تسلسل DRIP

📅 آخر تحديث: ٢٨ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٨ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 2 صور
الموسوعة الحرة

تقنية DRIP-seq (تسلسل الحمض النووي الريبوزي) هي تقنية لتحليل الجينوم الكامل لنوع من هجائن الحمض النووي الريبوزي-الحمض النووي تسمى " حلقة R ". [ 1 ] تستخدم تقنية DRIP-seq جسمًا مضادًا غير معتمد على التسلسل ولكنه متخصص في البنية لترسيب الحمض النووي الريبوزي-الحمض النووي (DRIP) لالتقاط حلقات R من أجل التسلسل المتوازي الضخم للحمض النووي . [ 1 ]

مقدمة

الأجسام المضادة وحيدة النسيلة R-loop و S9.6

حلقة R هي بنية حمض نووي ثلاثية السلاسل ، تتكون من جزيء DNA-RNA هجين مزدوج وسلسلة DNA أحادية السلسلة مُزاحة (ssDNA). [ 2 ] تتشكل حلقات R بشكل أساسي في المناطق الجينومية الغنية بالسيتوزين أثناء عملية النسخ [ 2 ] ، ومن المعروف أنها تُشارك في التعبير الجيني وتبديل فئات الغلوبولين المناعي . [ 1 ] [ 3 ] [ 4 ] وقد وُجدت في أنواع مختلفة، بدءًا من البكتيريا وصولًا إلى الثدييات. [ 2 ] وتتمركز بشكل تفضيلي في محفزات جزر CpG في الخلايا البشرية والمناطق عالية النسخ في الخميرة. [ 1 ] [ 3 ]

في ظل ظروف غير طبيعية، وتحديدًا زيادة إنتاج هجائن الحمض النووي DNA-RNA، يمكن أن تتسبب حلقات R في عدم استقرار الجينوم عن طريق تعريض الحمض النووي أحادي السلسلة لأضرار داخلية ناتجة عن عمل إنزيمات مثل AID و APOBEC ، أو التعرض المفرط لأنواع كيميائية نشطة. [ 4 ] لذلك، يُعد فهم مكان وظروف تكوّن حلقات R في جميع أنحاء الجينوم أمرًا بالغ الأهمية لفهم أفضل لعدم استقرار الجينوم. في البداية، اقتصر توصيف حلقات R على مناهج خاصة بمواقع محددة. [ 5 ] ومع ذلك، مع ظهور تقنيات التسلسل المتوازي الضخم ، وما تلاها من تقنيات مشتقة مثل DRIP-seq، أصبحت إمكانية فحص الجينومات بأكملها بحثًا عن حلقات R متاحة.

تعتمد تقنية DRIP-seq على الخصوصية العالية والتقارب الكبير للأجسام المضادة وحيدة النسيلة S9.6 تجاه هجائن الحمض النووي DNA-RNA ذات الأطوال المختلفة. تم ابتكار وتوصيف الجسم المضاد S9.6 لأول مرة عام 1986، ويُستخدم حاليًا في الترسيب المناعي الانتقائي لحلقات R. [ 6 ] ومنذ ذلك الحين، استُخدم في طرق ترسيب مناعي متنوعة لتوصيف حلقات R. [ 1 ] [ 3 ] [ 7 ] [ 8 ] يتشابه المفهوم الكامن وراء DRIP-seq مع تسلسل ChIP ؛ حيث تُعد شظايا حلقات R المادة الرئيسية المُرسبة مناعيًا في DRIP-seq.

الاستخدامات والبحوث الحالية

تُستخدم تقنية DRIP-seq بشكل أساسي لرسم خرائط حلقات الحمض النووي الريبوزي (R-loops) على مستوى الجينوم. يُتيح تحديد مواقع تكوّن هذه الحلقات دراسة أحداث خلوية متنوعة، مثل وظيفة تكوّنها في مناطق محددة، وتوصيف هذه المناطق، وتأثيرها على التعبير الجيني. كما يُمكن استخدامها لدراسة تأثير حلقات الحمض النووي الريبوزي في عمليات أخرى مثل تضاعف الحمض النووي وتخليقه. وبشكل غير مباشر، يُمكن إجراء تقنية DRIP-seq على سلالات الخلايا الطافرة التي تفتقر إلى الجينات المشاركة في حلّ حلقات الحمض النووي الريبوزي. [ 3 ] تُوفّر هذه الدراسات معلومات حول أدوار الجين الطافر في تثبيط تكوّن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) والحمض النووي الريبوزي (RNA)، وربما حول أهمية حلقات الحمض النووي الريبوزي في عدم استقرار الجينوم.

