تسلسل الخلايا المفردة

📅 آخر تحديث: ٣١ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣١ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 4 صور
الموسوعة الحرة

يُحلل تسلسل الحمض النووي للخلايا المفردة معلومات تسلسل الأحماض النووية من خلايا فردية باستخدام تقنيات تسلسل الجيل التالي المُحسّنة ، مما يوفر دقة أعلى في رصد الاختلافات الخلوية وفهمًا أفضل لوظيفة الخلية الفردية في سياق بيئتها الدقيقة. [ 1 ] على سبيل المثال، في السرطان، يُمكن أن يُوفر تسلسل الحمض النووي للخلايا الفردية معلومات حول الطفرات التي تحملها مجموعات صغيرة من الخلايا. وفي النمو، يُمكن أن يُوفر تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي تُعبر عنه الخلايا الفردية نظرة ثاقبة على وجود وسلوك أنواع الخلايا المختلفة. [ 2 ] في الأنظمة الميكروبية، قد تبدو مجموعة من نفس النوع متطابقة وراثيًا. ومع ذلك، يُمكن أن يكشف تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو التعديلات فوق الجينية للخلايا المفردة عن التباين بين الخلايا، مما قد يُساعد المجموعات على التكيف بسرعة للبقاء على قيد الحياة في البيئات المتغيرة. [ 3 ]

خلفية

تحتوي الخلية البشرية النموذجية على حوالي 2 × 3.3 مليار زوج قاعدي من الحمض النووي DNA و600 مليون قاعدة من الحمض النووي الريبوزي الرسول mRNA. عادةً، يُستخدم مزيج من ملايين الخلايا في تسلسل الحمض النووي DNA أو RNA باستخدام الطرق التقليدية مثل تسلسل سانجر أو تقنيات التسلسل من الجيل التالي . من خلال التسلسل العميق للحمض النووي DNA وRNA من خلية واحدة، يمكن دراسة وظائف الخلية بشكل موسع. [ 1 ] وكما هو الحال في تجارب التسلسل من الجيل التالي، تتضمن بروتوكولات تسلسل الخلية الواحدة الخطوات التالية: عزل خلية واحدة، استخلاص الحمض النووي وتضخيمه ، تحضير مكتبة التسلسل ، التسلسل، وتحليل البيانات باستخدام المعلوماتية الحيوية . يُعدّ إجراء تسلسل الخلية الواحدة أكثر صعوبة من التسلسل من الخلايا بكميات كبيرة. فالكمية الضئيلة من المواد الأولية من خلية واحدة تجعل التحلل وفقدان العينة والتلوث تؤثر بشكل كبير على جودة بيانات التسلسل. بالإضافة إلى ذلك، ونظرًا لمستوى البيكوجرام لعدد الأحماض النووية المستخدمة، [ 4 ] غالبًا ما تكون هناك حاجة إلى تضخيم كبير أثناء تحضير العينة لتسلسل الخلية الواحدة، مما يؤدي إلى تغطية غير متساوية وضوضاء وتحديد كمي غير دقيق لبيانات التسلسل.

بفضل التحسينات التقنية الحديثة، أصبح تسلسل الحمض النووي للخلايا المفردة أداةً واعدةً لمعالجة مجموعة من المشكلات التي تبدو مستعصية. فعلى سبيل المثال، يمكن من خلال تسلسل الحمض النووي للخلايا المفردة توضيح العديد من الجوانب، مثل العينات غير المتجانسة، وأنواع الخلايا النادرة، وعلاقات سلالات الخلايا ، وتكوين الأنسجة الجسدية الفسيفسائي ، وتحليل الميكروبات التي لا يمكن زراعتها، وتطور الأمراض. [ 5 ] وقد اختارت مجموعة Nature Publishing Group تسلسل الحمض النووي للخلايا المفردة كأفضل طريقة بحثية لعام 2013. [ 6 ]

تسلسل الجينوم (DNA)

يتضمن تسلسل جينوم الحمض النووي للخلايا المفردة عزل خلية واحدة، وتضخيم الجينوم بأكمله أو المنطقة المستهدفة، وبناء مكتبات التسلسل، ثم تطبيق تقنيات تسلسل الحمض النووي من الجيل التالي (مثل Illumina و Ion Torrent ). وقد طُبِّق تسلسل الحمض النووي للخلايا المفردة على نطاق واسع في أنظمة الثدييات لدراسة الوظائف الفسيولوجية الطبيعية والأمراض. ويمكن لدقة الخلية المفردة أن تكشف عن أدوار التوزع الجيني الفسيفسائي أو عدم التجانس الجيني داخل الورم في تطور السرطان أو الاستجابة للعلاج. [ 7 ] وفي سياق الميكروبيومات، يُشار إلى الجينوم من كائن وحيد الخلية باسم الجينوم المُضخَّم المفرد (SAG). وقد مكّنت التطورات في تسلسل الحمض النووي للخلايا المفردة من جمع البيانات الجينومية من أنواع بدائيات النوى غير المستزرعة الموجودة في الميكروبيومات المعقدة. [ 8 ]  وعلى الرغم من أن الجينومات المُضخَّمة المفردة (SAGs) تتميز بانخفاض اكتمالها وتحيزها الكبير، فقد حققت التطورات الحاسوبية الحديثة تجميع جينومات شبه كاملة من جينومات مُضخَّمة مفردة مركبة. [ 9 ] قد تُسهم البيانات المُستقاة من الكائنات الدقيقة في وضع أسس لعمليات الاستزراع في المستقبل. [ 10 ] تتضمن بعض أدوات تجميع الجينوم المُستخدمة في تسلسل الخلايا المفردة SPAdes وIDBA-UD وCortex وHyDA. [ 11 ]

طُرق

يوضح هذا الشكل سير عمل تسلسل الجينوم أحادي الخلية. MDA اختصار لـ Multiple Displacement Amplification (تضخيم الإزاحة المتعددة).

نُشرت قائمة تضم أكثر من 100 طريقة مختلفة لتحليل الجينوم أحادي الخلية . [ 12 ]

تُعدّ تقنية تضخيم الإزاحة المتعددة (MDA) تقنية شائعة الاستخدام، تُمكّن من تضخيم كميات ضئيلة من الحمض النووي (من الفيمتوغرامات) من البكتيريا إلى الميكروغرامات لأغراض التسلسل. تشمل الكواشف اللازمة لتفاعلات MDA: البادئات العشوائية وبوليميراز الحمض النووي من العاثية phi29. في تفاعل متساوي الحرارة عند 30 درجة مئوية، يُضخّم الحمض النووي باستخدام الكواشف المُرفقة. أثناء قيام البوليميراز بتكوين سلاسل جديدة، يحدث تفاعل إزاحة السلسلة، حيث يتم تخليق نسخ متعددة من كل قالب DNA. في الوقت نفسه، تُزاح السلاسل التي تم تمديدها مسبقًا. ينتج عن MDA سلاسل بطول حوالي 12 كيلوبايت، ويتراوح طولها حتى حوالي 100 كيلوبايت، مما يُتيح استخدامها في تسلسل الحمض النووي. [ 10 ] في عام 2017، طُوِّرَ تحسينٌ كبيرٌ لهذه التقنية، يُسمى WGA-X، بالاستفادة من طفرةٍ مقاومةٍ للحرارة من بوليميراز phi29، مما أدى إلى استخلاصٍ أفضل للجينوم من الخلايا الفردية، ولا سيما تلك ذات المحتوى العالي من G+C . [ 13 ] كما طُبِّقَت تقنية MDA في نظامٍ قائمٍ على القطرات الميكروفلويدية لتحقيق تضخيمٍ متوازٍ للغاية للجينوم الكامل للخلايا المفردة. ومن خلال تغليف الخلايا المفردة في قطراتٍ لالتقاط الحمض النووي وتضخيمه، تُوفِّر هذه الطريقة تحيزًا أقل وإنتاجيةً مُحسَّنةً مقارنةً بتقنية MDA التقليدية. [ 14 ]

