المجهر متحد البؤر

يُستخدم المجهر متحد البؤر (CLSM) سريريًا في تقييم أمراض العيون المختلفة، وهو مفيد بشكل خاص في تصوير وتحليل وتحديد كمية الخلايا البطانية للقرنية . [ ^{11 ] كما} يُستخدم لتحديد موقع وجود العناصر الفطرية الخيطية في سدى القرنية في حالات التهاب القرنية الفطري ، مما يُتيح التشخيص السريع وبالتالي البدء المبكر بالعلاج النهائي. وتُظهر الأبحاث في تقنيات CLSM لإجراءات التنظير الداخلي ( التنظير الداخلي المجهري ) نتائج واعدة. ^{[ 12 ]} في صناعة الأدوية، يُوصى بمتابعة عملية تصنيع الأشكال الصيدلانية ذات الأغشية الرقيقة، للتحكم في جودة وتجانس توزيع الدواء. ^{[ 13 ]} يُستخدم المجهر متحد البؤر أيضًا لدراسة الأغشية الحيوية - وهي هياكل مسامية معقدة تُعد الموطن المفضل للكائنات الحية الدقيقة. ولا يُمكن فهم بعض الوظائف الزمنية والمكانية للأغشية الحيوية إلا من خلال دراسة بنيتها على المستويين الميكروي والميزوي. تُعد دراسة المستوى الميكروسكوبي ضرورية للكشف عن نشاط وتنظيم الكائنات الحية الدقيقة المفردة. ^{[ 14 ]}

تُستخدم تقنية CLSM كآلية لاسترجاع البيانات في بعض أنظمة تخزين البيانات البصرية ثلاثية الأبعاد ، وقد ساعدت في تحديد عمر بردية المجدلية .

يستخدم نظام IRENE المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي واستعادة التسجيلات الصوتية التاريخية التالفة. [ ^{15 ] تتلف} أسطوانات الفونوغراف الشمعية بطبيعتها نتيجة احتكاكها بالإبرة عند إعادة تشغيلها بالطريقة المعتادة؛ ^{[ 16 ]} بينما لا يتطلب المجهر أي تلامس، وغالبًا ما يوفر جودة صوت أفضل من التشغيل بالإبرة. ^{[ 17 ]}

تُستخدم المجاهر الليزرية الماسحة متحدة البؤر في توصيف سطح المواد ذات البنية المجهرية، مثل رقائق السيليكون المستخدمة في إنتاج الخلايا الشمسية . خلال المراحل الأولى من المعالجة، تُحفر الرقائق كيميائيًا باستخدام مركبات حمضية أو قلوية، مما يُكسب سطحها نسيجًا مميزًا. ثم يُستخدم المجهر الليزري متحد البؤر لمراقبة حالة السطح الناتج بدقة تصل إلى الميكرومتر. كما يُمكن استخدام هذا المجهر لتحليل سُمك وارتفاع طبقات التمعدن المطبوعة على سطح الخلايا الشمسية.

تُشكل دالة انتشار النقطة للثقب شكلًا بيضاويًا، طوله أضعاف عرضه. هذا يُحد من الدقة المحورية للمجهر. إحدى تقنيات التغلب على هذه المشكلة هي مجهر 4π، حيث يُسمح للضوء الساقط أو المنبعث بالتداخل من أعلى وأسفل العينة لتقليل حجم الشكل البيضاوي. تقنية بديلة هي مجهر ثيتا البؤري . في هذه التقنية، يكون مخروط الضوء الساقط ومخروط الضوء المُكتشف بزاوية مع بعضهما (أفضل النتائج عندما يكونان متعامدين). يُعطي تقاطع دالتي انتشار النقطة حجمًا فعالًا أصغر بكثير للعينة. من هذا تطور مجهر الإضاءة أحادي المستوى . بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام عملية إزالة التشويش باستخدام دالة انتشار نقطة مُستمدة تجريبيًا لإزالة الضوء غير البؤري، مما يُحسّن التباين في كل من المستويين المحوري والجانبي.

توجد تقنيات مجهرية بؤرية متقدمة تحقق دقةً أعلى من حد الانعراج، مثل مجهر استنزاف الانبعاث المحفز (STED). إلى جانب هذه التقنية، تتوفر مجموعة واسعة من تقنيات التصوير فائق الدقة الأخرى (غير البؤرية)، مثل PALM و(d)STORM وSIM وغيرها. لكل منها مزاياها الخاصة، كسهولة الاستخدام، والدقة، والحاجة إلى معدات خاصة، أو محاليل منظمة، أو مواد فلورية.

