علم جينوم مسببات الأمراض القديمة

إن محدودية الحفظ وبالتالي قلة الوفرة، والحالة المجزأة والمتضررة للغاية، ووجود تلوث الحمض النووي الحديث وخلفية الحمض النووي البيئي ، تجعل من استرجاع الحمض النووي القديم ( aDNA ) إجراءً صعبًا.

لاستخلاص الحمض النووي القديم (aDNA) بكفاءة، يُعزل الحمض النووي عادةً من الأنسجة التي تحتوي على كمية كبيرة منه، كالعظام والأسنان، المتوفرة بكثرة في السجل الأثري. ^{[ 1 ]} يختلف حفظ مسببات الأمراض عبر مختلف العناصر التشريحية اختلافًا كبيرًا تبعًا لنوع الممرض وميله النسيجي، وطريقة دخوله إلى الجسم، والمرض الناتج. تُحدث مسببات الأمراض التي تُسبب عدوى مزمنة في عوائلها عادةً تغيرات عظمية مميزة، على عكس العدوى الحادة المنقولة بالدم. ^{[ 1 ]} لذلك، في حالات العدوى التي أدت إلى وفاة العائل في المرحلة الحادة، يُفضل أخذ عينة من الحجرة الداخلية للأسنان ^{[ 1 ] [ 3 ]،} نظرًا لكونها نسيجًا غنيًا بالأوعية الدموية خلال الحياة. ^{[ 4 ]}

يتميز الحمض النووي القديم (aDNA) بأضرار تتراكم بمرور الوقت: يُعد تقييم "نمط تلف" الحمض النووي من خلال الأدوات الحاسوبية مفيدًا للتحقق من صحة الحمض النووي لمسببات الأمراض القديمة، حيث لا يوجد النمط نفسه في الملوثات الحديثة. ^{[ 5 ]}

يُعدّ التحلل المائي للسيتوزين ، الذي يحوّله إلى يوراسيلات تُقرأ لاحقًا على أنها ثايمينات ، أكثر أنواع التلف الكيميائي شيوعًا الذي يصيب الحمض النووي بعد الوفاة . نتيجةً لهذا التفاعل، يحتوي الحمض النووي القديم على نسبة غير متوقعة من تحولات السيتوزين إلى ثايمينات ، لا سيما عند نهايات الجزيئات. ^{[ 6 ]} ومن التعديلات الشائعة الأخرى على الحمض النووي، إلى جانب تحلل السيتوزين إلى ثايمينات (يحدث هذا عند مثيلة السيتوزينات)، وجود مواقع خالية من القواعد وكسور في السلسلة المفردة. ^{[ 5 ]}

يتسم الحمض النووي القديم بتجزئة واسعة (معظم الشظايا أقل من 100 زوج قاعدي): يمكن استخدام هذه الخاصية كمقياس كمي للأصالة، إذ يُتوقع أن تكون جزيئات الملوثات الحديثة أطول. ^{[ 4 ]} وللاستفادة من هذه السمة المميزة للحمض النووي القديم، طُورت بروتوكولات استخلاص محسّنة تعتمد على السيليكا مع تعديل حجم وتركيب محلول ربط الحمض النووي . ^{[ 5 ]}

لإجراء التسلسل باستخدام تقنيات التسلسل من الجيل الثاني، يجب تعديل جزيئات القالب من خلال ربط المحولات. ^{[ 7 ]} وتخضع كل من خطوات بناء المكتبة وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) اللاحق للأخطاء. وعلى وجه الخصوص، قد تحدث تحيزات في ارتباط المحولات، وقد تختلف الكفاءة النسبية لإنزيمات تفاعل البوليميراز المتسلسل في تضخيم التركيب. ^{[ 5 ]}