طريقة أخرى شائعة هي MALBAC . [ 15 ] كما هو الحال في MDA، تبدأ هذه الطريقة بالتضخيم متساوي الحرارة، ولكن تُحاط البادئات بتسلسل "مشترك" لتضخيم PCR اللاحق . مع توليد النواتج الأولية، يُعزز التسلسل المشترك الربط الذاتي وتكوين "حلقات" لمنع المزيد من التضخيم. على عكس MDA، لا تتشكل شبكة DNA متفرعة للغاية. بدلاً من ذلك، تُفصل الحلقات في دورة حرارية أخرى مما يسمح بتضخيم القطع باستخدام PCR. تم تطبيق MALBAC أيضًا في جهاز ميكروفلويدي، ولكن لم يتحسن أداء التضخيم بشكل ملحوظ عن طريق التغليف في قطرات نانولترية. [ 16 ]

بمقارنة تقنيتي MDA وMALBAC، نجد أن MDA توفر تغطية جينومية أفضل، بينما توفر MALBAC تغطية أكثر تجانسًا عبر الجينوم. قد تكون MDA أكثر فعالية في تحديد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) ، في حين تُفضل MALBAC للكشف عن تغيرات عدد النسخ. على الرغم من أن استخدام جهاز الموائع الدقيقة في MDA يقلل بشكل ملحوظ من التحيز والتلوث، إلا أن الكيمياء المستخدمة في MALBAC لا تُظهر نفس الإمكانات لتحسين الكفاءة.

تُعدّ تقنية تسلسل الحمض النووي أحادي الخلية باستخدام قالب الحمض النووي (المعروفة أيضًا باسم Strand-seq) طريقةً مناسبةً لاكتشاف التباين البنيوي الجينومي. [ 17 ] تعتمد هذه التقنية على مبدأ المعالجة ثلاثية القنوات أحادية الخلية، والذي يستخدم نمذجةً مشتركةً لاتجاه القراءة وعمقها وطور النمط الفرداني، مما يُمكّن من اكتشاف الطيف الكامل لفئات التباين البنيوي الجسدي التي يبلغ حجمها 200 كيلوبايت أو أكثر. تتغلب تقنية Strand-seq على قيود طرق تضخيم الجينوم الكامل لتحديد فئات التباين الجيني الجسدي في الخلايا المفردة، [ 18 ] لأنها لا تتأثر بتداخلات القراءة التي تؤدي إلى ظهور شوائب في عملية الاستدعاء (كما هو موضح بالتفصيل في القسم أدناه)، كما أنها أقل تأثرًا بفقدان التسلسلات. يعتمد اختيار الطريقة على هدف التسلسل، حيث تتميز كل طريقة بمزايا مختلفة. [ 7 ]

القيود

ينتج عن تضخيم الجينومات المتعددة للخلايا الفردية تغطية جينومية غير متجانسة، أي تمثيل زائد أو ناقص نسبي لمناطق مختلفة من القالب، مما يؤدي إلى فقدان بعض التسلسلات. يتكون هذا من عنصرين: أ) تضخيم زائد أو ناقص عشوائي لمناطق عشوائية؛ ب) تحيز منهجي ضد المناطق ذات نسبة GC العالية. يمكن معالجة العنصر العشوائي بتجميع تفاعلات تضخيم الجينومات المتعددة للخلايا الفردية من نفس نوع الخلية، باستخدام التهجين الموضعي الفلوري (FISH) و/أو تأكيد التسلسل اللاحق. [ 10 ] يمكن معالجة تحيز تضخيم الجينومات المتعددة ضد المناطق ذات نسبة GC العالية باستخدام بوليميرازات مقاومة للحرارة، كما هو الحال في عملية WGA-X. [ 13 ]

تُشكل تعددات النوكليوتيدات المفردة (SNPs)، التي تُعد جزءًا كبيرًا من التباين الجيني في الجينوم البشري ، وتغيرات عدد النسخ (CNV)، تحديات في تسلسل الخلايا المفردة، فضلًا عن محدودية كمية الحمض النووي المستخلص من الخلية الواحدة. ونظرًا لقلة كمية الحمض النووي، يُصبح التحليل الدقيق للحمض النووي صعبًا حتى بعد التضخيم، نظرًا لانخفاض التغطية وقابليتها للأخطاء. في تقنية التضخيم المتعدد للجينوم (MDA)، تقل تغطية الجينوم عن 80%، ويتم استبعاد تعددات النوكليوتيدات المفردة غير المغطاة بقراءات التسلسل. إضافةً إلى ذلك، تُظهر تقنية MDA نسبة عالية من فقدان الأليلات ، حيث لا تكتشف الأليلات من العينات غير المتجانسة. تُستخدم حاليًا خوارزميات متنوعة لتعددات النوكليوتيدات المفردة، ولكن لا يوجد أي منها مُخصص لتسلسل الخلايا المفردة. كما تُثير تقنية MDA مع تغيرات عدد النسخ مشكلة تحديد تغيرات عدد النسخ الزائفة التي تُخفي تغيرات عدد النسخ الحقيقية. ولحل هذه المشكلة، عندما يُمكن توليد أنماط من تغيرات عدد النسخ الزائفة، يُمكن للخوارزميات اكتشاف هذا التشويش والقضاء عليه لإنتاج المتغيرات الحقيقية. [ 19 ]

تتغلب تقنية Strand-seq على قيود الطرق القائمة على تضخيم الجينوم الكامل لتحديد المتغيرات الجينية: فبما أنها لا تتطلب قراءات (أو أزواج قراءات) تعبر حدود (أو نقاط انقطاع) تغيرات عدد النسخ أو فئات المتغيرات البنيوية المتوازنة، فإنها أقل عرضة للتشوهات الشائعة في طرق الخلايا المفردة القائمة على تضخيم الجينوم الكامل، والتي تشمل فقدان تحديد المتغيرات بسبب فقدان القراءات عند نقطة انقطاع المتغير وظهور قراءات هجينة. [ 7 ] [ 18 ] تكتشف تقنية Strand-seq الطيف الكامل لفئات التباين البنيوي التي لا يقل حجمها عن 200 كيلوبايت، بما في ذلك دورات الانكسار والاندماج والجسور وأحداث تفتت الكروموسومات ، بالإضافة إلى الانقلابات المتوازنة، وعمليات الانتقال المتوازنة أو غير المتوازنة في عدد النسخ. [ 18 ] يتم تحديد المتغيرات البنيوية التي يتم تحديدها بواسطة تقنية Strand-seq من خلال النمط الفرداني لطول الكروموسوم ، مما يوفر خصوصية إضافية في تحديد المتغيرات. [ 18 ] ومن القيود الحالية، أن تقنية Strand-seq تتطلب خلايا منقسمة لوضع علامات خاصة بالسلسلة باستخدام بروموديوكسي يوريدين (BrdU)، ولا تكشف هذه الطريقة عن المتغيرات التي يقل حجمها عن 200 كيلوبايت، مثل إدخالات العناصر المتحركة .