استُخدمت تقنية DRIP-seq لأول مرة لتحليل الجينوم الكامل للحلقات R في البشر، مما أظهر انتشارًا واسعًا لتكوّن هذه الحلقات في محفزات جزر CpG. [ 1 ] وعلى وجه الخصوص، وجد الباحثون أن تكوّن الحلقات R مرتبط بحالة عدم مثيلة جزر CpG.

استُخدمت تقنية DRIP-seq لاحقًا لتحليل تكوين حلقات R في مواقع بدء وانتهاء النسخ في خلايا Ntera2 متعددة القدرات البشرية . [ 7 ] في هذه الدراسة، كشف الباحثون أن حلقات R على النهايات 3' للجينات قد تكون مرتبطة بإنهاء النسخ.

سير عمل تسلسل DRIP

سير عمل تسلسل DRIP

استخلاص الحمض النووي الجينومي

أولًا، يُستخلص الحمض النووي الجينومي (gDNA) من الخلايا المستهدفة باستخدام إنزيم البروتينيز K، ثم يُستخلص باستخدام الفينول والكلوروفورم ، ويُرسب باستخدام الإيثانول . ويلزم إجراء هضم إضافي باستخدام إنزيم الزيمولياز لإزالة جدار الخلية من خلايا الخميرة قبل معالجتها بإنزيم البروتينيز K. كما يمكن استخلاص الحمض النووي الجينومي باستخدام طرق أخرى متنوعة، مثل الطرق القائمة على الأعمدة .

تجزئة الحمض النووي الجينومي

يُعالج الحمض النووي الجينومي (gDNA) بإنزيم S1 نوكلياز لإزالة الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) والحمض النووي الريبي ( RNA ) غير المرغوب فيهما ، ثم يُرسب باستخدام الإيثانول لإزالة إنزيم S1 نوكلياز. بعد ذلك، يُجزأ الحمض النووي الجينومي باستخدام إنزيمات القطع المحددة ، مما ينتج عنه شظايا من الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) بأحجام مختلفة. بدلاً من ذلك، يمكن توليد شظايا الحمض النووي الجينومي عن طريق المعالجة بالموجات فوق الصوتية .

الترسيب المناعي

يُحضن الحمض النووي الجينومي المجزأ مع الجسم المضاد أحادي النسيلة S9.6، المُختص ببنية الحمض النووي الريبوزي-الحمض النووي. تُعد هذه الخطوة فريدة من نوعها في بروتوكول DRIP-seq، إذ تعتمد كليًا على الخصوصية العالية والتقارب الكبير للجسم المضاد S9.6 مع هجائن الحمض النووي الريبوزي-الحمض النووي. سيتعرف الجسم المضاد على هذه المناطق المنتشرة في جميع أنحاء الجينوم ويرتبط بها ، وسيُستخدم في عملية الترسيب المناعي. ترتبط الأجسام المضادة S9.6 بالخرزات المغناطيسية من خلال التفاعل مع روابط محددة (مثل البروتين A أو البروتين G ) على سطح الخرزات. وبالتالي، سترتبط شظايا الحمض النووي الريبوزي-الحمض النووي بالخرزات بواسطة الجسم المضاد.

الإذابة

تُغسل الخرزات المغناطيسية لإزالة أي حمض نووي جينومي غير مرتبط بها عبر سلسلة من عمليات الغسل، ثم تُستخلص هجائن الحمض النووي-الرنا عن طريق الاستخلاص. ولإزالة الأجسام المضادة المرتبطة بهجائن الأحماض النووية، يُعالج الحمض النووي بإنزيم البروتينيز K، يليه استخلاص بالفينول والكلوروفورم، ثم ترسيب بالإيثانول. ينتج عن ذلك عزل هجائن الحمض النووي-الرنا النقية بأحجام مختلفة.