توجد ثلاثة أنواع شائعة من مكتبات الحمض النووي القديم (aDNA) . تستخدم مكتبة الحمض النووي ثنائي السلاسل قوالب الحمض النووي ثنائي السلاسل، وتتطلب في البداية خطوة لإصلاح نهايات شظايا الحمض النووي القديم. بعد ذلك، تُربط الشظايا بمحولات ثنائية السلاسل، وتُملأ الشقوق الناتجة . لهذه الطريقة بعض القيود، مثل وجود نسبة من التركيبات التي لا تحتوي على كلا المحولين المختلفين، واحتمالية تكوين ثنائيات المحولات. ^{[ 5 ]}

للتغلب على هذه المشكلة الأخيرة، طُوِّرت طريقة لإنشاء مكتبة ذات ذيل أدينين. في هذه الطريقة، يُصلَح طرف الحمض النووي القديم (aDNA)، ثم يُضاف بقايا أدينين إلى الطرف 3' من السلاسل، مما يُسهِّل ربط القالب بمحولات تحتوي على تسلسل ثايمين. علاوة على ذلك، يمنع استخدام هذه المحولات ذات الذيل الثايمين تكوُّن ثنائيات المحولات. عادةً ما يكون نوع المحول المستخدم مزدوج السلاسل وله شكل Y، أي أنه يحتوي على منطقة في الطرف ذي الذيل الثايمين تكون مُكمِّلة، ومنطقة في الطرف الآخر تكون غير مُكمِّلة. يسمح استخدام هذا النوع من المحولات بإنشاء قالب من الحمض النووي القديم (aDNA) مُحاط بتسلسلات محولات غير مُكمِّلة مختلفة في كل طرف، وهي مفيدة للتسلسل أحادي الاتجاه. ^{[ 5 ]}

تعتمد استراتيجية أخرى على استخدام مكتبات الحمض النووي أحادي السلسلة. في هذه الطريقة، يُفصل الحمض النووي أولًا باستخدام الحرارة لإنتاج سلسلة واحدة، ثم يُربط بمحول أحادي السلسلة مُؤَشَّر بالبيوتين . بعد ذلك، تُستخدم سلسلة الحمض النووي كقالب بواسطة بوليميراز الحمض النووي الذي يُنتج السلسلة المُكملة. لاحقًا، يُربط محول ثانٍ بالنهاية 3' للسلسلة المُكملة، ويُضخَّم التركيب الكامل باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ثم يُسلسل. تُجرى خطوة التنقية باستخدام خرزات مغناطيسية مُغطاة بالستربتافيدين ، مما يُقلل من فقدان الحمض النووي خلال هذه المرحلة من العملية. ^{[ 5 ]}

طُوِّرت طرقٌ مختلفة (تُسمى طرق الإثراء) لتحسين إمكانية الوصول إلى الحمض النووي الداخلي في البقايا القديمة. ويمكن تقسيم هذه الطرق إلى ثلاثة أنواع رئيسية: تلك المستخدمة أثناء بناء المكتبة، من خلال دمج أجزاء الحمض النووي القديم التي تتميز بمستوى عالٍ من التلف؛ وتلك المُطبَّقة بعد بناء المكتبة، من خلال فصل الأجزاء الخارجية والداخلية عبر التهجين مع مجموعات مُحدَّدة مسبقًا من المجسات (في المحلول أو على المصفوفات الدقيقة )؛ أو تلك القائمة على الهضم المُوجَّه للحمض النووي الميكروبي البيئي باستخدام إنزيمات التقييد والتقاط تمديد البادئ (PEC). ^{[ 5 ]}

