مجهر فلوري

📅 آخر تحديث: ١ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ١ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 14 صور
الموسوعة الحرة

مجهر فلوري رأسي (أوليمبوس BX61) مزود ببرج مكعبات مرشحات الفلورة فوق العدسات الشيئية، ومقترن بكاميرا رقمية
مبدأ عمل مجاهر الفلورة والمجاهر البؤرية

المجهر الفلوري هو مجهر ضوئي يستخدم الفلورة بدلاً من التشتت أو الانعكاس أو التوهين أو الامتصاص ، أو بالإضافة إليها ، لدراسة خصائص المواد العضوية أو غير العضوية . [ 1 ] [ 2 ] والمجهر الفلوري هو أي مجهر يستخدم الفلورة لتوليد صورة، سواء كان بسيطًا كالمجهر الفلوري السطحي أو أكثر تعقيدًا كالمجهر متحد البؤر ، الذي يستخدم التصوير المقطعي البصري للحصول على دقة أعلى لصورة الفلورة. [ 3 ]

مبدأ

تُضاء العينة بضوء ذي طول موجي محدد (أو أطوال موجية محددة) تمتصه جزيئات الفلوروفور ، مما يؤدي إلى انبعاث ضوء ذي أطوال موجية أطول (أي بلون مختلف عن الضوء الممتص). يُفصل ضوء الإضاءة عن الفلورة المنبعثة الأضعف بكثير باستخدام مرشح انبعاث طيفي. تتكون المكونات النموذجية لمجهر الفلورة من مصدر ضوئي ( مصباح زينون قوسي أو مصباح بخار الزئبق شائعان؛ أما الأنواع الأكثر تطورًا فتستخدم مصابيح LED عالية الطاقة وليزر ) ، ومرشح الإثارة ، ومرآة ثنائية اللون (أو فاصل شعاع ثنائي اللون )، ومرشح الانبعاث (انظر الشكل أدناه). تُختار المرشحات وفاصل الشعاع ثنائي اللون لتتوافق مع خصائص الإثارة والانبعاث الطيفية لجزيء الفلوروفور المستخدم في وسم العينة. [ 1 ] وبهذه الطريقة، تُصوَّر توزيعة جزيء فلوروفور واحد (لون) في كل مرة. يجب تكوين صور متعددة الألوان لأنواع مختلفة من الفلوروفورات عن طريق دمج عدة صور أحادية اللون. [ 1 ]

معظم المجاهر الفلورية المستخدمة حاليًا هي مجاهر فلورية فوقية، حيث يتم إثارة الفلوروفور والكشف عن الفلورة عبر مسار الضوء نفسه (أي من خلال العدسة الشيئية). تُستخدم هذه المجاهر على نطاق واسع في علم الأحياء، وهي الأساس لتصميمات مجاهر أكثر تطورًا، مثل المجهر متحد البؤر ومجهر الفلورة بالانعكاس الداخلي الكلي (TIRF).

المجهر الفلوري

رسم تخطيطي لمجهر فلوري

معظم مجاهر التألق، وخاصة تلك المستخدمة في علوم الحياة ، مصممة بتقنية التألق فوق السطحي الموضحة في الرسم التخطيطي. يُسلط ضوء بطول موجة الإثارة على العينة من خلال العدسة الشيئية . تُركز العدسة الشيئية نفسها المستخدمة للإثارة ضوء التألق المنبعث من العينة على الكاشف، مما يتطلب عدسة ذات فتحة عددية أعلى للحصول على دقة أعلى . وبما أن معظم ضوء الإثارة يمر عبر العينة، فإن ضوء الإثارة المنعكس فقط هو الذي يصل إلى العدسة الشيئية مع الضوء المنبعث، ولذلك توفر تقنية التألق فوق السطحي نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. يعمل فاصل الحزمة ثنائي اللون كمرشح خاص بطول الموجة، حيث يسمح بمرور ضوء التألق إلى العدسة العينية أو الكاشف، بينما يعكس أي ضوء إثارة متبقٍ عائدًا إلى المصدر.