التسلسل

لإجراء التسلسل المتوازي الضخم لهذه الأجزاء، يتم معالجة المادة المترسبة مناعياً بالموجات فوق الصوتية، واختيار الحجم، وربطها بمحولات قليلة النوكليوتيدات المشفرة بالباركود لإثراء المجموعات وتسلسلها.

التحليل الحسابي

للكشف عن مواقع تكوّن حلقات الحمض النووي الريبوزي (R-loop)، تُحاذى مئات الملايين من قراءات التسلسل من تقنية DRIP-seq أولاً مع جينوم مرجعي باستخدام مُحاذي تسلسل القراءات القصيرة ، ثم تُستخدم طرق تحديد القمم المصممة لتقنية ChIP-seq لتقييم إشارات DRIP. [ 1 ] إذا استُخدمت مجموعات مختلفة من إنزيمات التقييد في تجارب DRIP-seq مختلفة لنفس العينة، تُحدد قمم DRIP-seq التوافقية. [ 7 ] عادةً، تُقارن القمم بتلك الموجودة في عينة مُعالجة بإنزيم RNase H1 ، والتي تُستخدم كعنصر تحكم. [ 1 ] [ 7 ]

تم تطوير العديد من الأدوات الحاسوبية وقواعد البيانات والأطر التحليلية للتنبؤ بمجموعات بيانات R-loops وDRIP-seq، وشرحها، وتصويرها، وتحليلها التكاملي، بما في ذلك QmRLFS-finder وDROPA وR-loopBase وRLBase. [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]

القيود

نظراً لعدم وجود طريقة أخرى تعتمد على الأجسام المضادة لترسيب الحمض النووي الريبوزي الحلقي (R-loop)، فإن التحقق من صحة نتائج تسلسل الحمض النووي الريبوزي الحلقي (DRIP-seq) أمرٌ صعب. مع ذلك، يمكن استخدام نتائج طرق أخرى لتحليل الحمض النووي الريبوزي الحلقي، مثل تسلسل الحمض النووي الريبوزي الحلقي (DRIVE-seq)، لقياس التوافق.

من جهة أخرى، يعتمد تسلسل DRIP-seq على منصات التسلسل قصيرة القراءة الحالية لتسلسل حلقات R. بعبارة أخرى، تنطبق جميع القيود المتأصلة في هذه المنصات على تسلسل DRIP-seq أيضًا. على وجه الخصوص، تُنتج منصات التسلسل قصيرة القراءة التقليدية تغطية قراءة غير متساوية في المناطق الغنية بالـ GC. قد يُمثل تسلسل حلقات R الطويلة تحديًا لأنها تتشكل في الغالب في مناطق الحمض النووي الغنية بالسيتوزين. علاوة على ذلك، تميل المناطق الغنية بالـ GC إلى أن تكون منخفضة التعقيد بطبيعتها، مما يُصعّب على برامج محاذاة القراءات القصيرة إنتاج محاذاة فريدة.

طرق أخرى لتحليل خصائص حلقات R

على الرغم من وجود العديد من الطرق الأخرى لتحليل وتوصيف تكوين حلقات الحمض النووي الريبوزي (R-loop)، [ 5 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] إلا أن القليل منها فقط يوفر تغطية وموثوقية على مستوى الجينوم بأكمله. [ 1 ] [ 3 ]