يعتمد تحليل بيانات التسلسل المُستحصلة بتقنية التسلسل عالي الإنتاجية (NGS) على نفس الأساليب الحسابية المُستخدمة في تحليل الحمض النووي الحديث، مع بعض الخصائص المميزة. تُعد حزمة PALEOMIX أداة شائعة الاستخدام لمحاذاة قراءات الحمض النووي القديم (aDNA) مع الجينومات المرجعية، حيث تُتيح قياس مستويات تلف الحمض النووي من خلال mapDamage2 وإجراء تحليلات جينومية تطورية وتحليلات ميتاجينومية. من المهم الأخذ في الاعتبار أن المحاذاة ستُظهر دائمًا نسبًا كبيرة من النيوكليوتيدات غير المتطابقة، والتي لا تنتج عن أخطاء التسلسل أو تعدد الأشكال، بل عن وجود قواعد تالفة. لهذا السبب، يجب اختيار عتبة القبول لمسافة التحرير بين القراءة والمرجع وفقًا للمسافة التطورية إلى الجينوم المرجعي . وقد طُوّرت مُحاذيات احتمالية تأخذ في الحسبان نمط تلف الحمض النووي القديم لتحسين المحاذاة. ^{[ 5 ]}

تقتصر دراسات الحمض النووي القديم لمسببات الأمراض على مجموعات الهياكل العظمية التي يتغير مظهرها نتيجة للعدوى. ويتم تحديد مسبب المرض المرتبط بسياق وبائي معروف من خلال الفحص دون معرفة مسبقة بوجوده. وتشمل الطرق مناهج جزيئية واسعة النطاق تركز على الكشف عن مسببات الأمراض عبر تقنية المصفوفات الدقيقة القائمة على التهجين الفلوري، أو تحديدها عبر إثراء الحمض النووي لمناطق ميكروبية معينة، أو الفحص الحاسوبي لبيانات التسلسل غير المُثرى مقابل مجموعات بيانات الميكروبيوم البشري . توفر هذه المناهج تحسينات، لكنها لا تزال متحيزة في التصنيفات البكتيرية المستخدمة لتحديد الأنواع. ^{[ 10 ]}

أداة محاذاة ميغان (MALT) هي برنامج جديد يُستخدم لمحاذاة وتصنيف الحمض النووي القديم بسرعة. يشبه MALT برنامج BLAST في حساب المحاذاة المحلية بين التسلسلات المحفوظة للغاية والمراجع. كما يُمكن لـ MALT حساب المحاذاة شبه العالمية حيث تتم محاذاة القراءات من طرف إلى طرف. جميع المراجع، وهي عبارة عن جينومات بكتيرية كاملة، موجودة في قاعدة بيانات تُسمى RefSeq التابعة للمركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI). يتكون MALT من برنامجين: malt-build وmalt-run. يُستخدم malt-build لإنشاء فهرس لقاعدة بيانات التسلسلات المرجعية المُعطاة. أما malt-run، فيُستخدم لمحاذاة مجموعة من تسلسلات الاستعلام مع قاعدة البيانات المرجعية. ثم يحسب البرنامج قيمة البت والقيمة المتوقعة (E-value) للمحاذاة، ويُقرر ما إذا كان سيحتفظ بالمحاذاة أو يتجاهلها بناءً على عتبات يُحددها المستخدم لقيمة البت أو القيمة المتوقعة أو نسبة التطابق. يمثل مؤشر البت حجم قاعدة بيانات التسلسلات اللازمة للعثور على التطابق الحالي فيها بالصدفة. كلما ارتفع مؤشر البت، كان تشابه التسلسل أفضل. أما قيمة E فهي عدد النتائج المتوقعة ذات الجودة (المؤشر) المماثلة التي يمكن العثور عليها بالصدفة. كلما انخفضت قيمة E، كان التطابق أفضل. ^{[ 10 ]}