لتصوير العينات في درجات حرارة منخفضة، استُخدم نهجان رئيسيان، كلاهما يعتمد على بنية المجهر متحد البؤر الماسح بالليزر . يتمثل أحد النهجين في استخدام مبرد تدفق مستمر : حيث تكون العينة فقط في درجة حرارة منخفضة ويتم توجيهها بصريًا من خلال نافذة شفافة. ^{[ 18 ]} أما النهج الآخر الممكن فهو وضع جزء من البصريات (وخاصة عدسة المجهر) في وعاء تبريد عميق . ^{[ 19 ]} يضمن هذا النهج الثاني، على الرغم من كونه أكثر تعقيدًا، استقرارًا ميكانيكيًا أفضل ويتجنب الخسائر الناتجة عن النافذة.

لدراسة التفاعلات الجزيئية باستخدام المجهر الليزري الماسح متحد البؤر، يمكن استخدام نقل طاقة رنين فورستر (FRET) للتأكد من أن بروتينين يقعان على مسافة معينة من بعضهما البعض.

في عام 1940، طوّر هانز غولدمان، طبيب العيون في برن بسويسرا، نظام المصباح الشقي لتوثيق فحوصات العين. ^{[ 20 ]} ويعتبر بعض المؤلفين اللاحقين هذا النظام أول نظام بصري متحد البؤر. ^{[ 21 ] [ 22 ]}

في عام 1943، نشر زيون كوانا نظامًا متحد البؤر. ^{[ 23 ] [ 21 ]}

في عام 1951، وصف هيروتو ناورا، وهو زميل لكوانا، مجهرًا متحد البؤر في مجلة ساينس لقياس الطيف الضوئي . ^{[ 24 ]}

قام مارفن مينسكي ببناء أول مجهر مسح ضوئي متحد البؤر عام 1955، وسُجّلت براءة اختراعه عام 1957. وكان يتم مسح نقطة الإضاءة في المستوى البؤري بتحريك المنصة. لم يُنشر أي بحث علمي عنه، ولم تُحفظ أي صور مُلتقطة به. ^{[ 2 ] [ 25 ]}

في ستينيات القرن العشرين، طوّر التشيكوسلوفاكي موجيمير بيتران، من كلية الطب بجامعة تشارلز في بلزن، المجهر الماسح الترادفي، وهو أول مجهر متحد البؤر يُسوّق تجاريًا. وقد باعته شركة صغيرة في تشيكوسلوفاكيا، وفي الولايات المتحدة الأمريكية شركة تراكور-نورثرن (التي أصبحت لاحقًا نوران)، وكان يستخدم قرص نيبكو دوارًا لتوليد فتحات دقيقة متعددة للإثارة والانبعاث. ^{[ 22 ] [ 26 ]}

قُدِّم طلب براءة الاختراع التشيكوسلوفاكية عام 1966 من قِبَل بيتران وزميله التشيكوسلوفاكي ميلان هادرافسكي. ونُشِرَ أول بحث علمي يتضمن بيانات وصورًا مُولَّدة باستخدام هذا المجهر في مجلة ساينس عام 1967، من تأليف إم. ديفيد إيجر من جامعة ييل وبيتران. ^{[ 27 ]} وذُكِرَ في هامش هذا البحث أن بيتران صمَّم المجهر وأشرف على بنائه، وأنه كان، جزئيًا، "باحثًا مشاركًا" في جامعة ييل. وفي منشور ثانٍ صدر عام 1968، وُصِفَت النظرية والتفاصيل التقنية للجهاز، وكان هادرافسكي وروبرت غالامبوس ، رئيس المجموعة في جامعة ييل، من بين المؤلفين الإضافيين. ^{[ 28 ]} وفي عام 1970، مُنِحَت براءة الاختراع الأمريكية، والتي قُدِّمَ طلبها عام 1967. ^{[ 29 ]}

في عامي 1969 و1971، نشر كلٌ من إم. ديفيد إيجر وبول دافيدوفيتس من جامعة ييل ورقتين بحثيتين تصفان أول مجهر مسح ليزري متحد البؤر. ^{[ 30 ] [ 31 ]} كان هذا المجهر ماسحًا نقطيًا، أي أنه يُولّد بقعة إضاءة واحدة فقط. استخدم المجهر تقنية الإضاءة الانعكاسية لمراقبة الأنسجة العصبية. كان  ليزر هيليوم-نيون بقوة 5 ميلي واط  وطول موجي 633 نانومتر يُعكس بواسطة مرآة شبه شفافة باتجاه العدسة الشيئية. كانت العدسة الشيئية عدسة بسيطة ببعد بؤري 8.5  ملم. على عكس جميع الأنظمة السابقة ومعظم الأنظمة اللاحقة، كان يتم مسح العينة بتحريك هذه العدسة (المسح الشيئي)، مما يؤدي إلى تحريك نقطة التركيز. يعود الضوء المنعكس إلى المرآة شبه الشفافة، بينما يُركّز الجزء النافذ بواسطة عدسة أخرى على فتحة الكشف التي وُضع خلفها أنبوب مضاعف ضوئي. تمت معاينة الإشارة بواسطة أنبوب أشعة الكاثود لجهاز راسم الإشارة، حيث تحرك شعاع الكاثود بالتزامن مع العدسة الشيئية. وسمح جهاز خاص بالتقاط صور بولارويد ، عُرضت ثلاث منها في منشور عام 1971.