  • تعديل الحمض النووي باستخدام البيسلفيت غير المُفسِخ والتسلسل : تتضمن هذه الطريقة معالجة الحمض النووي بالبيسلفيت متبوعةً بالتسلسل، وتعتمد على التأثير المُطَفِّر لبيسلفيت الصوديوم على الحمض النووي أحادي السلسلة. على الرغم من أن هذه الطريقة تُستخدم في المقام الأول لتحديد مواقع مُحفِّزات جزر CpG المُحدَّدة، [ 1 ] فقد استُخدمت أيضًا للكشف عن حلقات R على نطاق ضيق [ 5 ] ومواقع هشة أخرى في الحمض النووي أحادي السلسلة. [ 21 ]
  • إثراء الحمض النووي DNA:RNA في المختبر (DRIVE-seq) : [ 1 ] تشترك هذه الطريقة في مبادئ مشابهة جدًا لطريقة DRIP-seq، باستثناء استخدام إنزيم MBP-RNASEH1 الداخلي بدلًا من الجسم المضاد S9.6 لاستعادة حلقات الحمض النووي الريبوزي. يوفر MBP-RNASEH1 بديلًا للجسم المضاد S9.6 عند الحاجة إلى اختبار التقاط إضافي، إلا أن الإفراط في التعبير عن هذا الإنزيم قد يُسبب مخاطر سمية خلوية في الجسم الحي .
  • الترسيب المناعي للحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) متبوعًا بالتهجين على مصفوفة دقيقة متعددة الطبقات (DRIP-chip) : [ 3 ] تعتمد هذه الطريقة أيضًا على استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة S9.6. ولكن بدلًا من إدخال المادة المترسبة مناعيًا في عملية التسلسل، يتم تهجينها في DRIP-chip مع مصفوفة دقيقة . من مزايا DRIP-chip مقارنةً بـ DRIP-seq سرعة الحصول على البيانات. أما العوامل المحددة لهذه التقنية فهي عدد المجسات على المصفوفات الدقيقة للرقاقة، وعدم توفر معلومات تسلسل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين.