تتيح تقنية MALT فحص بيانات التسلسل غير المُخصبة للبحث عن مسببات الأمراض البكتيرية المرشحة غير المعروفة والمتورطة في تفشي الأمراض في الماضي، ولاستبعاد الخلفية البكتيرية البيئية. وتكتسب MALT أهمية بالغة لأنها توفر ميزة الفحص على مستوى الجينوم دون الحاجة إلى اختيار كائن حي مستهدف محدد، مما يتجنب الأخطاء الشائعة في طرق الفحص الأخرى. وللتحقق من صحة التصنيفات التصنيفية المرشحة، يلزم إجراء محاذاة كاملة، ولكن غالبًا ما يكون الحمض النووي المستهدف موجودًا بكمية ضئيلة، لذا قد لا يكون عدد قليل من منطقة محددة كافيًا للتعرف عليه. ولا تستطيع هذه الطريقة الكشف إلا عن الحمض النووي البكتيري والفيروسي، وبالتالي لا يمكن تحديد العوامل المعدية الأخرى التي قد تكون موجودة في العينة. وتُعد هذه الطريقة مفيدة للدراسات التي تتناول تحديد مسببات الأمراض المسؤولة عن الأمراض القديمة والحديثة، لا سيما في الحالات التي لا تكون فيها الكائنات المرشحة معروفة مسبقًا . ^{[ 10 ]}

من التطبيقات المثيرة للاهتمام لتقنيات التسلسل المختلفة المتاحة حاليًا دراسة تفشي الأمراض التاريخية للإجابة على أسئلة مهمة وطويلة الأمد في علم الأوبئة، وتطور مسببات الأمراض، وكذلك تاريخ البشرية. ^{[ 2 ]}

لذا، تُبذل جهودٌ حثيثةٌ لجمع المزيد من المعلومات حول أسباب الأمراض المعدية ذات الأهمية التاريخية، كالطاعون ووباء كوكوليزتلي ، ولوصف الانتشار الجغرافي للفيروسات، ومحاولة تحديد الآلية المرضية لهذه العوامل المعدية التي تُعدّ في الواقع عناصر فاعلة في عملية التطور. ويبدو اليوم أن بكتيريا يرسينيا الطاعونية (Y. pestis) والسالمونيلا المعوية (S. enterica) غير ضارة بالبشر، لكن العلماء ما زالوا مهتمين بتتبع التكيف الجيني لهذه البكتيريا على المدى الطويل، والقياس الدقيق لمعدلات تغيرها التطوري. وذلك لأنهم يستطيعون استخلاص الأفكار الصحيحة من هذه المعرفة التاريخية لوضع استراتيجية لمواجهة الأوبئة المستقبلية. ^{[ 2 ]}

إدراكًا لحقيقة أن البكتيريا والفيروسات من أكثر العناصر تنوعًا في الطبيعة، وعرضةً لتغيرات جينية لا حصر لها، وانطلاقًا من استحالة السيطرة على جميع العوامل الخارجية التي قد تؤثر على تطور فيروس ممرض، لا أحد يتحدث عن دحر تفشٍ محتمل جديد للطاعون أو أي عامل مُعدٍ آخر من الماضي؛ بل الهدف هنا هو وضع استراتيجية، أو "خطة توجيهية"، للاستعداد بشكل أفضل عند ظهور مسبب مرض خطير جديد. يجب تحديد دور البيئة في العدوى، وتُعد عوامل مثل الهجرة البشرية، وتغير المناخ، والاكتظاظ السكاني في المدن، وتدجين الحيوانات من الأسباب الرئيسية التي تُسهم في ظهور الأمراض وانتشارها. وبالطبع، هذه العوامل غير قابلة للتنبؤ، وهذا هو السبب الذي يدفع الباحثين إلى محاولة استخلاص معلومات قيّمة من الماضي، والتي قد تكون مفيدة اليوم وفي المستقبل. وبينما يواصلون تطوير استراتيجيات لمواجهة التهديدات الناشئة باستخدام أدوات التشخيص والجزيئية والتقنيات المتقدمة، فإنهم ما زالوا ينظرون إلى كيفية تطور مسببات الأمراض القديمة وتكيفها عبر الأحداث التاريخية. كلما ازداد فهمنا للأساس الجيني لضراوة الأمراض التاريخية، كلما ازداد فهمنا لظهور الأمراض المعدية وعودتها في الوقت الحاضر وفي المستقبل. ^{[ 2 ]}

تشير تحليلات العلاقات التطورية بين المضيف البشري ومسببات الأمراض الفيروسية إلى أن العديد من الأمراض كانت تتطور بالتزامن مع البشر لآلاف السنين، منذ بداية التاريخ البشري في إفريقيا.