التطبيقات

تُعدّ الميكروبيومات من بين الأهداف الرئيسية لعلم الجينوم أحادي الخلية، نظرًا لصعوبة استزراع غالبية الكائنات الدقيقة في معظم البيئات. ويُعتبر علم الجينوم أحادي الخلية وسيلة فعّالة للحصول على تسلسلات الجينوم الميكروبي دون الحاجة إلى الاستزراع. وقد طُبّق هذا النهج على نطاق واسع على الميكروبيومات البحرية، والترابية، وتحت السطحية، والكائنات الحية، وغيرها من أنواع الميكروبيومات، وذلك للإجابة على مجموعة واسعة من التساؤلات المتعلقة بعلم البيئة الميكروبية ، والتطور، والصحة العامة، وإمكانات التكنولوجيا الحيوية. [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]

يُعدّ تسلسل الحمض النووي للخلايا السرطانية تطبيقًا ناشئًا لتقنية تسلسل الحمض النووي أحادي الخلية (scDNAseq). إذ يُمكن تحليل الأورام الطازجة أو المجمدة وتصنيفها بدقة عالية فيما يتعلق بتغيرات عدد النسخ (SCNAs) والطفرات النقطية المفردة (SNVs) وإعادة ترتيب الجينات، وذلك باستخدام مناهج تسلسل الحمض النووي للجينوم الكامل. [ 29 ] يُعدّ تسلسل الحمض النووي أحادي الخلية للخلايا السرطانية مفيدًا بشكل خاص لدراسة مدى تعقيد الطفرات المركبة الموجودة في الأهداف العلاجية المُضخّمة، مثل جينات مستقبلات التيروزين كيناز (EGFR، PDGFRA، إلخ)، حيث تعجز المناهج التقليدية على مستوى مجموعة الخلايا في الورم عن تحديد أنماط التواجد المشترك لهذه الطفرات داخل الخلايا المفردة للورم. وقد يُوفّر هذا التداخل تكرارًا في تنشيط المسارات ومقاومة الخلايا السرطانية.

تسلسل ميثيلوم الحمض النووي

إحدى طرق تسلسل مثيلة الحمض النووي للخلايا المفردة. [ 30 ]

يُستخدم تسلسل ميثيلوم الحمض النووي أحادي الخلية لتحديد كمية مثيلة الحمض النووي . توجد عدة أنواع معروفة من المثيلة في الطبيعة، بما في ذلك 5-ميثيل سيتوزين (5mC)، و5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين (5hmC)، و6-ميثيل أدينوزين (6mA)، و4-ميثيل سيتوزين (4mC). في حقيقيات النوى، وخاصة الحيوانات، ينتشر 5mC على نطاق واسع في الجينوم، ويلعب دورًا هامًا في تنظيم التعبير الجيني عن طريق كبح العناصر القابلة للنقل . [ 31 ] يمكن أن يكشف تسلسل 5mC في الخلايا الفردية كيف تؤدي التغيرات فوق الجينية عبر خلايا متطابقة جينيًا من نسيج واحد أو مجموعة واحدة إلى ظهور خلايا ذات أنماط ظاهرية مختلفة.

طُرق

أصبح تسلسل البيسلفيت المعيار الذهبي في الكشف عن 5-ميثيل سيتوزين (5mC) وتسلسله في الخلايا المفردة. [ 32 ] يُحوّل معالجة الحمض النووي بالبيسلفيت بقايا السيتوزين إلى يوراسيل، بينما تبقى بقايا 5-ميثيل سيتوزين دون تغيير. لذلك، يحتفظ الحمض النووي المعالج بالبيسلفيت بالسيتوزينات الميثيلية فقط. وللحصول على قراءة الميثيلوم، تتم محاذاة التسلسل المعالج بالبيسلفيت مع جينوم غير مُعدّل. وقد أُنجز تسلسل الجينوم الكامل باستخدام البيسلفيت في الخلايا المفردة عام 2014. [ 33 ] تتغلب هذه الطريقة على فقدان الحمض النووي المرتبط بالإجراء التقليدي، حيث تُضاف محولات التسلسل قبل تجزئة البيسلفيت. بدلاً من ذلك، تُضاف المحولات بعد معالجة الحمض النووي وتجزئته بالبيسلفيت، مما يسمح بتضخيم جميع الشظايا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). [ 34 ] باستخدام تقنية التسلسل العميق، تلتقط هذه الطريقة ما يقارب 40% من إجمالي مواقع CpG في كل خلية. لا يمكن تضخيم الحمض النووي باستخدام التقنيات الحالية قبل المعالجة بالبيسلفيت، لأن علامات 5mC لن تُنسخ بواسطة البوليميراز.

يُعدّ تسلسل البيسلفيت ذو التمثيل المُخفّض للخلايا المفردة (scRRBS) طريقةً أخرى. [ 35 ] تستغل هذه الطريقة ميل السيتوزينات المُمَثْيَلَة للتجمع في جزر CpG (CGIs) لإثراء مناطق الجينوم ذات المحتوى العالي من CpG. يُقلّل هذا من تكلفة التسلسل مقارنةً بتسلسل البيسلفيت للجينوم الكامل، ولكنه يُحدّ من تغطية هذه الطريقة. عند تطبيق RRBS على عينات مُجمّعة، يتم الكشف عن غالبية مواقع CpG في مُحفّزات الجينات، ولكن هذه المواقع لا تُمثّل سوى 10% من مواقع CpG في الجينوم بأكمله. [ 36 ] في الخلايا المفردة، يتم الكشف عن 40% من مواقع CpG من العينة المُجمّعة. لزيادة التغطية، يُمكن تطبيق هذه الطريقة أيضًا على مجموعة صغيرة من الخلايا المفردة. في عينة مُجمّعة من 20 خلية مفردة، تم الكشف عن 63% من مواقع CpG من العينة المُجمّعة. يُعد تجميع الخلايا المفردة إحدى الاستراتيجيات لزيادة تغطية الميثيلوم، ولكن على حساب إخفاء عدم التجانس في مجموعة الخلايا.

القيود

على الرغم من أن تسلسل البيسلفيت لا يزال الطريقة الأكثر شيوعًا للكشف عن 5mC، إلا أن المعالجة الكيميائية قاسية وتؤدي إلى تفتيت الحمض النووي وتلفه. ويتفاقم هذا التأثير عند الانتقال من عينات كبيرة إلى خلايا مفردة. تشمل الطرق الأخرى للكشف عن مثيلة الحمض النووي استخدام إنزيمات التقييد الحساسة للمثيلة. كما تُمكّن إنزيمات التقييد من الكشف عن أنواع أخرى من المثيلة، مثل 6mA باستخدام DpnI . [ 37 ] يوفر التسلسل القائم على تقنية النانو المسامية أيضًا مسارًا للتسلسل المباشر للمثيلة دون تفتيت الحمض النووي الأصلي أو تعديله. وقد استُخدم التسلسل بتقنية النانو المسامية لتسلسل ميثيلومات البكتيريا، التي يهيمن عليها 6mA و4mC (على عكس 5mC في حقيقيات النوى)، ولكن لم يتم بعد تطبيق هذه التقنية على الخلايا المفردة. [ 38 ]

التطبيقات

استُخدم تسلسل مثيلة الحمض النووي أحادي الخلية على نطاق واسع لاستكشاف الاختلافات فوق الجينية في الخلايا المتشابهة جينيًا. وللتحقق من صحة هذه الأساليب أثناء تطويرها، تم تصنيف بيانات مثيلة الحمض النووي أحادي الخلية لمجموعة مختلطة بنجاح باستخدام التجميع الهرمي لتحديد أنواع الخلايا المتميزة. [ 35 ] ومن التطبيقات الأخرى دراسة الخلايا المفردة خلال الانقسامات الخلوية القليلة الأولى في المراحل المبكرة من النمو لفهم كيفية ظهور أنواع الخلايا المختلفة من جنين واحد. [ 39 ] كما استُخدم تسلسل الجينوم الكامل أحادي الخلية بتقنية البيسلفيت لدراسة أنواع الخلايا النادرة ولكنها شديدة النشاط في السرطان، مثل الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs). [ 40 ]

مقارنة طرق تسلسل مثيلة الحمض النووي للخلايا المفردة من حيث التغطية حتى عام 2015 على فأر التجارب (Mus musculus).