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 جينو، ب.أ.؛ لوت، ب.ل.؛ كريستنسن، هـ.س.؛ كورف، إ.؛ شيدان، ف. (30 مارس 2012). " تكوين حلقات R سمة مميزة لمُحفزات جزر CpG البشرية غير المُمَثْيَلَة" . الخلية الجزيئية . 45 (6): 814-25 . doi : 10.1016/j.molcel.2012.01.017 . PMC 3319272. PMID 22387027 .  
  2. 1 2 3 أغيليرا، أ؛ غارسيا-موس، ت (27 أبريل 2012). "حلقات R: من نواتج النسخ الثانوية إلى تهديدات استقرار الجينوم" . الخلية الجزيئية . 46 (2): 115-24 . doi : 10.1016/j.molcel.2012.04.009 . PMID 22541554 . 
  3. 1 2 3 4 5 6 تشان، واي إيه؛ أريستيزابال، إم جيه؛ لو، بي واي؛ لو، زد؛ حمزة، إيه؛ كوبور، إم إس؛ ستيرلينغ، بي سي؛ هايتر، بي (أبريل 2014). "تحليل شامل للجينوم لمواقع تهجين الحمض النووي DNA:RNA في الخميرة باستخدام شريحة DRIP" . مجلة PLOS Genetics . 10 (4) e1004288. doi : 10.1371/journal.pgen.1004288 . PMC 3990523. PMID 24743342 .  
  4. 1 2 تشودري، ج؛ تيان، م؛ خونغ، س؛ تشوا، ك؛ بينو، إ؛ ألت، ف.و. (17 أبريل 2003). "إزالة الأمين من الحمض النووي المستهدف بالنسخ بواسطة إنزيم تنويع الأجسام المضادة AID". نيتشر . 422 ( 6933): 726-730 . Bibcode : 2003Natur.422..726C . doi : 10.1038/nature01574 . PMID 12692563. S2CID 771802 .  
  5. يو، ك؛ شيدين، ف؛ هسيه، سي إل؛ ويلسون، تي إي؛ ليبر، إم آر (مايو 2003). "حلقات R في مناطق تبديل فئة الغلوبولين المناعي في كروموسومات الخلايا البائية المحفزة". علم المناعة الطبيعي . 4 ( 5 ): 442-51 . doi : 10.1038 / ni919 . PMID 12679812. S2CID 1652440 .  
  6. ↑ بوغوسلافسكي، إس. جيه.؛ سميث، دي. إي.؛ ميشالاك، إم. إيه.؛ ميكلسون، كيه. إي.؛ يهل، سي. أو.؛ ​​باترسون، دبليو. إل.؛ كاريكو، آر. جيه. (1 مايو 1986). "توصيف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للحمض النووي DNA-RNA وتطبيقها في الكشف المناعي عن الهجائن". مجلة أساليب علم المناعة . 89 (1): 123-130 . doi : 10.1016/0022-1759(86)90040-2 . PMID 2422282 . 
  7. 1 2 3 4 جينو، ب.أ.؛ ليم، ي.و.؛ لوت، ب.ل.؛ كورف، إ.؛ شيدان، ف. (أكتوبر 2013). "انحراف نسبة GC عند نهايتي 5' و3' للجينات البشرية يربط تكوين حلقات R بالتنظيم فوق الجيني وإنهاء النسخ" . أبحاث الجينوم . 23 (10): 1590-1600 . doi : 10.1101/gr.158436.113 . PMC 3787257. PMID 23868195 .  
  8. ↑ سكورتي-ستاثاكي، ك؛ براودفوت، ن. ج؛ غروماك، ن (24 يونيو 2011). "يعمل سيناتاكسين البشري على حلّ هجائن الحمض النووي الريبي/الحمض النووي المتكونة في مواقع توقف النسخ لتعزيز الإنهاء المعتمد على Xrn2" . الخلية الجزيئية . 42 (6): 794-805 . doi : 10.1016 / j.molcel.2011.04.026 . PMC 3145960. PMID 21700224 .  
  9. ↑ جينجاروينبون ب، وونغسوراوات ت، يناماندرا س ب، كوزنيتسوف ف أ (2015). "QmRLFS-finder: نموذج، وخادم ويب، وأداة مستقلة للتنبؤ بتسلسلات تكوين حلقات R وتحليلها" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 43 (W1): W527– W534 . doi : 10.1093/nar/gkv344 . PMC 4489302. PMID 25883153 .  
  10. ^ روسو م، دي لوكا ب، فلاتي تي، جيويوسا إس، تشيليمي جي، كابرانيكو جي (2019). "DROPA: DRIP-seq مُحسَّن لذروة التعليقات التوضيحية" . بي إم سي للمعلوماتية الحيوية . 20 (1) 414. دوى : 10.1186/s12859-019-3009-9 . بمك 6685255 . بميد 31387525 .  
  11. ↑ لين ر، تشونغ إكس، تشو واي، جينغ إتش، هو كيو، هوانغ زد، هو جيه، فو إكس دي، تشين إل، تشين جيه واي (2022). "R-loopBase: قاعدة بيانات لتكوين وتنظيم حلقات R على مستوى الجينوم" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 50 (D1): D303– D315. doi : 10.1093/nar/gkab1103 . PMC 8728142. PMID 34792163 .  