على وجه الخصوص، يُعتبر التفاعل طويل الأمد مع مسببات الأمراض عاملَ انتقاء قويًا للغاية، إذ لا يستطيع جميع الأفراد البقاء على قيد الحياة بعد التعرض لجميع العوامل المعدية التي صادفوها على مر السنين: فالانتقاء الطبيعي بواسطة مسببات الأمراض له دورٌ في تطور الأنواع. وقد استُخدم هذا التفاعل بالفعل لتتبع تحركات السكان وإعادة بناء تدفقات الهجرة البشرية داخل أفريقيا وخارجها. ^{[ 11 ]}

يُعدّ استخدام الحمض النووي القديم (aDNA) لفهم تطور الإنسان بشكل أفضل تطبيقًا وتفسيرًا حديثًا لهذه الخاصية. من المحتمل أن العديد من الأمراض المعدية الاستوائية لعبت دورًا هامًا في عملية التطور البشري. يمكن فهم العلاقة بين الإنسان والفيروسات إذا نُظر إليها على أنها "معركة" مستمرة منذ آلاف السنين، ولم يحسمها أحد بعد: فعندما غيّرت الفيروسات خصائصها لتصبح معدية للفيروسات الأخرى، كان على الإنسان إيجاد استراتيجية لزيادة قدرته على البقاء والبقاء في ظل هذه التغيرات. ^{[ 11 ]}

في هذا التحدي المستمر على مر السنين، إلى جانب الأمراض المعدية وغيرها من الأمراض التي تصيب المجتمع البشري الحديث، يُعد السرطان مؤخرًا أحد أكثر الأمراض غموضًا. يبحث العلماء فيما إذا كانت الأمراض السرطانية تقتصر على مجتمعات ما بعد الصناعة، أم أن أصولها تعود إلى عصور أقدم، ربما إلى ما قبل التاريخ. تكمن الصعوبة في أن السرطان، وهو مرض فتاك وسريع الانتشار، لا يترك سوى القليل من الآثار في الهياكل العظمية في حالات الوفاة المبكرة، بل ولا يترك أي أثر على الإطلاق في حالة الأورام خارج الهيكل العظمي. على أي حال، لا تزال معرفتنا بأسباب السرطان غير مكتملة، وتلعب الكائنات الدقيقة دورًا في ذلك من خلال العدوى التي تنقلها: فربما تكون حركات الهجرة في الماضي قد جلبت معها فيروسات، ما يجعلها خزانًا محتملاً للأمراض الاستوائية ، فضلاً عن كونها عاملًا محفزًا للإصابة بالسرطان. لهذا السبب، تُطبق تقنيات التحليل الجزيئي على البقايا الأثرية لدراسة تطور أشباه البشر، وكذلك لتحسين البحث في فهم وبائيات الأورام وأسبابها. يمكن استخدام المعلومات المستمدة من الحمض النووي القديم لتحديد طفرات مسببات الأمراض وإعادة بناء العملية التطورية انطلاقاً من وجود الكائنات الدقيقة، وقد يكون ذلك مفيداً لتطوير لقاحات جديدة أو لاكتشاف التهديدات المرضية المحتملة في المستقبل. ^{[ 11 ]}

تتميز بكتيريا Y. pestis عن النوعين الآخرين بقدرتها على إحداث المرض وآلية انتقالها. وتعود هذه الاختلافات إلى وجود بلازميدين: pPCP1، الذي يمنح البكتيريا خصائصها الغازية في البشر، وpMT1، الذي يشارك في استعمار البراغيث (إلى جانب فقدان بعض وظائف الجينات الكروموسومية البكتيرية).

