كروماتوغرافيا العمود

الكروماتوغرافيا العمودية هي طريقة كروماتوغرافية تُستخدم في الكيمياء التحليلية لفصل المكونات الفردية ( المواد المراد تحليلها ) لمزيج. يُحمل المزيج بواسطة مذيب ( المذيب ) لتكوين الطور المتحرك . يتحرك الطور المتحرك عبر عمود معبأ بجزيئات صلبة ( الطور الثابت ) . تمتص المكونات على الطور الثابت بمعدلات مختلفة، لذا تخرج من العمود في أوقات مختلفة، مما يؤدي إلى فصلها.

تتميز هذه التقنية بتطبيقاتها الواسعة، إذ يمكن استخدام العديد من المواد الماصة المختلفة (الطور العادي، الطور المعكوس ، أو غيرها) مع مجموعة متنوعة من المذيبات. ويمكن تطبيقها على نطاقات تتراوح من الميكروغرامات إلى الكيلوغرامات. وتتمثل الميزة الرئيسية لكروماتوغرافيا الأعمدة في انخفاض تكلفتها نسبيًا، وإمكانية استبدال الطور الثابت بعد الاستخدام، مما يمنع التلوث المتبادل وتدهور الطور الثابت نتيجة إعادة التدوير. أما الطور المتحرك فيتحرك بفعل الجاذبية، أو الغاز المضغوط، أو المضخات المضغوطة (كما هو الحال في كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء ).

قبل إجراء عملية الفصل الكروماتوغرافي العمودي، يُجرى عادةً فصل كروماتوغرافي طبقي رقيق على كمية صغيرة من العينة أولاً، لمعرفة كيفية تفاعل خليط المركبات عند تنقيته بواسطة الفصل الكروماتوغرافي العمودي. وهذا يسمح للمُجرِّب بتحسين مزيج الطورين المتحرك والثابت لهذه العينة تحديداً.

يُحضّر العمود بتعبئة مادة ماصة صلبة داخل أنبوب أسطواني من الزجاج أو البلاستيك. ويعتمد حجم الأنبوب على كمية المركب المراد عزله. تحتوي قاعدة الأنبوب على مرشح لتثبيت المادة الصلبة في مكانها. يكون المرشح إما سدادة مصنوعة من القطن أو الصوف الزجاجي ، أو قرصًا زجاجيًا مساميًا . ويمكن تركيب خزان للمذيب في أعلى العمود.

تُستخدم طريقتان رئيسيتان لتحضير عمود الفصل الكروماتوغرافي: الطريقة الجافة والطريقة الرطبة . في الطريقة الجافة، يُملأ العمود أولًا بمسحوق الطور الثابت الجاف، ثم يُضاف إليه الطور المتحرك، الذي يُضخ عبر العمود حتى يُصبح رطبًا تمامًا، ويُمنع جفافه بعد ذلك. ^{[ 1 ]} أما في الطريقة الرطبة، فيُحضّر معلق من المذيب مع مسحوق الطور الثابت، ثم يُسكب بعناية في العمود. يجب أن يكون سطح السيليكا مستويًا، ويمكن حمايته بطبقة من الرمل. يُمرر المذيب ببطء عبر العمود لدفع المادة العضوية.

تُحتجز المكونات الفردية بواسطة الطور الثابت بشكل مختلف وتنفصل عن بعضها البعض أثناء مرورها بسرعات مختلفة عبر العمود مع المذيب. وفي نهاية العمود، تخرج كل مكون على حدة. خلال عملية الفصل الكروماتوغرافي بأكملها، يُجمع المذيب في سلسلة من الأجزاء . ويمكن جمع هذه الأجزاء تلقائيًا باستخدام أجهزة تجميع الأجزاء. ويمكن زيادة إنتاجية الفصل الكروماتوغرافي بتشغيل عدة أعمدة في وقت واحد، وفي هذه الحالة تُستخدم أجهزة تجميع متعددة التدفقات. ويمكن مراقبة تركيب تدفق المذيب، ويُحلل كل جزء للكشف عن المركبات الذائبة، على سبيل المثال باستخدام الكروماتوغرافيا التحليلية، أو أطياف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ، أو التألق . ويمكن رؤية المركبات الملونة (أو المركبات المتألقة باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية) من خلال الجدار الزجاجي على شكل أشرطة متحركة.

في كروماتوغرافيا الأعمدة، يحتوي العمود على طبقة معبأة بجزيئات صلبة، أو مساحيق مطحونة ناعماً، أو مواد هلامية. تُسمى هذه الطبقة بالطور الثابت أو المادة الماصة . وهي تُصنع غالباً من هلام السيليكا أو الألومينا . وقد استُخدم مسحوق السليلوز في الماضي.