مصادر الإضاءة

يتطلب المجهر الفلوري إضاءةً شديدةً شبه أحادية اللون، وهو ما لا تستطيع بعض مصادر الضوء الشائعة، مثل مصابيح الهالوجين، توفيره. [ 4 ] تُستخدم أربعة أنواع رئيسية من مصادر الضوء، تشمل مصابيح زينون القوسية أو مصابيح بخار الزئبق المزودة بمرشح إثارة ، والليزر ، ومصادر الطيف المتصل الفائق ، ومصابيح LED عالية الطاقة . تُستخدم الليزرات على نطاق واسع في تقنيات المجهر الفلوري الأكثر تعقيدًا، مثل المجهر متحد البؤر ومجهر الفلورة بالانعكاس الداخلي الكلي، بينما تُستخدم مصابيح الزينون ومصابيح الزئبق ومصابيح LED المزودة بمرشح إثارة ثنائي اللون بشكل شائع في مجاهر التألق الضوئي واسعة المجال. من خلال وضع مصفوفتين من العدسات المجهرية في مسار إضاءة مجهر التألق الضوئي واسع المجال، [ 5 ] يمكن تحقيق إضاءة متجانسة للغاية بمعامل تباين يتراوح بين 1 و2%.

تحضير العينة

عرض ثلاثي الأبعاد للدياتوم Corethron sp. يعرض تراكبات من أربع قنوات فلورية
(أ) الأخضر: [تألق DiOC6(3)] - يصبغ الأغشية الخلوية ويشير إلى أجسام الخلايا الأساسية. (ب) السماوي: [تألق PLL-A546] - صبغة مضادة عامة لتصوير أسطح الخلايا حقيقية النواة. (ج) الأزرق: [تألق Hoechst] - يصبغ الحمض النووي، ويحدد النوى. (د) الأحمر: [التألق الذاتي للكلوروفيل] - يكشف عن البلاستيدات الخضراء. [ 6 ]
يبدأ العرض المتحرك بتراكب جميع القنوات الفلورية المتاحة، ثم يوضح التصور عن طريق تشغيل القنوات وإيقافها.
عينة من حيوانات منوية لسمك الرنجة مصبوغة بصبغة SYBR الخضراء في خلية قياس مضاءة بضوء أزرق في مجهر فلوري. ترتبط صبغة SYBR الخضراء الموجودة في العينة بحمض DNA الخاص بالحيوانات المنوية لسمك الرنجة، وبمجرد ارتباطها، تتألق بضوء أخضر عند إضاءتها بضوء أزرق.

لكي تكون العينة مناسبة للفحص المجهري الفلوري، يجب أن تكون متألقة. توجد عدة طرق لجعل العينة متألقة؛ وتتمثل التقنيات الرئيسية في التلوين باستخدام أصباغ فلورية، أو في حالة العينات البيولوجية، التعبير عن بروتين فلوري . كما يمكن استخدام التألق الذاتي للعينة (أي التألق الذاتي ). [ 1 ] في علوم الحياة، يُعد المجهر الفلوري أداة فعالة تسمح بتلوين العينة بدقة وحساسية عاليتين للكشف عن توزيع البروتينات أو الجزيئات الأخرى ذات الأهمية. ونتيجة لذلك، توجد مجموعة متنوعة من التقنيات لتلوين العينات البيولوجية بالفلورة.