سمحت العينات التي يعود تاريخها إلى أواخر العصر الحجري الحديث والعصر البرونزي بتحديد أول تباين جيني بين أسلاف Y. pseudotuberculosis و Y. pestis . وقد غابت الخصائص التي تمنح Y. pestis ضراوتها عن هذه السلالات: فهي تفتقر إلى جين ymt ، وهو جين ضروري لاستعمار الناقل؛ كما أنها احتوت على شكل نشط من الجينات اللازمة لتكوين الأغشية الحيوية (غير نشطة في Y. pestis الممرضة ) وجين فلاجيلين نشط ، وهو محفز للاستجابة المناعية (وهو جين كاذب في Y. pestis ). ^{[ 1 ]}

أكدت مقارنة مسودة الجينوم والبلازميدين (pCD1 و pMT1) مع عينات من ضحايا الطاعون الأسود (1348-1349) في مقبرة إيست سميثفيلد على مستوى عالٍ جدًا من الحفاظ الجيني على التسلسل: 97 اختلافًا فقط في النوكليوتيدات المفردة على مدى 660 عامًا. ^{[ 14 ]}

تحتوي السلالة الفردية لندن 6330 على طفرات غير موجودة في العزلات الأخرى من نفس الفترة (1348-1350): قد يكون السبب إما وجود سلالات متعددة منتشرة في أوروبا في نفس الوقت أو التطور الدقيق لسلالة واحدة خلال الجائحة. ^{[ 14 ]}

هناك ثلاث حالات تفشي وبائي لبكتيريا يرسينيا الطاعونية :

1. يُعرف الأول باسم طاعون جستنيان، وقد ظهر لأول مرة في مصر بين عامي 541 و543 ميلاديًا، ثم انتشر إلى القسطنطينية والمناطق المجاورة. واستمر تفشيه في أوروبا حتى عام 750 ميلاديًا. أظهر التحليل الجيني أن كلا الجينومين ينتميان إلى سلالة منقرضة اليوم، ويرتبطان ارتباطًا وثيقًا بسلالات من الصين المعاصرة، مما يُشير إلى احتمال أن يكون أصل الوباء الأول من شرق آسيا.
2. يُعرف الوباء الثاني بالموت الأسود أو الطاعون العظيم. وقد انتشر في أوروبا بين عامي 1346 و1352، وشهد موجات متكررة من الطاعون، واستمر حتى القرن الثامن عشر. من المحتمل أن يكون هذا الوباء قد تسبب في دخول سلالتين مختلفتين من بكتيريا الطاعون (Y. pestis) إلى القارة الأوروبية عبر موجات متفرقة.
3. بدأ الوباء الثالث في الصين عام 1860. وانتشر بسرعة إلى بلدان أخرى، بسبب استخدام السكك الحديدية والسفن البخارية.

تظهر السلالات المرتبطة بطاعون جستنيان على فرع جديد، يختلف وراثيًا عن جائحتي الطاعون الثانية والثالثة. نجت السلالة الأولى من بكتيريا يرسينيا الطاعونية التي عُثر عليها خلال التفشي الثاني، وأدت إلى ظهور سلالات الفرع الأول الحديثة المرتبطة بتفشي الجائحة الثالثة.

تشترك بكتيريا الطاعون الأولى وسلالتي الطاعون الثانية والثالثة في سلف مشترك. ^{[ 2 ]}

في دراسة حديثة ^{[ 15 ]} ، تم تحليل جينومات بكتيريا Y. pestis من ثلاث عينات جُمعت من برشلونة (توفيت بين عامي 1300 و1420)، وإلفانغين (بين عامي 1486 و1627)، ومدينة بولغار (بين عامي 1298 و1388). حُدد تاريخ وفاة الأفراد الذين تم تحليلهم باستخدام التأريخ بالكربون المشع ؛ وقد تأكدت وفاة الفرد الأخير من خلال وجود عملة معدنية صُنعت بعد عام 1362. من بين 223 عينة من 178 فردًا، احتوت عينة واحدة فقط من كل موقع على كمية كافية من الحمض النووي، وتم اختيارها في النهاية لتسلسل الجينوم الكامل للبكتيريا (من خلال اختبار التقاط الجينوم، باستخدام جينوم Y. pseudotuberculosis كمسودة ، بالإضافة إلى pMT1 وpCD1 من Y. pestis ).