تتوفر مجموعة واسعة من الأطوار الثابتة لتناسب مختلف أنواع كروماتوغرافيا الأعمدة، مثل كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وكروماتوغرافيا الطور المعكوس ، وكروماتوغرافيا التقارب ، أو الامتزاز على طبقة مميعة . قد يكون الطور الصلب دقيق المسام لزيادة مساحة السطح، بينما تستخدم تقنية الامتزاز على طبقة مميعة .

بشكل عام، ينبغي استخدام كمية من الطور الثابت تفوق بكثير كمية خليط التحليل. في كروماتوغرافيا الأعمدة السيليكية تحديدًا، لكل غرام من الكتلة الجافة لخليط التحليل، يجب أن تتراوح كمية الطور الثابت بين 20 و100 غرام. استخدام كمية أكبر من السيليكا من شأنه أن يزيد من قدرة الفصل الكروماتوغرافي، ولكنه سيؤدي أيضًا إلى إبطاء العملية. ^{[ 2 ]}

الطور المتحرك أو المذيب هو مذيب أو خليط من المذيبات المستخدمة لنقل المركبات عبر العمود.

تتعلق المعايير الرئيسية لاختيار المذيب المناسب بعامل الاحتفاظ :

• ينبغي أن يكون عامل الاحتفاظ بالمركب محل الاهتمام حوالي 0.2 - 0.3 من أجل تقليل الوقت وكمية المذيب اللازمين لتشغيل الكروماتوغرافيا.

• ينبغي أن يكون للمركبات الأخرى عوامل احتفاظ مختلفة تمامًا عن عامل الاحتفاظ الخاص بالمركب محل الاهتمام.

لاختيار مذيب جيد، يتم إجراء العديد من الاختبارات الأولية الصغيرة، وغالبًا ما يتم استخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) مع نفس الطور الثابت، باستخدام مذيبات ذات قطبية مختلفة، حتى يتم العثور على نظام مذيب مناسب.

تشمل المذيبات الشائعة في الطور المتحرك، مرتبةً حسب تزايد قطبيتها ، الهكسان ، ثنائي كلورو الميثان ، أسيتات الإيثيل ، الأسيتون ، والميثانول . ^{[ 3 ]} يُعدّ خليط الهكسان وأسيتات الإيثيل نظام مذيب شائعًا. تُضبط النسب بحيث يكون للمركب المستهدف معامل احتجاز يتراوح بين 0.2 و0.3.

خلافاً للاعتقاد الشائع الخاطئ، يمكن استخدام الميثانول وحده كمذيب للمركبات شديدة القطبية، ولا يذيب هلام السيليكا.

يمكن تحسين معدل تدفق المذيب . فزيادة معدل تدفق المذيب تقلل من الوقت اللازم لتشغيل العمود، وبالتالي تقلل من الانتشار، مما يحسن من قدرة الفصل. مع ذلك، إذا كان معدل التدفق مرتفعًا جدًا، فلن يتمكن المُحلَّل من الوصول إلى حالة التوازن بين الطور الثابت والطور المتحرك (انظر معادلة فان ديمتر ).

لزيادة معدل تدفق عمود الفصل الكروماتوغرافي بالجاذبية، يمكن زيادة ارتفاع عمود المذيب الجديد فوق قمة الطور الثابت، أو تقليل ضغط صمام التحكم. كما يمكن زيادته باستخدام مضخة أو باستخدام غاز مضغوط (مثل الهواء أو النيتروجين أو الأرجون ) لدفع المذيب عبر العمود (الفصل الكروماتوغرافي السريع). ^{[ 4 ] [ 5 ]}

يكون حجم جسيمات الطور الثابت أدق عمومًا في كروماتوغرافيا العمود السريع مقارنةً بكروماتوغرافيا العمود بالجاذبية. فعلى سبيل المثال، يُعدّ هلام السيليكا ذو حجم حبيبات يتراوح بين 230 و400 (40-63 ميكرومتر) من أكثر أنواع هلام السيليكا استخدامًا في التقنية الأولى ، بينما تتطلب التقنية الثانية عادةً هلام سيليكا  ذو حجم حبيبات يتراوح بين 70 و230 (63-200 ميكرومتر). ^{[ 6 ]} 

تستغرق عملية الفصل الكروماتوغرافي العمودي وقتاً طويلاً. وقد طورت العديد من الشركات المصنعة، مثل بيوتاج وبوتشي وإنترشيم وتيليداين إيسكو، أنظمة فصل كروماتوغرافي سريع آلية تقلل من التدخل البشري في عملية التنقية.

