التغلغل الزراعي

التلقيح الزراعي هو أسلوب يُستخدم في علم الأحياء النباتية ، وخاصةً في مجال التقنية الحيوية النباتية، لتحفيز التعبير المؤقت للجينات في النبات ، أو في أوراق معزولة منه، أو حتى في مزارع الخلايا النباتية، بهدف إنتاج بروتين مُحدد . في هذا الأسلوب، تُحقن معلقات من بكتيريا Agrobacterium tumefaciens في ورقة نباتية إما بالحقن المباشر أو بالتلقيح الفراغي، أو تُدمج مع خلايا نباتية مُثبتة على دعامة مسامية (حزم الخلايا النباتية)، ^{[ 1 ]} حيث تنقل البكتيريا الجين المطلوب إلى الخلايا النباتية عبر نقل الحمض النووي T-DNA . تتمثل الميزة الرئيسية للتلقيح الزراعي، مقارنةً بالتحويل النباتي التقليدي ، في السرعة والسهولة، على الرغم من أن إنتاجية البروتين المُعاد تركيبه تكون أعلى وأكثر اتساقًا بشكل عام.

تتمثل الخطوة الأولى في إدخال جين مُراد إلى سلالة من بكتيريا أغروباكتيريوم توميفاسينز . بعد ذلك، تُزرع السلالة في وسط سائل ، ثم تُغسل البكتيريا الناتجة وتُعلق في محلول منظم مناسب . وللحقن، يُوضع هذا المحلول في محقنة (بدون إبرة). يُضغط طرف المحقنة على السطح السفلي للورقة مع تطبيق ضغط معاكس خفيف على الجانب الآخر منها. ثم يُحقن معلق الأغروباكتيريوم في الفراغات الهوائية داخل الورقة عبر الثغور ، أو أحيانًا عبر شق صغير في السطح السفلي للورقة.

يُعدّ التسلل الفراغي طريقة أخرى لإدخال بكتيريا الأغروبكتيريوم إلى أعماق أنسجة النبات. في هذه العملية، تُغمر أقراص الأوراق أو الأوراق أو النباتات الكاملة في كأس يحتوي على المحلول، ثم يُوضع الكأس في حجرة مفرغة من الهواء. بعد ذلك، يُطبّق الفراغ، مما يدفع الهواء خارج المسافات بين الخلايا داخل الأوراق عبر الثغور. عند تحرير الفراغ، يدفع فرق الضغط معلق بكتيريا الأغروبكتيريوم إلى داخل الأوراق عبر الثغور وصولًا إلى نسيج الميزوفيل . قد يؤدي ذلك إلى تلامس جميع خلايا الورقة تقريبًا مع البكتيريا.

بمجرد دخول بكتيريا الأغروبكتيريوم إلى الورقة، تبقى في الفراغ بين الخلايا وتنقل الجين المطلوب كجزء من الحمض النووي T-DNA المشتق من بلازميد Ti بأعداد كبيرة إلى خلايا النبات. يحدث نقل الجين عند تحفيز إشارات النبات وتكوين اتصال مباشر بين خلايا النبات والبكتيريا. تُنشئ البكتيريا آلية تُحدث ثقبًا وتنقل شريط الحمض النووي T-DNA الجديد إلى خلية النبات. ينتقل الحمض النووي T-DNA إلى نواة النبات ويبدأ بالاندماج في كروموسوم النبات. بعد ذلك، يُعبَّر عن الجين بشكل مؤقت من خلال تخليق الحمض النووي الريبوزي (RNA) من تسلسلات المحفز المناسبة في جميع الخلايا المُعدَّلة وراثيًا (دون إجراء أي اختيار للاندماج المستقر). يمكن مراقبة النبات لرصد أي تأثير محتمل على النمط الظاهري ، أو إخضاعه لظروف تجريبية، أو حصاده واستخدامه لتنقية البروتين المطلوب. يمكن معالجة العديد من أنواع النباتات باستخدام هذه الطريقة، ولكن أكثرها شيوعًا هي نيكوتيانا بنثاميانا، وأقل شيوعًا نيكوتيانا تاباكوم .