أظهرت مقارنة التسلسل الجيني مع شجرة تطور سلالة Y. pestis، المُنشأة باستخدام جينومات قديمة معروفة سابقًا، زيادةً في التنوع الجيني خارج الصين مقارنةً بما كان يُعتقد سابقًا؛ إذ تقع جميع الجينومات الثلاثة الجديدة في الفرع 1، وتحتوي على اثنين من تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) المرتبطة بالطاعون الأسود (جميع جينومات Y. pestis التي يعود تاريخها إلى خريطة الطاعون الأسود في الفرع 1). ^{[ 14 ]} لا توجد اختلافات بين سلالة برشلونة وسلالة لندن؛ فقد توفي الشخصان اللذان تم الحصول على الجينوم منهما بسبب الطاعون بفارق بضعة أشهر (ربيع وخريف عام 1348 ^{[ 16 ] [ 17 ]} )، مما يؤكد وجود موجة واحدة من الطاعون في أوروبا ذات تنوع جيني منخفض. تقع سلالة إيلفانغين في فرع فرعي من الفرع 1، وهي سلف لسلالة تم تسلسلها سابقًا (L'Observance). ^{[ 18 ]} وهي تنحدر من السلالة التي انتشرت في لندن وبرشلونة خلال الطاعون الأسود، ولكنها تحتوي أيضًا على طفرات إضافية. لذلك يُعتبر هذا السلالة متفرعة من الفرع 1 قبل القرن السادس عشر (تفشي إيلفانجن) وليس لها أحفاد معاصرون معروفون. ^{[ 15 ]}

بالمقارنة مع العزلات من الطاعون الأسود، فإن سلالة مدينة بولغار تُظهر ما يلي:

• p3 و p4، مشتركة بين "الفرد 6330 من لندن"؛
• p6، مشترك مع جميع سلالات الفرع 1 الحديثة؛
• p7، خاص بهذه السلالة؛

يحمل سلالة مدينة بولغار طفرات جينية مرتبطة بالموت الأسود، ويمكن اعتبارها دليلاً على انتقال الطاعون شرقاً. تدعم هذه النتائج أحد النماذج التي تحاول تفسير العلاقة بين الجائحتين الثانية والثالثة: في هذا السيناريو، كان هناك خروج واحد للطاعون إلى أوروبا (مسبباً الموت الأسود)، وبعد حدث إشعاعي، انتقل شرقاً ليستقر في الاتحاد السوفيتي السابق وآسيا، ومنها انتشر في القرن الثامن عشر ليؤدي إلى الجائحة الثالثة. ^{[ 15 ]}

ثمة فرضية أخرى مفادها أن سلالة الوباء الثالث ربما تكون قد نشأت عن تنوع جيني موجود مسبقًا في سلالات يرسينيا الطاعونية في الصين؛ وتدعم هذه الفرضية بالفعل العلاقة بين الموجات اللاحقة للوباء في أوروبا والتقلبات المناخية التي سمحت بانتشاره في القارة. ولا يستطيع هذا النموذج تفسير التنوع الجيني للطاعون الأسود (أربع سلالات مختلفة على الأقل، الأمر الذي كان سيتطلب دخول أربع سلالات مختلفة من آسيا). ^{[ 19 ]}

مرة أخرى، هناك نموذجان يحاولان تفسير تفشي الطاعون المتعدد في أوروبا في أعقاب الموت الأسود:

• تكرار دخول الطاعون من آسيا. يتوافق هذا السيناريو مع النظرية الثانية التي نوقشت سابقًا والتي ترى تنوعًا جينيًا في بكتيريا يرسينيا الطاعونية في الصين؛ ^{[ 20 ]}
• وجود خزان في أوروبا (انقرض الآن) تسبب في تفشي المرض بشكل مستمر حتى القرن الثامن عشر؛