  12. ↑ ميلر، هـ. إي.، مونتيمور، د.، لي، ج.، ليفي، س. أ.، باوار، ر.، هارتونو، س.، شارما، ك.، فروست، ب.، شيدان، ف.، بيشوب، أ. (2023). "استكشاف وتحليل بيانات رسم خرائط حلقات الحمض النووي الريبوزي باستخدام RLBase" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 51 (D1): D1129– D1137 . doi : 10.1093/nar/gkac732 . PMC 9825527. PMID 36039757 .  
  13. ↑ الحاج، أ؛ فرينش، س. ل؛ باير، أ. ل؛ تولرفي، د (15 يوليو 2010). " يؤدي فقدان إنزيم توبويزوميراز الأول إلى توقف النسخ بوساطة حلقة R أثناء تخليق الحمض النووي الريبوزي" . الجينات والتطور . 24 (14): 1546-1558 . doi : 10.1101/gad.573310 . PMC 2904944. PMID 20634320 .  
  14. ↑ دوكيت، إم إل؛ هوبر، إم دي؛ مايزلز، إن (15 مارس 2007). "استهداف الجينات الأولية الغنية بالجوانين للتسبب في عدم استقرار الجينوم في أورام الغدد الليمفاوية للخلايا البائية" . أبحاث السرطان . 67 (6): 2586-94 . doi : 10.1158/0008-5472.can-06-2419 . PMID 17363577 . 
  15. ↑ هويرتاس، ب؛ أغيليرا، أ (سبتمبر 2003). "تؤدي الهجائن المتكونة أثناء النسخ من الحمض النووي: الحمض النووي الريبي إلى إعاقة استطالة النسخ وإعادة التركيب المرتبط بالنسخ" . الخلية الجزيئية . 12 (3): 711-21 . doi : 10.1016/j.molcel.2003.08.010 . PMID 14527416 . 
  16. ↑ دروليت، م؛ بي، إكس؛ ليو، إل إف (21 يناير 1994). "الالتفاف الفائق السلبي المفرط لقالب الحمض النووي أثناء استطالة النسخ في المختبر" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 269 (3): 2068-2074 . doi : 10.1016/S0021-9258(17)42136-3 . PMID 8294458 . 
  17. ↑ غوميز-غونزاليس، ب؛ أغيليرا، أ (15 مايو 2007). "يُحفَّز عمل سيتيدين دياميناز المُنشَّط بقوة بواسطة طفرات مُركَّب THO" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 104 (20): 8409-14 . Bibcode : 2007PNAS..104.8409G . doi : 10.1073/pnas.0702836104 . PMC 1895963. PMID 17488823 .  
  18. ↑ بوهيوسمكي، جيه إل؛ هولمز، جيه بي؛ وود، إس آر؛ يانغ، إم واي؛ ياسوكاوا، تي؛ رييس، إيه؛ بيلي، إل جيه؛ كلوت، تي جيه؛ جوفارت، إس؛ ويلكوكس، إس؛ ريغبي، آر إي؛ جاكسون، إيه بي؛ سبيلبرينك، جيه إن؛ غريفيث، جيه دي؛ كراوتش، آر جيه؛ جاكوبس، إتش تي؛ هولت، آي جيه (16 أبريل 2010). "وسائط تضاعف الحمض النووي للميتوكوندريا في الثدييات ثنائية في الأساس، ولكنها تحتوي على أجزاء واسعة من الحمض النووي الريبي/الحمض النووي الهجين" . مجلة البيولوجيا الجزيئية . 397 (5): 1144-1155 . doi : 10.1016/j.jmb.2010.02.029 . PMC 2857715. PMID 20184890 .  
  19. ↑ ميشو، هـ. إي.؛ غوميز-غونزاليس، ب.؛ غرزيكنيك، ب.؛ روندون، أ. ج.؛ وي، و.؛ شتاينميتز، ل.؛ أغيليرا، أ.؛ براودفوت، ن. ج. (7 يناير 2011). "إنزيم الهيليكاز Sen1 في الخميرة يحمي الجينوم من عدم الاستقرار المرتبط بالنسخ" . الخلية الجزيئية . 41 (1): 21-32 . doi : 10.1016/j.molcel.2010.12.007 . PMC 3314950. PMID 21211720 .  
  20. ↑ وهبة، ل؛ آمون، ج.د؛ كوشلاند، د؛ فويكا-روس، م (23 ديسمبر 2011). "إنزيم RNase H وعوامل متعددة لتكوين الحمض النووي الريبي تتعاون لمنع هجائن الحمض النووي الريبي: الحمض النووي من توليد عدم استقرار الجينوم" . الخلية الجزيئية . 44 (6): 978-988 . doi : 10.1016/j.molcel.2011.10.017 . PMC 3271842. PMID 22195970 .  
  21. ↑ تشان، ك؛ ستيرلينغ، ج. ف؛ روبرتس، س. أ؛ بهاجوات، أ. س؛ ريسنيك، م. أ؛ غوردينين، د. أ (2012). "تلف القواعد في الحمض النووي أحادي السلسلة يكمن وراء فرط الطفرات في الجسم الحي الناجم عن عامل بيئي واسع الانتشار" . مجلة PLOS Genetics . 8 (12) e1003149. doi : 10.1371/journal.pgen.1003149 . PMC 3521656. PMID 23271983 .