تسلسل الكروماتين القابل للوصول بواسطة الترانسبيوزاز (scATAC-seq)

تُستخدم تقنية تسلسل الكروماتين القابل للوصول بواسطة الترانسبيوزاز في الخلايا المفردة لرسم خرائط إمكانية الوصول إلى الكروماتين عبر الجينوم. يقوم الترانسبيوزاز بإدخال محولات التسلسل مباشرةً في المناطق المفتوحة من الكروماتين، مما يسمح بتضخيم هذه المناطق وتسلسلها. [ 41 ]

طُرق

تعتمد الطريقتان لإعداد المكتبة في scATAC-Seq على فهرسة الخلايا المجمعة المنقسمة والميكروفلويديك.

تسلسل النسخ الجيني (scRNA-seq)

تُحلل الطرق القياسية، مثل المصفوفات الدقيقة وتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) ، التعبير الجيني للحمض النووي الريبوزي من مجموعات كبيرة من الخلايا. وقد تُخفي هذه القياسات اختلافات جوهرية بين الخلايا الفردية في مجموعات الخلايا المختلطة. [ 42 ] [ 43 ]

يُوفّر تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) بيانات التعبير الجيني للخلايا الفردية، ويُعتبر المعيار الذهبي لتحديد حالات الخلايا وأنماطها الظاهرية حتى عام 2020. [ 44 ] على الرغم من استحالة الحصول على معلومات كاملة عن كل حمض نووي ريبوزي تُعبّر عنه كل خلية، نظرًا لقلة كمية المادة المتاحة، إلا أنه يُمكن تحديد أنماط التعبير الجيني من خلال تحليلات تجميع الجينات . [ 45 ] يُمكن لهذا أن يكشف عن أنواع خلايا نادرة ضمن مجموعة من الخلايا، ربما لم يسبق رصدها من قبل. على سبيل المثال، حدّد فريق من العلماء، من خلال إجراء تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية على نسيج ورم الأرومة العصبية، نوعًا نادرًا من خلايا سرطان الأرومة العصبية الشاملة، والذي قد يكون واعدًا لأساليب علاجية جديدة. [ 46 ]

طُرق

سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية

تتضمن بروتوكولات تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) الحالية عزل الخلايا المفردة وحمضها النووي الريبوزي (RNA)، ثم اتباع نفس خطوات تسلسل الحمض النووي الريبوزي الشامل (bulk RNA-seq): النسخ العكسي ، والتضخيم، وتكوين المكتبة، والتسلسل. كانت الطرق القديمة تفصل الخلايا المفردة في آبار منفصلة؛ أما الطرق الأحدث فتغلف الخلايا المفردة في قطرات داخل جهاز ميكروفلويدي، حيث يحدث تفاعل النسخ العكسي، محولًا الحمض النووي الريبوزي (RNA) إلى حمض نووي تكميلي (cDNA). تحمل كل قطرة "رمزًا شريطيًا" من الحمض النووي يميز بشكل فريد الحمض النووي التكميلي (cDNA) المشتق من خلية واحدة. بمجرد اكتمال النسخ العكسي، يمكن خلط الحمض النووي التكميلي (cDNA) من خلايا متعددة معًا للتسلسل، لأن النسخ من خلية معينة يتم تحديدها بواسطة الرمز الشريطي الفريد. [ 47 ] [ 48 ]

تشمل تحديات تقنية تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-Seq) الحفاظ على الوفرة النسبية الأولية للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) في الخلية، وتحديد النسخ النادرة. [ 49 ] تُعدّ خطوة النسخ العكسي بالغة الأهمية، إذ تحدد كفاءة تفاعل النسخ العكسي كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي سيتم تحليلها بواسطة جهاز التسلسل. وقد تؤثر كفاءة إنزيمات النسخ العكسي واستراتيجيات التحضير المستخدمة على إنتاج الحمض النووي التكميلي (cDNA) كامل الطول، وعلى إنشاء مكتبات مُوجّهة نحو النهاية 3' أو 5' للجينات.

في خطوة التضخيم، يُستخدم حاليًا إما تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو النسخ المختبري (IVT) لتضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA). من مزايا الطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل القدرة على إنتاج حمض نووي تكميلي كامل الطول. مع ذلك، قد تتضاعف كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل على تسلسلات معينة (مثل محتوى GC وبنية الارتداد) بشكل كبير، مما ينتج عنه مكتبات ذات تغطية غير متساوية. من جهة أخرى، بينما تتجنب المكتبات المُنتجة بواسطة النسخ المختبري التحيز التسلسلي الناتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل، قد تُنسخ تسلسلات معينة بكفاءة منخفضة، مما يؤدي إلى فقدان التسلسل أو إنتاج تسلسلات غير مكتملة. [ 1 ] [ 42 ] نُشرت عدة بروتوكولات لتسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq): Tang et al.، [ 50 ] STRT، [ 51 ] SMART-seq، [ 52 ] SORT-seq، [ 53 ] CEL-seq، [ 54 ] RAGE-seq، [ 55 ] Quartz-seq. [ 56 ] ، وC1-CAGE. [ 57 ] تختلف هذه البروتوكولات من حيث استراتيجيات النسخ العكسي، وتخليق الحمض النووي التكميلي وتضخيمه، وإمكانية استيعاب الرموز الشريطية الخاصة بالتسلسل (مثل UMIs ) أو القدرة على معالجة العينات المجمعة. [ 58 ]

في عام 2017، طُرحت طريقتان لقياس التعبير الجيني للرنا المرسال والبروتين في الخلايا المفردة في آنٍ واحد باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بالأوليغونوكليوتيدات، والمعروفتان باسم REAP-seq [ 59 ] وCITE-seq [ 60 ] . كما أتاح جمع محتويات الخلايا بعد التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي باستخدام تقنية التثبيت الموضعي (patch-clamp) تطوير طريقة Patch-Seq ، التي تكتسب رواجًا متزايدًا في علم الأعصاب [ 61 ] .

مثال على منصة تعتمد على القطرات - طريقة 10X

تتيح هذه المنصة لتسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية تحليل النسخ الجينية على مستوى الخلية الواحدة باستخدام تقنية التقسيم الميكروفلويدي لالتقاط الخلايا المفردة وإعداد مكتبات الحمض النووي التكميلي (cDNA) لتسلسل الجيل التالي (NGS) . [ 62 ] كما تُمكّن هذه المنصة القائمة على القطرات من إجراء تسلسل متوازٍ واسع النطاق للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) في عدد كبير من الخلايا الفردية عن طريق التقاط كل خلية على حدة في قطرة زيتية. [ 63 ]

بشكل عام، في المرحلة الأولى، تُفصل الخلايا وتُحلل، ثم يُجرى النسخ العكسي للـ mRNA ، ويُحصل على مكتبة cDNA . لاختيار mRNA، يُجرى النسخ العكسي باستخدام بادئ أحادي السلسلة من ديوكسي ثايمين (أوليغو dT) يرتبط تحديدًا بذيل متعدد الأدينين لجزيئات mRNA. بعد ذلك، تُستخدم مكتبة cDNA المُضخمة للتسلسل. [ 64 ]

إذن، الخطوة الأولى في هذه الطريقة هي تغليف الخلايا المفردة وإعداد المكتبة. تُغلّف الخلايا في حويصلات هلامية مستحلبة (GEMs) باستخدام جهاز آلي. ولتكوين هذه الحويصلات، يستخدم الجهاز شريحة ميكروفلويدية ويخلط جميع المكونات بالزيت. تحتوي كل حويصلة هلامية مستحلبة وظيفية على خلية واحدة، وحويصلة هلامية واحدة، وكواشف النسخ العكسي. ترتبط بالحويصلة الهلامية سلاسل قليلة النوكليوتيدات تتكون من 4 أجزاء مميزة: بادئ تفاعل البوليميراز المتسلسل (الضروري للتسلسل)؛ سلاسل قليلة النوكليوتيدات ذات الترميز الشريطي 10X؛ تسلسل المعرف الجزيئي الفريد (UMI)؛ تسلسل PolydT (الذي يُمكّن من التقاط جزيئات mRNA متعددة الأدينين ). [ 65 ] داخل كل حويصلة تفاعل هلامية مستحلبة، تُحلّل خلية واحدة وتخضع لعملية النسخ العكسي. يتم تحديد الحمض النووي التكميلي (cDNA) من الخلية نفسها بفضل رمز شريطي مشترك 10X. بالإضافة إلى ذلك، يُعبّر عدد وحدات الجينوم الفريدة (UMIs) عن مستوى التعبير الجيني، ويتيح تحليلها الكشف عن الجينات شديدة التباين. تُستخدم هذه البيانات غالبًا إما لتصنيف النمط الظاهري الخلوي أو لتحديد مجموعات فرعية جديدة. [ 66 ]

