفضيلي إلى البلازميدات القابلة للاقتران ، والتي يمكن نسخها وتوزيعها بين البكتيريا. مع ذلك، يتميز Tn7 بقدرته الفريدة على الانتقال بتردد عالٍ إلى موقع محدد في كروموسومات البكتيريا يُسمى attTn7. ^{[ 22 ]} هذا التسلسل المحدد هو جين أساسي ومحفوظ للغاية موجود في العديد من سلالات البكتيريا. ومع ذلك، فإن إعادة التركيب هذه لا تُلحق الضرر بالبكتيريا المضيفة، حيث ينتقل Tn7 فعليًا إلى أسفل الجين بعد التعرف عليه، مما يوفر طريقة آمنة لتكاثر الترانسبوزون دون قتل المضيف. يشير مسار اختيار الموقع المستهدف المتطور والمعقد هذا إلى أن هذا المسار قد تطور لتعزيز التعايش بين الترانسبوزون ومضيفه، بالإضافة إلى انتقال Tn7 بنجاح إلى الأجيال اللاحقة من البكتيريا. ^{[ 21 ]}

يبلغ طول عنصر النقل Tn7 14 كيلوبايت، ويُشفّر خمسة إنزيمات. ^{[ 21 ]} تتكون نهايتا تسلسل الحمض النووي من قطعتين يتفاعل معهما إنزيم النقل Tn7 أثناء عملية إعادة التركيب. يبلغ طول القطعة اليسرى (Tn7-L) 150 زوجًا قاعديًا، بينما يبلغ طول القطعة اليمنى (Tn7-R) 90 زوجًا قاعديًا. تحتوي كلتا نهايتي عنصر النقل على سلسلة من مواقع الارتباط بطول 22 زوجًا قاعديًا، يتعرف عليها إنزيم النقل Tn7 ويرتبط بها. يحتوي عنصر النقل على خمسة جينات منفصلة تُشفّر بروتينات تُشكّل آلية النقل. بالإضافة إلى ذلك، يحتوي عنصر النقل على إنتغرون ، وهو قطعة من الحمض النووي تحتوي على عدة كاسيتات من الجينات التي تُشفّر مقاومة المضادات الحيوية. ^{[ 21 ]}

يُشفّر عنصر النقل Tn7 خمسة بروتينات: TnsA وTnsB وTnsC وTnsD وTnsE. ^{[ 21 ]} يتفاعل البروتينان TnsA وTnsB معًا لتكوين إنزيم TnsAB، وهو إنزيم ناقل Tn7. يتعرف هذا الإنزيم تحديدًا على نهايات تسلسل الحمض النووي لعنصر النقل ويرتبط بها، ثم يستأصلها عن طريق إحداث فواصل في الحمض النووي المزدوج عند كل نهاية. بعد ذلك، يُدرج التسلسل المستأصل في موقع مستهدف آخر على الحمض النووي. وكما هو الحال في عناصر النقل الأخرى المعروفة، تتضمن آلية نقل Tn7 قطع النهايات 3' من الحمض النووي المانح بواسطة البروتين TnsA التابع لإنزيم TnsAB. مع ذلك، يُقطع Tn7 أيضًا بشكل فريد بالقرب من النهايات 5'، على بُعد حوالي 5 أزواج قاعدية من النهاية 5' باتجاه عنصر النقل Tn7، بواسطة البروتين TnsB التابع لإنزيم TnsAB. بعد إدخال الترانسبوزون في موقع الحمض النووي المستهدف، ترتبط نهاياته 3' تساهميًا بالحمض النووي المستهدف، لكن تظل فجوات بطول 5 أزواج قاعدية موجودة عند نهاياته 5'. ونتيجة لذلك، يؤدي إصلاح هذه الفجوات إلى تكرار إضافي بطول 5 أزواج قاعدية في الموقع المستهدف. يتفاعل بروتين TnsC مع إنزيم الترانسبوزاز والحمض النووي المستهدف لتعزيز عمليتي الاستئصال والإدخال. تعتمد قدرة TnsC على تنشيط الترانسبوزاز على تفاعله مع الحمض النووي المستهدف إلى جانب بروتين الاستهداف المناسب له، TnsD أو TnsE. يُعدّ كل من بروتيني TnsD وTnsE مُحدِّدات هدف بديلة، وهما أيضًا مُنشِّطات ارتباط بالحمض النووي تُعزِّز استئصال وإدخال Tn7. تُعدّ قدرتهما على التفاعل مع حمض نووي مستهدف مُحدَّد أمرًا أساسيًا لاختيار موقع استهداف Tn7. تشكل البروتينات TnsA وTnsB وTnsC بالتالي الآلية الأساسية لـ Tn7: يتفاعل TnsA وTnsB معًا لتكوين الترانسبيوزاز، بينما يعمل TnsC كمنظم لنشاط الترانسبيوزاز، ويتواصل بين الترانسبيوزاز وTnsD وTnsE. عندما يتفاعل بروتين TnsE مع الآلية الأساسية TnsABC، يوجه Tn7 عمليات الإدخال بشكل تفضيلي إلى البلازميدات القابلة للاقتران. وعندما يتفاعل بروتين TnsD مع TnsABC، يوجه Tn7 عمليات الإدخال بشكل تفضيلي إلى موقع أساسي واحد ومحفوظ للغاية في الكروموسوم البكتيري. هذا الموقع، attTn7، يتعرف عليه TnsD تحديدًا. ^{[ 21 ]}

• الترانسبوزازات في رؤوس الموضوعات الطبية (MeSH) التابعة للمكتبة الوطنية الأمريكية للطب
• نظرة عامة على جميع المعلومات الهيكلية المتاحة في PDB لـ UniProt : Q46731 (Transposase لـ transposon Tn5) في PDBe-KB .