الأصباغ الفلورية البيولوجية

صُممت العديد من الأصباغ الفلورية لمجموعة واسعة من الجزيئات البيولوجية. بعض هذه الأصباغ جزيئات صغيرة فلورية بطبيعتها، ترتبط بجزيء بيولوجي محدد. من أبرز الأمثلة على ذلك أصباغ الأحماض النووية مثل DAPI و Hoechst (التي تُثار بواسطة الأشعة فوق البنفسجية) وDRAQ5 وDRAQ7 (التي تُثار بشكل مثالي بواسطة الضوء الأحمر)، والتي ترتبط جميعها بالأخدود الصغير للحمض النووي DNA ، وبالتالي تُحدد نوى الخلايا. أما الأصباغ الأخرى فهي أدوية أو سموم أو ببتيدات ترتبط ببنى خلوية محددة، وقد تم تعديلها بإضافة مؤشر فلوري. من أبرز الأمثلة على هذه الفئة من الأصباغ الفلورية الفالويدين ، الذي يُستخدم لتلوين ألياف الأكتين في خلايا الثدييات . كما يمكن تلوين الأكتين باستخدام ببتيد LifeAct المرتبط ببروتين GFP، خاصةً في الخلايا التي لا يمكن نقل الجينات إليها. [ 7 ] يمكن أيضًا ربط ببتيد جديد، يُعرف باسم ببتيد تهجين الكولاجين ، بفلوروفورات واستخدامه لتلوين ألياف الكولاجين المتغيرة . ويتم تلوين جدران الخلايا النباتية باستخدام أصباغ ترتبط بالسليلوز أو البكتين . ولا يزال البحث جاريًا عن مجسات فلورية ذات خصوصية عالية تسمح أيضًا بالتصوير الحي للخلايا النباتية. [ 8 ]

هناك العديد من الجزيئات الفلورية التي تسمى الفلوروفورات أو الفلوركرومات مثل الفلورسين ، أو Alexa Fluors ، أو DyLight 488 ، والتي يمكن ربطها كيميائيًا بجزيء مختلف يرتبط بالهدف المطلوب داخل العينة.

التألق المناعي

التألق المناعي تقنية تستخدم الارتباط عالي التخصص بين الأجسام المضادة ومستضداتها لتحديد بروتينات أو جزيئات معينة داخل الخلية. تُعالج العينة بجسم مضاد أولي متخصص بالجزيء المراد دراسته. يمكن ربط جزيء فلوري مباشرةً بالجسم المضاد الأولي. أو يمكن استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط بجزيء فلوري، يرتبط بشكل خاص بالجسم المضاد الأولي. على سبيل المثال، يمكن استخدام جسم مضاد أولي مُستخلص من فأر يتعرف على التوبولين، مُقترنًا بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر مُشتق بجزيء فلوري، لتحديد الأنيبيبات الدقيقة في الخلية.

البروتينات الفلورية

يُتيح الفهم الحديث لعلم الوراثة والتقنيات المتاحة لتعديل الحمض النووي للعلماء تعديل البروتينات وراثيًا لتضمين بروتين فلوري مُؤشِّر. في العينات البيولوجية، يسمح هذا للعلماء بجعل بروتين مُحدد مُشعًّا بشكل مباشر، ما يُتيح تتبع موقعه بدقة، حتى داخل الخلايا الحية.

القيود

تفقد الفلوروفورات قدرتها على التألق عند تعرضها للضوء في عملية تُسمى التلاشي الضوئي . يحدث التلاشي الضوئي نتيجة تراكم الضرر الكيميائي على جزيئات الفلورسنت بفعل الإلكترونات المُثارة أثناء التألق. يُمكن أن يُقلل التلاشي الضوئي بشكل كبير من مدة إمكانية مُراقبة العينة باستخدام المجهر الفلوري. توجد عدة تقنيات للحد من التلاشي الضوئي، مثل استخدام فلوروفورات أكثر مقاومة، أو تقليل الإضاءة، أو استخدام مواد كيميائية واقية من الضوء .

أتاح استخدام المجهر الفلوري مع البروتينات المُبلِّغة الفلورية تحليل الخلايا الحية، إلا أن هذه الخلايا عُرضة للتسمم الضوئي، لا سيما مع الضوء ذي الطول الموجي القصير. علاوة على ذلك، تميل الجزيئات الفلورية إلى توليد أنواع كيميائية تفاعلية عند تعرضها للضوء، مما يزيد من تأثير التسمم الضوئي.

بخلاف تقنيات المجهر الضوئي النافذ والمنعكس، لا يسمح المجهر الفلوري إلا بملاحظة التراكيب المحددة التي تم وسمها بالفلورة. فعلى سبيل المثال، لا تكشف ملاحظة عينة نسيجية مُحضّرة بصبغة DNA فلورية باستخدام المجهر الفلوري إلا عن تنظيم الحمض النووي داخل الخلايا، ولا تكشف أي شيء آخر عن مورفولوجيا الخلايا.