الخطوة الأخيرة في هذه المنصة هي التسلسل. يمكن استخدام المكتبات المُنشأة مباشرةً لتسلسل النسخ الكامل للخلايا المفردة أو لتسلسل الأهداف. يُجرى التسلسل باستخدام طريقة تسلسل الصبغة من Illumina . تعتمد هذه الطريقة على مبدأ التسلسل بالتخليق (SBS) واستخدام مُنهي الصبغة العكسي الذي يُتيح تحديد كل نيوكليوتيد على حدة. لقراءة تسلسلات النسخ من جهة، والباركود وUMI من الجهة الأخرى، يلزم استخدام قارئات تسلسل ثنائية الأطراف. [ 67 ]

تتيح المنصة القائمة على القطرات الكشف عن أنواع الخلايا النادرة بفضل إنتاجيتها العالية. في الواقع، يتم التقاط ما بين 500 إلى 20000 خلية لكل عينة من معلق خلوي واحد. يتميز البروتوكول بسهولة تنفيذه، ويسمح بمعدل استرداد خلايا مرتفع يصل إلى 65%. تستغرق عملية سير العمل الكاملة للمنصة القائمة على القطرات 8 ساعات، مما يجعلها أسرع من طريقة الميكروويل (BD Rhapsody) التي تستغرق 10 ساعات. مع ذلك، فهي تعاني من بعض القيود، مثل الحاجة إلى عينات طازجة، والكشف النهائي عن 10% فقط من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA).

يتمثل الاختلاف الرئيسي بين الطريقة القائمة على القطرات والطريقة القائمة على الآبار الدقيقة في التقنية المستخدمة لتقسيم الخلايا. [ 64 ]

القيود

تعتمد معظم طرق تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) على التقاط ذيل البولي أدينين (poly(A)) لإثراء الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) واستبعاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) الوفير وغير المفيد. ولذلك، غالبًا ما تقتصر هذه الطرق على تسلسل جزيئات mRNA متعددة الأدينين. مع ذلك، بدأت الدراسات الحديثة تُدرك أهمية الحمض النووي الريبوزي غير متعدد الأدينين، مثل الحمض النووي الريبوزي الطويل غير المشفر (lnRNA) والحمض النووي الريبوزي الميكروي (microRNA) في تنظيم التعبير الجيني. تُعدّ تقنية Small-seq طريقةً أحادية الخلية لالتقاط جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة (<300 نيوكليوتيد) مثل الحمض النووي الريبوزي الميكروي، وشظايا الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA)، وجزيئات الحمض النووي الريبوزي النووي الصغيرة في خلايا الثدييات. [ 68 ] تستخدم هذه الطريقة مزيجًا من "أقنعة قليلة النيوكليوتيدات" (التي تمنع التقاط جزيئات rRNA 5.8S عالية الوفرة) واختيار الحجم لاستبعاد أنواع الحمض النووي الريبوزي الكبيرة مثل جزيئات rRNA الأخرى عالية الوفرة. لاستهداف جزيئات الحمض النووي الريبوزي غير متعددة الأدينين الأكبر حجمًا، مثل الحمض النووي الريبوزي الرسول غير المشفر الطويل، والحمض النووي الريبوزي الرسول للهيستون، والحمض النووي الريبوزي الدائري، والحمض النووي الريبوزي المعزز، لا يُعد اختيار الحجم مناسبًا لاستنزاف جزيئات الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (18S و28S rRNA) عالية الوفرة. [ 69 ] تُعد تقنية RamDA-Seq أحادية الخلية طريقةً تُحقق ذلك من خلال إجراء النسخ العكسي مع التمهيد العشوائي (تضخيم الإزاحة العشوائية) في وجود بادئات "غير عشوائية" (NSR) مصممة خصيصًا لتجنب التمهيد على جزيء الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي. [ 70 ] على الرغم من أن هذه الطريقة تنجح في التقاط نسخ الحمض النووي الريبوزي الكلي كاملة الطول للتسلسل، وكشف مجموعة متنوعة من جزيئات الحمض النووي الريبوزي غير متعددة الأدينين بحساسية عالية، إلا أنها تنطوي على بعض القيود. فقد صُممت بادئات NSR بعناية وفقًا لتسلسلات الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي في الكائن الحي المحدد (الفأر)، وسيتطلب تصميم مجموعات بادئات جديدة لأنواع أخرى جهدًا كبيرًا. في الآونة الأخيرة، أظهرت طريقة تعتمد على تقنية كريسبر تسمى scDASH (استنزاف التسلسلات الوفيرة من الخلايا المفردة عن طريق التهجين) نهجًا آخر لاستنزاف تسلسلات الحمض النووي الريبوزي من مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبوزي الكلي للخلايا المفردة. [ 71 ]

لا تُعدّ البكتيريا وغيرها من بدائيات النوى مناسبةً حاليًا لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) نظرًا لافتقارها إلى الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين. لذا، فإن تطوير طرق تحليل تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية التي لا تعتمد على التقاط ذيل متعدد الأدينين سيكون له دورٌ أساسي في تمكين دراسات الميكروبيوم بدقة الخلية الواحدة. عادةً ما تستخدم الدراسات البكتيرية الشاملة استنزافًا عامًا للحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) للتغلب على نقص الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين في البكتيريا، ولكن على مستوى الخلية الواحدة، يكون إجمالي الحمض النووي الريبوزي الموجود في خلية واحدة ضئيلًا جدًا. [ 69 ] يُعدّ نقص الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين وندرة إجمالي الحمض النووي الريبوزي الموجود في خلايا البكتيريا المفردة عائقين مهمين يحدّان من استخدام تقنية scRNA-seq في البكتيريا.

تنشأ قيودٌ أخرى نتيجةً لأخذ عينات جزئية ومتحيزة في تقنية تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq)، إذ لا تُسجّل هذه التقنية سوى لمحة سريعة عن النشاط الخلوي. فعلى سبيل المثال، في أنواع الخلايا الكبيرة والمتفرعة كالعصبونات ، لا تُسجّل تقنية عزل الخلايا المفردة سوى الحمض النووي الريبوزي من أجسام الخلايا المركزية، بعد فصلها عن زوائدها أثناء عملية الطحن. ويُقدّر أن أكثر من 40% من إجمالي الحمض النووي الريبوزي في الدماغ موجود في زوائد خلوية كالمحاور العصبية ، والتغصنات ، ونهايات الخلايا النجمية ، وبالتالي لا يمكن رصده باستخدام تقنيات تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية. [ 72 ]

التطبيقات

أصبح استخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-Seq) شائعًا في مختلف التخصصات البيولوجية، بما في ذلك علم الأحياء النمائي ، [73] وعلم الأعصاب ، [ 74 ] وعلم الأورام ، [ 75 ] [ 76 ] [ 77 ] وعلم المناعة ، [ 78 ] [ 79 ] [ 80 ] وأبحاث القلب والأوعية الدموية، [81] [ 82 ] وأمراض الدماغ ، [ 83 ] والأمراض المعدية . [ 84 ] [ 85 ]