يتناول المؤلفون في هذا البحث استخدام الأصباغ الفلورية في الدراسات الحيوية . ويشيرون إلى براءة اختراع مينسكي، ويشكرون ستيف باير، الذي كان آنذاك طالب دكتوراه في كلية ألبرت أينشتاين للطب في مدينة نيويورك ، حيث طور مجهرًا خطيًا ماسحًا متحد البؤر، ^{[ 32 ]} لاقتراحه استخدام الليزر مع "مجهر مينسكي"، كما يشكرون غالامبوس وهادرافسكي وبيتران على المناقشات التي أدت إلى تطوير مجهرهم. ويكمن الدافع وراء تطويرهم في أن جزءًا ضئيلاً جدًا من ضوء الإضاءة في المجهر الماسح الترادفي (10⁻⁷) ^يشارك في تكوين الصورة في العدسة العينية. وبالتالي، لم تكن جودة الصورة كافية لمعظم الدراسات البيولوجية. ^{[ 21 ] [ 33 ]}

في عام 1977، نشر كولين جيه آر شيبارد وأمارجيوتي تشودري ، من جامعة أكسفورد بالمملكة المتحدة، تحليلاً نظرياً للمجاهر البؤرية والمجاهر الماسحة بالليزر. ^{[ 34 ]} ويُرجح أن يكون هذا أول منشور يستخدم مصطلح "المجهر البؤري". ^{[ 21 ] [ 33 ]}

في عام 1978، نشر الأخوان كريستوف كريمر وتوماس كريمر تصميمًا لمجهر مسح ليزري متحد البؤر يستخدم الإثارة الفلورية مع التركيز التلقائي الإلكتروني. كما اقترحا إضاءة نقطية بالليزر باستخدام " هولوغرام نقطي 4π ". ^{[ 33 ] [ 35 ]} جمع تصميم المجهر الليزري متحد البؤر هذا لأول مرة بين طريقة المسح الليزري والكشف ثلاثي الأبعاد عن الأجسام البيولوجية الموسومة بعلامات فلورية .

في عامي 1978 و1980، وصف فريق أكسفورد بقيادة كولين شيبارد وتوني ويلسون مجهرًا متحد البؤر مزودًا بإضاءة ليزرية فوقية، ومسح ضوئي للمنصة، وأنابيب مضاعفة ضوئية ككواشف. ويمكن للمنصة أن تتحرك على طول المحور البصري (المحور z)، مما يسمح بإجراء مقاطع بصرية متسلسلة. ^{[ 33 ]}

في عام ١٩٧٩، أثبت فريد براكنهوف وزملاؤه أن المزايا النظرية للتصوير المقطعي البصري وتحسين الدقة قابلة للتحقيق عمليًا. وفي عام ١٩٨٥، كانت هذه المجموعة أول من نشر صورًا مقنعة التُقطت باستخدام مجهر متحد البؤر، والتي استطاعت الإجابة عن تساؤلات بيولوجية. ^{[ ٣٦ ]} بعد ذلك بوقت قصير، بدأت العديد من المجموعات البحثية الأخرى باستخدام المجهر متحد البؤر للإجابة عن تساؤلات علمية ظلت غامضة حتى ذلك الحين بسبب القيود التقنية.

في عام ١٩٨٣، نشر آي جيه كوكس وسي شيبارد من جامعة أكسفورد أول عملٍ يتم فيه التحكم في مجهر متحد البؤر بواسطة الحاسوب. وقدّمت شركة أكسفورد للإلكترونيات الضوئية (بعد عدة عمليات استحواذ من قبل شركة بيوراد) أول مجهر مسح ليزري تجاري، وهو الماسح الضوئي SOM-25، ابتداءً من عام ١٩٨٢. وقد استند تصميمه إلى تصميم مجموعة أكسفورد. ^{[ ٢٢ ] [ ٣٧ ]}