قد تُسهم التقنيات الحسابية التي تقترح تقدير الإشارة الفلورية من صور غير فلورية (مثل صور المجال المضيء) في الحد من هذه المخاوف. [ 9 ] وبشكل عام، تتضمن هذه الأساليب تدريب شبكة عصبية تلافيفية عميقة على خلايا مصبوغة، ثم تقدير الفلورة على عينات غير مصبوغة. وبالتالي، من خلال فصل الخلايا قيد الدراسة عن الخلايا المستخدمة في تدريب الشبكة، يُمكن إجراء التصوير بشكل أسرع وبسمية ضوئية أقل.

تقنيات الانعراج الفرعي

تُحدّ الطبيعة الموجية للضوء من حجم البقعة التي يمكن تركيز الضوء عليها بسبب حدّ الانعراج . وقد وصف إرنست آبي هذا القيد في القرن التاسع عشر، حيث "يُحدّ من دقة المجهر الضوئي إلى ما يقارب نصف الطول الموجي للضوء المستخدم". ويُعدّ المجهر الفلوري أساسيًا للعديد من التقنيات التي تهدف إلى تجاوز هذا الحدّ من خلال تكوينات بصرية متخصصة.

شهد القرن العشرون العديد من التحسينات في تقنيات المجهر، مما أدى إلى زيادة الدقة والتباين إلى حد ما. مع ذلك، لم تتجاوز هذه التحسينات حد الانعراج. في عام ١٩٧٨، طُورت أولى الأفكار النظرية لتجاوز هذا الحد باستخدام مجهر 4π كمجهر مسح ليزري متحد البؤر، حيث يُركز الضوء بشكل مثالي من جميع الجوانب على بؤرة مشتركة تُستخدم لمسح الجسم من خلال الإثارة والكشف نقطة بنقطة. [ ١٠ ] إلا أن أول تجربة عملية لمجهر 4π أُجريت في عام ١٩٩٤. [ ١١ ] يُعظم مجهر 4π عدد اتجاهات التركيز المتاحة باستخدام عدستين موضوعيتين متقابلتين، أو باستخدام مجهر الإثارة ثنائي الفوتون الذي يعتمد على الضوء المُزاح نحو الأحمر والإثارة متعددة الفوتونات.

يجمع المجهر الترابطي المتكامل بين مجهر الفلورة ومجهر إلكتروني. وهذا يسمح بتصوير البنية الدقيقة والمعلومات السياقية باستخدام المجهر الإلكتروني، مع استخدام بيانات مجهر الفلورة كأداة للوسم. [ 12 ]

كانت تقنية المجهر STED ، التي طُرحت عام ١٩٩٤، أول تقنية تحقق دقة فائقة تتجاوز حد الانعراج. تعتمد هذه الطريقة، وجميع التقنيات اللاحقة لمفهوم RESOLFT، على تفاعل غير خطي قوي بين الضوء والجزيئات المتألقة. تُدفع الجزيئات بقوة بين حالات جزيئية مميزة في كل موقع محدد، بحيث ينبعث الضوء في النهاية من جزء صغير فقط من الفضاء، مما يؤدي إلى زيادة الدقة.

في تسعينيات القرن الماضي، طُوِّرت طريقة أخرى للتصوير المجهري فائق الدقة تعتمد على المجهر ذي المجال الواسع. وقد تحقق تحسين كبير في دقة تحديد حجم البنى النانوية الخلوية المصبوغة بعلامة فلورية من خلال تطوير مجهر التموضع SPDM والإضاءة الليزرية المهيكلة (الإضاءة المعدلة مكانيًا، SMI). [ 13 ] أدى الجمع بين مبدأ SPDM وSMI إلى تطوير مجهر Vertico SMI . [ 14 ] [ 15 ] يمكن الكشف عن الجزيئات المفردة للأصباغ الفلورية الوامضة العادية ، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، باستخدام تطوير إضافي لتقنية SPDM، وهي تقنية SPDMphymod، التي تُمكّن من الكشف عن نوعين مختلفين من الجزيئات الفلورية وعدّهما على المستوى الجزيئي (تُعرف هذه التقنية باسم مجهر التموضع ثنائي اللون أو 2CLM). [ 16 ]

بدلاً من ذلك، يمكن لتقنية المجهر الضوئي الموضعي المُنشَّط ضوئيًا أن تحقق نتائج مماثلة بالاعتماد على وميض أو تبديل جزيئات منفردة، حيث تكون نسبة الجزيئات المتألقة ضئيلة للغاية في كل لحظة. تتوافق هذه الاستجابة العشوائية للجزيئات للضوء المُسلط مع تفاعل غير خطي للغاية، مما يؤدي إلى دقة فائقة تصل إلى حد الانعراج.