يُعدّ التعبير المؤقت في خلايا نباتية مُستزرعة إجراءً جديدًا، حصل معهد فراونهوفر IVV في ألمانيا مؤخرًا على براءة اختراع له. ^{[ 2 ]} في هذه التقنية، تُثبّت خلايا التبغ المُستزرعة في معلق (مثل: سلالات خلايا NT1 أو BY2 من نبات التبغ ) عن طريق الترشيح على دعامة مسامية لتشكيل حزمة خلايا جيدة التهوية، ثم تُحضن مع بكتيريا أغروباكتيريوم مُعاد تركيبها لفترة زمنية تسمح بنقل الحمض النووي T، قبل إعادة الترشيح لإزالة البكتيريا والسائل الزائدين. يسمح تحضين حزمة الخلايا في بيئة رطبة لفترات زمنية تصل إلى عدة أيام بالتعبير المؤقت عن البروتين. يمكن غسل البروتينات المُفرزة من حزمة الخلايا عن طريق إضافة محلول منظم ومزيد من الترشيح.

من الشائع حقن بكتيريا الأغروبكتيريوم الحاملة للجين المراد تحويله مع بكتيريا أغروبكتيريوم أخرى تحمل جينًا مثبطًا للتعبير الجيني، مثل الجين الذي يشفر بروتين p19 من فيروس تقزم الطماطم (TBSV) الممرض للنباتات، أو بروتين NSs ^{[ 3 ]} من فيروس ذبول الطماطم المرقط (TSWV). اكتُشف فيروس TBSV لأول مرة عام 1935 في الطماطم ، ويؤدي إلى توقف نمو النباتات وتشوه ثمارها. أما فيروس TSWV، فقد اكتُشف في الطماطم في أستراليا عام 1915، وكان لسنوات عديدة العضو الوحيد لما يُعرف الآن بجنس توسبوفيروس ، من عائلة بونيافيريداي . كما يُضاف الأسيتوسيرينجون عادةً إلى وسط حقن الأغروبكتيريوم لزيادة كفاءة التحويل، وبالتالي زيادة التعبير عن الجين المراد تحويله.

للدفاع عن نفسها ضد الفيروسات ومسببات الأمراض الأخرى التي تُدخل أحماضًا نووية غريبة إلى خلاياها، طورت النباتات نظامًا لكتم الجينات بعد النسخ (PTGS)، حيث تُنتَج جزيئات RNA صغيرة متداخلة من RNA مزدوج السلسلة لإنشاء مسار تحلل مُحدد التسلسل يُسكت الجينات غير الأصلية بكفاءة. ^{[ 4 ] [ 5 ]} وقد طورت العديد من الفيروسات النباتية آليات لمواجهة أنظمة PTGS النباتية عن طريق تطوير بروتينات، مثل p19 وNSs، التي تتداخل مع مسار PTGS على مستويات مختلفة. ^{[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]}

على الرغم من أنه ليس من الواضح تمامًا كيف يعمل البروتين p19 على تثبيط إسكات الحمض النووي الريبي، فقد أظهرت الدراسات أن البروتينات المعبر عنها بشكل عابر في أوراق نبات التبغ (Nicotiana benthamiana) يكون إنتاجها أعلى بما يصل إلى 50 ضعفًا عند حقنها مع البروتين p19 لفيروس TBSV. ^{[ 9 ] [ 10 ]}

أظهرت الدراسات فعالية بروتينات NSs الخاصة بفيروس TSWV وفيروسات التوسبو الأخرى في تثبيط التعبير الجيني الموضعي والجهازي ^{[ 11 ]} ، وقد تُشكل بديلاً مفيداً لبروتين p19 في الحالات التي ثبت فيها عدم فعالية الأخير. وفي دراسات أخرى، تبين أن بروتين p19 من فيروس تجعد الخرشوف المرقط له تأثير مشابه، وإن كان أضعف، لتأثير بروتين p19 الخاص بفيروس TBSV ^{[ 12 ]} . مع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن بروتين p19 يُعد عاملاً مؤثراً معروفاً في بعض أنواع النباتات (مثل التبغ البري Nicotiana tabacum pv. petit Gerard) والذي قد يُحفز استجابة فرط الحساسية .

• أغروباكتيريوم
• تعبير عابر