كلا النموذجين صحيحان، ولا نستطيع حاليًا ترجيح أحدهما على الآخر. مع ذلك، يُمكن اعتبار تسلسل جينوم سلالة إيلفانغين الذي تم تحليله في هذه الدراسة دليلًا على صحة الفرضية الثانية، نظرًا للموقع الجغرافي للمدينة الذي يُرجّح عدم إمكانية دخول الطاعون من الشرق. ^{[ 15 ]}

أتاح تسلسل جينومات Y. pestis اكتشاف حدث تباين سبق الموت الأسود وأدى إلى ظهور العديد من السلالات المنتشرة اليوم. ^{[ 15 ]}

أجرى العلماء استخلاص الحمض النووي القديم (aDNA) من أسنان 24 فرداً من السكان الأصليين من مقبرة تعود إلى عصر الأوبئة، و5 أفراد دُفنوا في مقبرة تعود إلى ما قبل عصر التواصل مع الأوروبيين. وتم الاستخلاص وفقاً لبروتوكول استخلاص الحمض النووي القديم. كما فحص فريق الباحثين، بالتوازي، عينة من تربة المقابر للحصول على نظرة عامة على الكائنات الدقيقة البيئية التي ربما تكون قد تسربت إلى العينات.

بعد استخلاص الجينومات، تم تسلسلها باستخدام محلل جينوم Illumina. ثم، باستخدام أداة معلوماتية حيوية تُسمى MALT، أجرى الباحثون تحليلًا لبيانات تسلسل الميتاجينوم . يتيح هذا البرنامج للباحثين محاذاة التسلسلات المستخلصة مع مرجع دون تحديد هدف دقيق. أجرى الباحثون تشغيل MALT مرتين: الأولى باستخدام الجينومات البكتيرية الكاملة المتوفرة عبر NCBI (المركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية) RefSeq كمرجع، والثانية باستخدام قاعدة بيانات النيوكليوتيدات الكاملة التابعة لـ NCBI لفحص الحمض النووي الفيروسي.

أظهرت نتائج الفحص وجود الحمض النووي لبكتيريا السالمونيلا المعوية في 10 تسلسلات من أصل 24 تسلسلاً تم جمعها من العينات، كما احتوت ثلاث عينات من الأسنان على عدد كبير من القراءات المنسوبة إلى السالمونيلا المعوية . وبشكل خاص، فإن السلالة الرئيسية من السالمونيلا المعوية الموجودة في العينات هي السالمونيلا نظيرة التيفية ج، وهي السلالة المسببة لحمى التيفوئيد لدى البشر. في عينات ما قبل التواصل مع الأوروبيين، لم يُعثر على أي دليل على وجود السالمونيلا المعوية ، مما يدعم فرضية أن السالمونيلا المعوية لم تكن بكتيريا محلية.

أُجري تحليل إضافي لتحديد النمط الكلاسيكي لتلف الحمض النووي القديم في عينات الأسنان الثلاث الإيجابية، وذلك من خلال ربط مجموعات البيانات بالمرجع الجينومي لبكتيريا السالمونيلا باراتيفي سي. وجاءت النتائج إيجابية، مما يدعم فرضية أن السالمونيلا المعوية هي سبب مرض الكوكوليتزلي.

للتعمق في التحليلات وتأكيد الفرضية، أجرى الباحثون تجارب وتحليلات حاسوبية إضافية. نفذوا تحليلًا مستهدفًا للجينوم الكامل وتقنية التهجين في المحلول باستخدام مجسات تتضمن اختلافات جينوم السالمونيلا المعوية الحديثة ، مع استخدام السالمونيلا نظيرة التيفية ج كمرجع. نجح التهجين في العينات العشر الموجبة، بينما كانت نتائج العينات الأخرى سلبية للحمض النووي القديم. ^{[ 10 ]}