في منتصف ثمانينيات القرن العشرين، قام ويليام برادشو آموس وجون غراهام وايت وزملاؤهما العاملون في مختبر البيولوجيا الجزيئية في كامبريدج ببناء أول مجهر مسح ضوئي بشعاع متحد البؤر. ^{[ 38 ] [ 39 ]} لم تكن المنصة التي تحمل العينة متحركة، بل كانت بقعة الإضاءة هي المتحركة، مما أتاح التقاط الصور بسرعة أكبر: أربع صور في الثانية، كل منها مكونة من 512 خطًا. وبفضل مسار شعاع ضوئي يتراوح طوله بين متر ومترين، سمحت الصور الوسيطة المكبرة بشكل كبير باستخدام غشاء قزحي تقليدي كـ"ثقب صغير" بقطر يبلغ حوالي 1  مم. التُقطت أولى الصور المجهرية بتعريض طويل الأمد على فيلم قبل إضافة كاميرا رقمية. وقد سمح تحسين لاحق بتكبير العينة لأول مرة. لم تكن شركات زايس ولايتز وكامبريدج إنسترومنتس مهتمة بالإنتاج التجاري. ^{[ 40 ]} في النهاية، رعى مجلس البحوث الطبية (MRC) تطوير نموذج أولي. استحوذت شركة بيو-راد على التصميم ، وأدخلت عليه تعديلات للتحكم الحاسوبي، ثم سوّقته تجاريًا تحت اسم "MRC 500". كان جهاز MRC 600 اللاحق هو الأساس لتطوير أول مجهر فلوري ثنائي الفوتون تم تطويره عام 1990 في جامعة كورنيل . ^{[ 36 ]}

أدت التطورات التي شهدها المعهد الملكي للتكنولوجيا (KTH) في ستوكهولم في نفس الفترة تقريبًا إلى إنتاج مجهر ليزري ماسح ضوئي متحد البؤر (CLSM) تجاري، وزعته شركة ساراسترو السويدية . ^{[ 41 ]} استحوذت شركة موليكولار دايناميكس على المشروع عام 1990، ^{[ 42 ]} ولكن توقف إنتاج المجهر لاحقًا. في ألمانيا، طورت شركة هايدلبرغ إنسترومنتس ، التي تأسست عام 1984، مجهرًا ليزريًا ماسحًا ضوئيًا متحد البؤر، كان مخصصًا في البداية للتطبيقات الصناعية وليس البيولوجية. استحوذت شركة لايكا ليزرتكنيك على هذا الجهاز عام 1990. كانت شركة زايس تمتلك بالفعل مجهرًا ليزريًا ماسحًا ضوئيًا غير متحد البؤر ذي بقعة متحركة في السوق، والذي تم تطويره إلى مجهر متحد البؤر. أشار تقرير صدر عام 1990، ^{[ 43 ]} إلى بعض الشركات المصنعة للمجاهر متحدة البؤر: ساراسترو، وتيكنيكال إنسترومنت، وميريديان إنسترومنتس، وبيو-راد، ولايكا، وتراكور-نورثرن، وزايس. ^{[ 36 ]}

في عام ١٩٨٩، اخترع فريتز كارل بريكشات ، مع ابنه إيكهارد بريكشات، مجهر الليزر الثنائي الماسح لتحليل حجم الجسيمات. ^{[ ٤٤ ] [ ٤٥ ]} وأسسا معًا شركة لاسينتك لتسويقه. في عام ٢٠٠١، استحوذت شركة ميتلر توليدو على لاسينتك . ^{[ ٤٦ ]} تُستخدم هذه التقنية بشكل رئيسي في صناعة الأدوية لتوفير تحكم مباشر في عملية التبلور ضمن أنظمة التنقية الكبيرة.

في أجهزة المجهر متحد البؤر القياسية، تُستخدم الفتحة الثانية أو "فتحة الإخراج" لتصفية الضوء المنبعث أو المتناثر. تقليديًا، تُعد هذه الفتحة عنصرًا سلبيًا يحجب الضوء لتصفية الإضاءة بصريًا. مع ذلك، سعت التصاميم الحديثة إلى تنفيذ هذه التصفية رقميًا.

استُبدلت الثقوب الدقيقة السلبية في الأساليب الحديثة بعنصر كاشف مركب. وعادةً، بعد المعالجة الرقمية، يؤدي هذا الأسلوب إلى تحسين الدقة وزيادة كمية الفوتونات، حيث يمكن أن تقترب دقة الكشف من دقة الثقوب الدقيقة المتناهية الصغر. ^{[ 47 ]}

وقد حاول باحثون آخرون إعادة تركيز الضوء رقميًا من مصدر إثارة نقطي باستخدام الشبكات العصبية الالتفافية العميقة. ^{[ 48 ]}