باستخدام أساليب التعلم الآلي ، تم استخدام بيانات من تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq) الشامل لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-Seq). على وجه التحديد، استخدم العلماء بيانات التعبير الجيني من مجموعات بيانات شاملة لأنواع السرطان لبناء شبكات التعبير المشترك ، ثم طبقوا هذه الشبكات على بيانات التعبير الجيني للخلايا المفردة، مما أدى إلى الحصول على طريقة أكثر فعالية للكشف عن وجود طفرات في الخلايا الفردية باستخدام مستويات النسخ. [ 86 ]

طُبقت بعض طرق تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) على الكائنات الحية الدقيقة أحادية الخلية. استُخدمت تقنية SMART-seq2 لتحليل الميكروبات حقيقية النواة أحادية الخلية، ولكن نظرًا لاعتمادها على التقاط ذيل البولي أدينين، لم تُطبق على الخلايا بدائية النواة. [ 87 ] استُخدمت تقنيات الموائع الدقيقة، مثل Drop-seq وأجهزة Fluidigm IFC-C1، لتسلسل طفيليات الملاريا المفردة أو خلايا الخميرة المفردة. [ 88 ] [ 89 ] سعت دراسة الخميرة أحادية الخلية إلى توصيف التباين في تحمل الإجهاد في خلايا الخميرة المتماثلة جينيًا قبل وبعد تعرضها للإجهاد الملحي. كشف تحليل الخلايا المفردة لعدة عوامل نسخ باستخدام تقنية scRNA-seq عن تباين في جميع أنحاء المجموعة. تشير هذه النتائج إلى أن التنظيم يختلف بين أفراد المجموعة لزيادة فرص بقاء جزء منها.

أُجري أول تحليل للنسخ الجيني لخلية واحدة في نوع بدائيات النوى باستخدام إنزيم إكسونوكلياز المُنهي لتحليل الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) بشكل انتقائي، وتقنية تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA) للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA). [ 90 ] في هذه الطريقة، رُبطت نهايات الحمض النووي أحادي السلسلة معًا لتشكيل حلقة، ثم استُخدمت الحلقة الناتجة كقالب لتضخيم الحمض النووي الريبوزي الخطي. بعد ذلك، حُللت مكتبة المنتج النهائية باستخدام المصفوفات الدقيقة، مع تحيز منخفض وتغطية جيدة. مع ذلك، لم تُختبر تقنية RCA مع تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)، الذي يستخدم عادةً تقنيات التسلسل من الجيل التالي. سيكون تسلسل الحمض النووي الريبوزي لخلية واحدة للبكتيريا مفيدًا للغاية لدراسة الميكروبيومات. سيعالج هذا التحليل المشكلات التي تُصادف في مناهج الميتا-ترانسكريبتوميات التقليدية، مثل عدم القدرة على رصد الأنواع الموجودة بوفرة منخفضة، وعدم القدرة على تحديد التباين بين مجموعات الخلايا.

قدّمت تقنية تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-Seq) رؤىً قيّمة حول نمو الأجنة والكائنات الحية، بما في ذلك دودة Caenorhabditis elegans [ 91 ] ، والديدان المسطحة المتجددة Schmidtea mediterranea [ 92 ] [ 93 ] ، وسمندل الماء المكسيكي Ambystoma mexicanum [ 94 ] [ 95 ] . وكانت أسماك الزيبرا [ 96 ] [ 97 ] [ 98 ] والضفدع الأفريقي Xenopus laevis [ 99 ] أول الفقاريات التي رُسمت خرائطها بهذه الطريقة. وفي كل حالة، دُرست مراحل متعددة من الجنين، مما سمح برسم خريطة عملية النمو بأكملها على مستوى الخلية. وقد صنّفت العلوم هذه التطورات كأهم إنجاز علمي لعام 2018 [ 100 ] .

تم إنشاء أطلس خلوي جزيئي لخصيتي الفئران لتحديد سمية الخصية قبل البلوغ الناجمة عن BDE47 باستخدام تقنية ScRNA-seq، مما يوفر رؤية جديدة لفهمنا للآليات والمسارات الكامنة وراء إصابة الخصية المرتبطة بـ BDE47 بدقة على مستوى الخلية الواحدة. [ 101 ]

الاعتبارات

عزل الخلايا المفردة

توجد عدة طرق لعزل الخلايا المفردة قبل تضخيم الجينوم الكامل وتسلسله. يُعد فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) أسلوبًا شائع الاستخدام. كما يمكن جمع الخلايا المفردة عن طريق المعالجة المجهرية، على سبيل المثال بالتخفيف التسلسلي أو باستخدام ماصة دقيقة أو أنبوب نانوي لحصد خلية واحدة. [ 15 ] [ 102 ] تتميز المعالجة المجهرية بسهولتها وانخفاض تكلفتها، إلا أنها تتطلب جهدًا كبيرًا وعرضة لخطأ في تحديد أنواع الخلايا تحت المجهر. يمكن أيضًا استخدام التشريح المجهري بالتقاط الليزر (LCM) لجمع الخلايا المفردة. على الرغم من أن LCM يحافظ على معرفة الموقع المكاني للخلية المأخوذة داخل النسيج، إلا أنه من الصعب التقاط خلية كاملة دون جمع مواد من الخلايا المجاورة أيضًا. [ 42 ] [ 103 ] [ 104 ] تشمل طرق الإنتاجية العالية لعزل الخلايا المفردة أيضًا تقنية الموائع الدقيقة . كل من FACS وتقنية الموائع الدقيقة دقيقتان وآليتان وقادرتان على عزل عينات غير متحيزة. ومع ذلك، تتطلب كلتا الطريقتين فصل الخلايا عن بيئاتها الدقيقة أولاً، مما يؤدي إلى اضطراب في أنماط النسخ في تحليل التعبير الجيني للرنا. [ 105 ] [ 106 ]

عدد الخلايا المراد تسلسلها وتحليلها

تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية

تختلف بروتوكولات تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية في كفاءة استخلاص الحمض النووي الريبوزي، مما يؤدي إلى اختلافات في عدد النسخ المُنتجة من كل خلية. عادةً ما تُسلسل مكتبات الخلايا المفردة بعمق مليون قراءة، لأن غالبية الجينات تُكتشف بـ 500 ألف قراءة. [ 107 ] زيادة عدد الخلايا وتقليل عمق القراءة يزيد من القدرة على تحديد التجمعات الخلوية الرئيسية. مع ذلك، قد لا يوفر عمق القراءة المنخفض دائمًا المعلومات اللازمة عن الجينات، ويعتمد اختلاف تعبيرها بين التجمعات الخلوية على استقرار جزيئات الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) وإمكانية الكشف عنها.

تُستخدم المتغيرات المساعدة لمراقبة الجودة كاستراتيجية لتحليل عدد الخلايا. وتشمل هذه المتغيرات المساعدة بشكل أساسي الترشيح بناءً على عمق العد، وعدد الجينات، ونسبة العد من جينات الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى تفسير الإشارات الخلوية.