تُعرف هذه الأنظمة عادةً باسم كروماتوغرافيا السائل منخفض الضغط (LPLC). وهي تتضمن مكونات موجودة عادةً في أنظمة كروماتوغرافيا السائل عالي الضغط (HPLC) الأكثر تكلفة، مثل مضخة التدرج، ومنافذ حقن العينات، وكاشف الأشعة فوق البنفسجية، وجامع الكسور لجمع المذيب، ولكنها تعمل بضغط أقل (عادةً 350-525 كيلو باسكال أو 50.8-76.1 رطل لكل بوصة مربعة ). تستطيع هذه الأنظمة الآلية عادةً فصل عينات تتراوح أوزانها من بضعة ملليغرامات إلى عدة كيلوغرامات على نطاق صناعي، وهي أرخص وأسرع من إجراء عمليات حقن متعددة في أنظمة HPLC التحضيرية.  

تكون دقة نظام كروماتوغرافيا السائل منخفض الضغط (LPLC) (أو قدرته على فصل الخليط) أقل، لأن مادة التعبئة في عمود كروماتوغرافيا السائل عالي الضغط (HPLC) أصغر بكثير، وعادةً ما تكون 5 ميكرومتر فقط. هذا يزيد من مساحة سطح الطور الثابت للتفاعلات، ويؤدي إلى فصل أفضل. مع ذلك، تتسبب وسائط التعبئة الصغيرة في ارتفاع الضغط الخلفي، ومن هنا جاء مصطلح "كروماتوغرافيا السائل عالي الضغط".

تُعبأ أعمدة كروماتوغرافيا السائل منخفض الضغط (LPLC) عادةً بالسيليكا بحجم 50 ميكرومتر تقريبًا، مما يقلل الضغط الخلفي ودقة الفصل، كما أنه يُغني عن الحاجة إلى مضخات الضغط العالي باهظة الثمن. وقد بدأ المصنّعون الآن بالتحول إلى أنظمة كروماتوغرافيا سريعة ذات ضغط أعلى، تعمل فوق 1 ميجا باسكال (150 رطل لكل بوصة مربعة) ، ويُطلق عليها اسم "كروماتوغرافيا السائل متوسطة الضغط" (MPLC).  

عادةً، تُجهز كروماتوغرافيا العمود بمضخات تمعجية، ومحاليل منظمة متدفقة، وعينة المحلول التي تمر عبر الجزء العلوي من العمود. تمر المحاليل والمحاليل المنظمة عبر العمود حيث يقوم جامع الكسور في نهاية العمود بجمع العينات المفصولة. قبل جمع الكسور، تمر العينات المفصولة من العمود عبر كاشف مثل مطياف ضوئي أو مطياف كتلة لتحديد تركيز العينات المفصولة في خليط محلول العينة.

على سبيل المثال، إذا أردت فصل بروتينين مختلفين ذوي قدرات ارتباط متباينة بالعمود من عينة محلول، فإن جهاز قياس الطيف الضوئي الذي يستخدم طول موجة 280  نانومتر يُعدّ كاشفًا مناسبًا. فكلما زاد تركيز البروتين المار عبر المحلول المُستخلص من العمود، زادت امتصاصية هذا الطول الموجي.

نظراً لأن عملية الفصل الكروماتوغرافي العمودي تتميز بتدفق مستمر للمحلول المُستخلص يمر عبر الكاشف بتراكيز متغيرة، يجب على الكاشف رسم تركيز العينة المُستخلصة على مدار الزمن. يُطلق على هذا الرسم البياني لتركيز العينة مقابل الزمن اسم الكروماتوغرام.

الهدف الأساسي من الكروماتوغرافيا هو فصل المكونات المختلفة من خليط محلول. وتعبر الدقة عن مدى الفصل بين مكونات الخليط. كلما زادت دقة الكروماتوغرام، كان فصل العينات التي يوفرها العمود أفضل. تُعد هذه البيانات وسيلة جيدة لتحديد خصائص فصل العمود لتلك العينة تحديدًا. ويمكن حساب الدقة من الكروماتوغرام.

تمثل المنحنيات المنفصلة في الرسم البياني منحنيات تركيز الإذابة المختلفة للعينات مع مرور الوقت، وذلك بناءً على مدى انجذابها لراتنج العمود. لحساب الدقة، يلزم معرفة زمن الاحتفاظ وعرض المنحنى.

وقت الاحتفاظ هو الوقت من بداية اكتشاف الإشارة بواسطة الكاشف إلى ذروة ارتفاع ملف تعريف تركيز الإذابة لكل عينة مختلفة.

عرض المنحنى هو عرض منحنى تركيز العينات المختلفة في الكروماتوجرام بوحدات الزمن.