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 3 4 Spring KR, Davidson MW. "مقدمة في المجهر الفلوري" . Nikon MicroscopyU . تم الاطلاع عليه بتاريخ 24 أكتوبر 2024 .
  2. ↑ "المجهر الفلوري" . المجاهر - تساعد العلماء على استكشاف العوالم الخفية . مؤسسة نوبل . تم الاطلاع عليه بتاريخ 28 سبتمبر 2008 .
  3. ↑ خوان كارلوس ستوكرت، ألفونسو بلازكيز كاسترو (2017). المجهر الفلوري في علوم الحياة . دار بنثام للعلوم. رقم ISBN 978-1-68108-519-7أُرشف من الأصل في 14 مايو 2019. تم الاطلاع عليه في 17 ديسمبر 2017 .
  4. ↑ هوانغ ب (مارس 2010). " المجهر الفلوري فائق الدقة" . المراجعة السنوية للكيمياء الحيوية . 78 : 993-1016 . doi : 10.1146/annurev.biochem.77.061906.092014 . PMC 2835776. PMID 19489737 .  
  5. ↑ FAW Coumans؛ E. van der Pol؛ LWMM Terstappen (2012). "ملف إضاءة مسطح في مجهر التألق فوق البنفسجي باستخدام مصفوفات عدسات دقيقة مزدوجة" . قياس التدفق الخلوي، الجزء أ . 81 (4): 324-331 . doi : 10.1002/cyto.a.22029 . PMID 22392641. S2CID 13812696 .  
  6. ↑ كولين، إس؛ كويلو، إل بي؛ سوناغاوا، إس؛ بولر، سي؛ كارسنتي، إي؛ بورك، بي؛ بيبركوك، آر؛ دي فارغاس، سي (2017). "التصوير الكمي ثلاثي الأبعاد لبيولوجيا الخلية وبيئة حقيقيات النوى الميكروبية البيئية" . eLife . 6 : e26066. doi : 10.7554/eLife.26066.002 . PMC 5663481. PMID 29087936 .  تم نسخ المادة من هذا المصدر ، وهو متاح بموجب ترخيص Creative Commons Attribution 4.0 International License .
  7. ↑ ريدل، جوليا؛ كريفينا، ألفارو هـ؛ كيسنبروك، كاي؛ يو، جيري هاوتشن؛ نوكيرشن، دوروثي؛ بيستا، ميشال؛ برادكي، فرانك؛ جين، ديتر؛ هولاك، تاد أ؛ ويرب، زينا؛ سيكست، مايكل؛ ويدليش-سولدنر، رولاند (2008). "Lifeact: علامة متعددة الاستخدامات لتصوير F-actin" . Nature Methods . 5 (7): 605–607 . doi : 10.1038/nmeth.1220 . ISSN 1548-7091 . PMC 2814344. PMID 18536722 .   
  8. ↑ بيدهندي، أ. ج.؛ شبلي، ي.؛ جيتمان، أ. (مايو 2020). "التصوير الفلوري للسليلوز والبكتين في جدار الخلية النباتية الأولية". مجلة المجهر . 278 (3): 164-181 . doi : 10.1111/jmi.12895 . PMID 32270489. S2CID 215619998 .  
  9. ↑ كاندل، ميخائيل إي.؛ هي، يوتشن ر.؛ لي، يونغ جاي؛ تشين، تايلور هسوان-يو؛ سوليفان، كاثرين ميشيل؛ أيدين، أونور؛ سيف، م. طاهر أ.؛ كونغ، هيونجون؛ صبح، ناهيل؛ بوبيسكو، غابرييل (2020). "التصوير الطوري مع الخصوصية الحسابية (PICS) لقياس تغيرات الكتلة الجافة في الحجيرات دون الخلوية" . Nature Communications . 11 (1): 6256. arXiv : 2002.08361 . Bibcode : 2020NatCo..11.6256K . doi : 10.1038/s41467-020-20062- x . PMC 7721808. PMID 33288761 . S2CID 212725023 .   