انظر أيضاً

مراجع

  1. إيبرواين جيه، سول جيه واي، بارتفاي تي، كيم جيه (يناير 2014). "وعد تسلسل الخلية المفردة". نيتشر ميثودز . 11 ( 1): 25-27 . doi : 10.1038/nmeth.2769 . PMID 24524134. S2CID 11575439 .  
  2. ↑ بينيسي إي (أبريل 2018). "توثيق الأجنة، خليةً خلية، جينًا جينًا". مجلة ساينس . 360 (6387): 367. رمز Bibcode : 2018Sci...360..367P . doi : 10.1126/science.360.6387.367 . PMID 29700246 . 
  3. ↑ ساليبا، أ. إي.، ويسترمان، أ. ج.، غورسكي، س. أ.، فوغل، ج. (أغسطس 2014). " تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية: التطورات والتحديات المستقبلية" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 42 (14): 8845-8860 . doi : 10.1093/nar/gku555 . PMC 4132710. PMID 25053837 .  
  4. ↑ شينتاكو هـ، نيشيكي هـ، مارشال ل.أ، كوتيرا هـ، سانتياغو ج.ج (فبراير 2014). "فصل وتحليل الحمض النووي الريبوزي (RNA) والحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) من الخلايا المفردة على رقاقة". الكيمياء التحليلية . 86 (4): 1953-1957 . doi : 10.1021/ac4040218 . PMID 24499009 . 
  5. ↑ ناوي ت (يناير 2014). " تسلسل الخلية المفردة" . مجلة نيتشر ميثودز . 11 (1): 18. doi : 10.1038/nmeth.2771 . PMID 24524131. S2CID 5252333 .  
  6. ↑ "طريقة العام 2013" . مجلة Nature Methods . 11 (1): 1. يناير 2014. doi : 10.1038/nmeth.2801 . PMID 24524124 . 
  7. 1 2 3 جواد سي، كوه دبليو، كويك إس آر (مارس 2016). "تسلسل جينوم الخلية المفردة: الوضع الحالي للعلم". مراجعات الطبيعة. علم الوراثة . 17 (3): 175-188 . doi : 10.1038/nrg.2015.16 . PMID 26806412. S2CID 4800650 .  
  8. ↑ ألنيبرغ ج، كارلسون سي إم، ديفن إيه إم، بيرجين سي، هوما إف، ليند إم في، وآخرون . (سبتمبر 2018). "جينومات من بدائيات النوى غير المستزرعة: مقارنة بين الجينومات المُجمَّعة من الميتاجينوم والجينومات المُضخَّمة بشكل فردي" . ميكروبيوم . 6 ( 1): 173. doi : 10.1186/s40168-018-0550-0 . PMC 6162917. PMID 30266101 .   
  9. ↑ كوجاوا م، هوسوكاوا م، نيشيكاوا ي، موري ك، تاكياما هـ (فبراير 2018). "الحصول على مسودات جينومية عالية الجودة من ميكروبات غير مستزرعة عن طريق تنظيف وتجميع جينومات مُضخّمة من خلية واحدة" . التقارير العلمية . 8 (1): 2059. Bibcode : 2018NatSR...8.2059K . doi : 10.1038/ s41598-018-20384-3 . PMC 5794965. PMID 29391438 .  
  10. 1 2 3 " لاسكن آر إس (أكتوبر 2007). "تسلسل الجينوم أحادي الخلية باستخدام تضخيم الإزاحة المتعددة". الرأي الحالي في علم الأحياء الدقيقة . 10 (5): 510-516 . doi : 10.1016/j.mib.2007.08.005 . PMID 17923430 . "
  11. ↑ تقوي ز، موحدي ن س، دراغيتشي س، تشيتساز ح (أكتوبر 2013). "تسلسل الجينوم أحادي الخلية المُقطّر والتجميع من الصفر للمجتمعات الميكروبية المتفرقة" . المعلوماتية الحيوية . 29 (19): 2395-2401 . arXiv : 1305.0062 . Bibcode : 2013Bioin..29.2395T . doi : 10.1093/bioinformatics/btt420 . PMC 3777112. PMID 23918251 .  
  12. ↑ "Single-Cell-Omics.v2.3.13 @albertvilella" . مستندات جوجل . تم الاطلاع عليه بتاريخ 1 يناير 2020 .
  13. 1 2 ستيباناوسكاس ر، فيرغسون إي إيه، براون جيه، بولتون إن جيه، تابر بي، لابونتيه جيه إم، وآخرون . (يوليو 2017). "تحسين استخلاص الجينوم وتحليلات حجم الخلية المتكاملة للخلايا الميكروبية الفردية غير المستزرعة والجسيمات الفيروسية" . نيتشر كوميونيكيشنز . 8 (1): 84. Bibcode : 2017NatCo...8...84S . doi : 10.1038/s41467-017-00128- z . PMC 5519541. PMID 28729688 .   
  14. ↑ هوسوكاوا م، نيشيكاوا ي، كوجاوا م، تاكياما هـ (يوليو 2017). "تضخيم الجينوم الكامل المتوازي على نطاق واسع لتسلسل الخلايا المفردة باستخدام تقنية الموائع الدقيقة للقطرات" . التقارير العلمية . 7 (1): 5199. Bibcode : 2017NatSR...7.5199H . doi : 10.1038/s41598-017-05436-4 . PMC 5507899. PMID 28701744 .  
  15. 1 2 زونغ سي، لو إس، تشابمان إيه آر، شي إكس إس (ديسمبر 2012). "الكشف على مستوى الجينوم عن اختلافات النوكليوتيدات المفردة واختلافات عدد النسخ في خلية بشرية واحدة" . مجلة ساينس . 338 (6114): 1622-1626 . Bibcode : 2012Sci...338.1622Z . doi : 10.1126/science.1229164 . PMC 3600412. PMID 23258894 .  
  16. ↑ يو ز، لو س، هوانغ ي (أكتوبر 2014). "جهاز تضخيم الجينوم الكامل بتقنية الموائع الدقيقة لتسلسل الخلايا المفردة". الكيمياء التحليلية . 86 (19): 9386-9390 . doi : 10.1021/ac5032176 . PMID 25233049 . 
  17. ↑ فالكونر إي، هيلز إم، ناومان يو، بون إس إس، تشافيز إي إيه، ساندرز إيه دي، وآخرون . (نوفمبر 2012). "تسلسل الحمض النووي للخلايا المفردة يرسم خرائط إعادة ترتيب الجينوم بدقة عالية" . نيتشر ميثودز . 9 (11): 1107-1112 . doi : 10.1038/nmeth.2206 . PMC 3580294. PMID 23042453 .   
  18. 1 2 3 4 " ساندرز إيه دي، مايرز إس، غارغاني إم، بوروبسكي دي، جيونغ إتش، فان فليت إم إيه، وآخرون . (مارس 2020). " تحليل الخلية المفردة للتغيرات الهيكلية وإعادة الترتيبات المعقدة باستخدام معالجة القنوات الثلاثية" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 38 (3): 343-354 . doi : 10.1038/s41587-019-0366-x . PMC 7612647. PMID 31873213. S2CID 209464011 .    "
  19. ↑ " نينغ إل، ليو جي، لي جي، هو واي، تونغ واي، هي جي (2014). "التحديات الحالية في المعلوماتية الحيوية لعلم جينوم الخلية المفردة" . فرونتيرز إن أونكولوجي . 4 (7): 7. doi : 10.3389/fonc.2014.00007 . PMC 3902584. PMID 24478987 .  "
  20. ↑ بليني، بي سي، وكويك، إس آر (يناير 2014). "تشريح التنوع الجينومي، خلية تلو الأخرى" . مجلة نيتشر ميثودز . 11 (1): 19-21 . doi : 10.1038/nmeth.2783 . hdl : 1721.1/106574 . PMC 3947563. PMID 24524132 .  
  21. ↑ تشانغ ك، مارتيني إيه سي، ريباس إن بي، باري كيه دبليو، مالك جيه، تشيشولم إس دبليو، تشيرش جي إم (يونيو 2006). "تسلسل الجينومات من الخلايا المفردة عن طريق استنساخ البوليميراز". مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 24 (6): 680-686 . doi : 10.1038/nbt1214 . PMID 16732271. S2CID 2994579 .  