إحدى الطرق المبسطة لحساب دقة الكروماتوجرام هي استخدام نموذج الصفائح. ^{[ 7 ]} يفترض هذا النموذج إمكانية تقسيم العمود إلى عدد محدد من الأقسام، أو الصفائح، وحساب توازن الكتلة لكل صفيحة على حدة. تُقارب هذه الطريقة منحنى الكروماتوجرام النموذجي بمنحنى التوزيع الغاوسي . وبذلك، يُقدّر عرض المنحنى بأربعة أضعاف الانحراف المعياري للمنحنى، أي 4σ. زمن الاحتفاظ هو الفترة الزمنية من بداية الكشف عن الإشارة إلى لحظة بلوغ ذروة منحنى التوزيع الغاوسي.

من المتغيرات الموجودة في الشكل أعلاه، يمكن حساب الدقة ورقم اللوحة وارتفاع اللوحة لنموذج لوحة العمود.

دقة${\textstyle R_{s}=2{\frac {t_{RB}-t_{RA}}{w_{A}+w_{B}}}}$، أين

t _RB = زمن الاحتفاظ بالمذاب B

t _RA = زمن الاحتفاظ بالمذاب A

w _B = عرض منحنى غاوس للمذاب B

w _A = عرض منحنى غاوس للمذاب A

رقم اللوحة${\displaystyle N=(4t_{R}/w)^{2}}$.

ارتفاع الأطباق${\displaystyle H=L/N}$، أين${\displaystyle L}$هو طول العمود. ^{[ 7 ]}

في عمود الامتزاز، يتكون راتنج العمود (الطور الثابت) من حبيبات دقيقة. حتى الجزيئات الأصغر حجمًا، مثل البروتينات والكربوهيدرات وأيونات المعادن أو المركبات الكيميائية الأخرى، ترتبط بهذه الحبيبات. يُفترض أن كل جزيء مرتبط بالحبيبة الدقيقة يرتبط بنسبة 1:1 مع عينة المذاب التي تُمرر عبر العمود والتي تحتاج إلى تنقية أو فصل.

يمكن نمذجة الارتباط بين الجزيء المستهدف المراد فصله والجزيء المرتبط على حبيبات العمود باستخدام تفاعل توازن بسيط: K _{_eq} = [CS]/([C][S])، حيث K _{_eq} هو ثابت التوازن ، و[C] و[S] هما تركيزا الجزيء المستهدف والجزيء المرتبط على راتنج العمود، على التوالي. [CS] هو تركيز معقد الجزيء المستهدف المرتبط براتنج العمود. ^{[ 7 ]}

باستخدام هذا كأساس، يمكن استخدام ثلاثة أنواع مختلفة من منحنيات الامتصاص لوصف ديناميكيات الارتباط في كروماتوغرافيا العمود: الخطي، ولانغمير، وفروندليش.

يحدث التوازن الحراري الخطي عندما يكون تركيز المذاب المراد تنقيته صغيرًا جدًا مقارنةً بتركيز الجزيء المرتبط. وبالتالي، يمكن تعريف حالة التوازن على النحو التالي:

[CS] = K _eq [C].

في التطبيقات الصناعية واسعة النطاق، يجب أخذ إجمالي جزيئات الربط على حبيبات راتنج العمود في الحسبان، وذلك لضرورة مراعاة المواقع غير المشغولة. يُعد كل من معادلة لانغموير ومعادلة فروندليش مفيدين في وصف هذا التوازن. معادلة لانغموير هي:

[CS] = (K _eq S _tot [C])/(1 + K _eq [C])، حيث S _tot هو إجمالي جزيئات الربط على الخرز.

يُعطى منحنى فروندليش الحراري بالصيغة التالية:

[CS] = K _eq [C] ^1/n

يُستخدم منحنى فروندليش الحراري عندما يكون العمود قادرًا على الارتباط بالعديد من العينات المختلفة في المحلول المراد تنقيته. ولأن هذه العينات المختلفة لها ثوابت ارتباط مختلفة مع الخرز، فإن قيم ثابت التوازن (K_{_eq}) تكون متعددة. لذلك، لا يُعد منحنى لانغموير الحراري نموذجًا مناسبًا للارتباط في هذه الحالة. ^{[ 7 ]}

• كروماتوغرافيا البروتين السائلة السريعة (FPLC) – فصل البروتينات باستخدام كروماتوغرافيا العمود
• الاستشراب السائل عالي الأداء (HPLC) – الاستشراب العمودي باستخدام الضغط العالي

• دليل كروماتوغرافيا العمود السريع (ملف PDF)
• كروماتوغرافيا التدفق الشعاعي