  10. ↑ كريمر، سي؛ كريمر، تي (1978). "اعتبارات حول مجهر المسح الليزري ذي الدقة العالية وعمق المجال" (ملف PDF) . مجلة ميكروسكوبيكا أكتا . 81 (1): 31-44 . PMID 713859. مؤرشف من الأصل (ملف PDF) في 4 مارس 2016. تم الاطلاع عليه في 12 أغسطس 2013 . 
  11. ↑ إس دبليو هيل، إي إتش كيه ستيلزر، إس ليندك، سي كريمر؛ ستيلزر؛ ليندك؛ كريمر (1994). "المجهر متحد البؤر بفتحة كشف مُحسّنة: المجهر متحد البؤر من النوع B 4Pi". رسائل البصريات . 19 (3): 222-224 . رمز Bibcode : 1994OptL...19..222H . CiteSeerX 10.1.1.501.598 . doi : 10.1364/OL.19.000222 . PMID 19829598 .  {{cite journal}}: صيانة CS1: أسماء متعددة: قائمة المؤلفين ( رابط )
  12. ↑ بارلي، كايتلين فان. "المجهر الترابطي: فتح عوالم من المعلومات باستخدام التألق" . تم الاطلاع عليه بتاريخ 16 فبراير 2017 .
  13. ↑ هاوسمان، مايكل؛ شنايدر، برنارد؛ برادل، يواكيم؛ كريمر، كريستوف ج. (1997)، "مجهر المسافة عالي الدقة للهياكل النانوية ثلاثية الأبعاد بواسطة مجهر فلوري ذي إثارة معدلة مكانيًا" (ملف PDF) ، في بيجيو، إيرفينغ ج؛ شناكنبرغر، هربرت؛ سلافيك، يان؛ وآخرون (محررون)، الخزعات البصرية والتقنيات المجهرية II ، المجلد 3197، ص 217، doi : 10.1117/12.297969 ، S2CID 49339042 ، مؤرشف من الأصل (ملف PDF) في 4 مارس 2016 ، تم استرجاعه في 12 أغسطس 2013    
  14. ↑ ريمان، ج؛ بادلي، د؛ غونكل، م؛ ليمر، ب؛ ستادتر، و؛ جيغو، ت؛ ريب، ك؛ كريمر، س؛ بيرك، يو (2008). "تحليل بنيوي عالي الدقة للمجمعات دون النووية في الخلايا الثابتة والحية باستخدام مجهر الإضاءة المعدلة مكانيًا (SMI)" . أبحاث الكروموسومات . 16 (3): 367-382 . doi : 10.1007/s10577-008-1238-2 . PMID 18461478. S2CID 22811346 .  
  15. ↑ بادلي، د؛ باترام، س؛ ويلاند، ي؛ كريمر، س؛ بيرك، يو جيه (2003). "تحليل البنية النانوية باستخدام مجهر الإضاءة المعدلة مكانيًا" ( ملف PDF) . بروتوكولات الطبيعة . 2 (10): 2640-2646 . doi : 10.1038/nprot.2007.399 . PMID 17948007. S2CID 22042676 .  
  16. ↑ غونكل، م؛ إردل، ف؛ ريب، ك؛ ليمر، ب؛ كوفمان، ر؛ هورمان، س؛ أمبرغر، ر؛ كريمر، س (2009). "مجهر تحديد الموقع ثنائي اللون للهياكل النانوية الخلوية" ( ملف PDF) . مجلة التكنولوجيا الحيوية . 4 (6): 927-938 . doi : 10.1002/biot.200900005 . PMID 19548231. S2CID 18162278. مؤرشف من الأصل (ملف PDF) في 4 مارس 2016. تم الاسترجاع في 12 أغسطس 2013 .