  22. ↑ يون إتش إس، برايس دي سي، ستيباناوسكاس آر، راجا في دي، سيراكي إم إي، ويلسون دبليو إتش، وآخرون . (مايو 2011). "علم الجينوم أحادي الخلية يكشف عن التفاعلات بين الكائنات الحية في الطلائعيات البحرية غير المستزرعة". مجلة ساينس . 332 (6030): 714-717 . Bibcode : 2011Sci...332..714Y . doi : 10.1126/science.1203163 . PMID 21551060. S2CID 34343205 .   
  23. ↑ سوان، ب. ك.، مارتينيز-غارسيا، م.، بريستون، س. م.، سزيربا، أ.، وويك، ت.، لامي، د.، وآخرون . (سبتمبر 2011). "إمكانية التغذية الكيميائية الذاتية بين سلالات البكتيريا المنتشرة في أعماق المحيط". مجلة ساينس . 333 (6047): 1296-1300 . Bibcode : 2011Sci...333.1296S . doi : 10.1126/science.1203690 . PMID: 21885783. S2CID : 206533092 .   
  24. ↑ وويك تي، شي جي، كوبلاند إيه، غونزاليس جي إم، هان سي، كيس إتش، وآخرون . (23 أبريل 2009). " تجميع الميتاجينوم البحري، خليةً تلو الأخرى" . PLOS ONE . 4 (4) e5299. Bibcode : 2009PLoSO...4.5299W . doi : 10.1371/journal.pone.0005299 . PMC 2668756. PMID 19390573 .   
  25. ↑ سوان، ب. ك.، تابر، ب.، سزيربا، أ.، لاورو، ف. م.، مارتينيز-غارسيا، م.، غونزاليس، ج. م.، وآخرون . (يوليو 2013). "انتشار تبسيط الجينوم والتباعد العرضي للبكتيريا العوالقية في سطح المحيط" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 110 (28): 11463-11468 . Bibcode : 2013PNAS..11011463S . doi : 10.1073/pnas.1304246110 . PMC 3710821. PMID 23801761 .   
  26. ↑ رينكه سي، وشوينتيك بي، وشزيربا إيه، وإيفانوفا إن إن، وأندرسون آي جيه، وتشينغ جيه إف، وآخرون (يوليو 2013). "رؤى حول التطور الوراثي وإمكانات الترميز للمادة المظلمة الميكروبية" . مجلة نيتشر . 499 (7459): 431-437 . Bibcode : 2013Natur.499..431R . doi : 10.1038/ nature12352 . hdl : 10453/27467 . PMID 23851394. S2CID 4394530 .   
  27. ↑ كاشتان ن، روجنساك إس إي، رودريغ إس، طومسون جيه دبليو، بيلر إس جيه، كو إيه، وآخرون . (أبريل 2014). "علم الجينوم أحادي الخلية يكشف عن مئات المجموعات الفرعية المتعايشة في بكتيريا البروكلوروكوكس البرية". مجلة ساينس . 344 (6182): 416-420 . Bibcode : 2014Sci...344..416K . doi : 10.1126/science.1248575 . hdl : 1721.1 /92763 . PMID 24763590. S2CID 13659345 .   
  28. ↑ باتشياداكي إم جي، سينتيس إي، بيرغاور كيه، براون جيه إم، ريكورد إن آر، سوان بي كيه، وآخرون . (نوفمبر 2017). "الدور الرئيسي للبكتيريا المؤكسدة للنتريت في تثبيت الكربون في المحيطات المظلمة" . مجلة ساينس . 358 (6366): 1046-1051 . Bibcode : 2017Sci...358.1046P . doi : 10.1126/science.aan8260 . PMID 29170234 .  
  29. ↑ فرانسيس جيه إم، تشانغ سي زد، ماير سي إل، جونغ جيه، مانزو في إي، أدالستينسون في إيه، وآخرون . (أغسطس 2014). "كشف عدم تجانس متغيرات مستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) في الورم الأرومي الدبقي من خلال تسلسل النواة المفردة" . مجلة اكتشاف السرطان . 4 (8): 956-971 . doi : 10.1158/2159-8290.CD-13-0879 . PMC 4125473. PMID 24893890 .   
  30. ↑ فارليك م، شيفيلد ن.س، نوزو أ، داتلينجر ب، شونيجر أ، كلوغهمر ج، بوك س (مارس 2015). "تسلسل ميثيلوم الحمض النووي أحادي الخلية والاستدلال المعلوماتي الحيوي لديناميكيات حالة الخلية فوق الجينية" . تقارير الخلية . 10 (8): 1386-1397 . doi : 10.1016/j.celrep.2015.02.001 . PMC 4542311. PMID 25732828 .  
  31. ↑ زيماخ أ، ماكدانيال آي إي، سيلفا ب، زيلبرمان د (مايو 2010). "تحليل تطوري على مستوى الجينوم لمثيلة الحمض النووي في حقيقيات النوى" . مجلة ساينس . 328 (5980): 916-919 . Bibcode : 2010Sci...328..916Z . doi : 10.1126/science.1186366 . PMID 20395474. S2CID 206525166 .  
  32. ↑ كراري-دولي إف كيه، تام إم إي، دوناواي كيه دبليو، هيرتز-بيتشيوتو آي، شميدت آر جيه، لاسال جيه إم (مارس 2017). " مقارنة بين فحوصات مثيلة الحمض النووي العالمية الحالية وتسلسل البيسلفيت للجينوم الكامل ذي التغطية المنخفضة للدراسات الوبائية" . علم التخلق . 12 (3): 206-214 . doi : 10.1080/15592294.2016.1276680 . PMC 5406214. PMID 28055307 .  
  33. ↑ سمولوود إس إيه، لي إتش جيه، أنجرمولر سي، كروجر إف، سعدة إتش، بيت جيه، وآخرون . (أغسطس 2014). "تسلسل البيسلفيت على مستوى الجينوم للخلايا المفردة لتقييم عدم التجانس اللاجيني" . نيتشر ميثودز . 11 (8): 817-820 . doi : 10.1038/nmeth.3035 . PMC 4117646. PMID 25042786 .   
  34. ↑ ميورا ف، إينوموتو ي، دايريكي ر، إيتو ت (سبتمبر 2012). "تسلسل الجينوم الكامل باستخدام البيسلفيت دون تضخيم عن طريق وسم المحولات بعد البيسلفيت" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 40 (17): e136. doi : 10.1093/nar/gks454 . PMC 3458524. PMID 22649061 .  
  35. 1 2 غو هـ، تشو ب، وو إكس، لي إكس، وين إل، تانغ إف (ديسمبر 2013). " تحليل خرائط الميثيلوم للخلايا الجذعية الجنينية للفئران والأجنة المبكرة باستخدام تسلسل البيسلفيت ذي التمثيل المُخفَّض" . أبحاث الجينوم . 23 (12): 2126-2135 . doi : 10.1101/gr.161679.113 . PMC 3847781. PMID 24179143 .  
  36. ↑ غو هـ، سميث زد دي، بوك سي، بويل بي، غنيرك إيه، ميسنر إيه (أبريل 2011). "إعداد مكتبات تسلسل البيسلفيت ذات التمثيل المُخفَّض لتحليل مثيلة الحمض النووي على نطاق الجينوم". بروتوكولات الطبيعة . 6 (4): 468-481 . doi : 10.1038/nprot.2010.190 . PMID 21412275. S2CID 24912438 .  
  37. ↑ فو ي، لوه جي زد، تشين ك، دينغ إكس، يو إم، هان دي، وآخرون . (مايو 2015). " يشير N6-ميثيل ديوكسي أدينوزين إلى مواقع بدء النسخ النشطة في الكلاميدوموناس" . مجلة الخلية . 161 (4): 879-892 . doi : 10.1016/j.cell.2015.04.010 . PMC 4427561. PMID 25936837 .   
  38. ↑ بيولاورييه ج، شادت إي إي، فانغ ج (مارس 2019). " فك شفرة الإبيجينومات البكتيرية باستخدام تقنيات التسلسل الحديثة" . مراجعات الطبيعة. علم الوراثة . 20 (3): 157-172 . doi : 10.1038/s41576-018-0081-3 . PMC 6555402. PMID 30546107 .  
  39. ↑ غو هـ، تشو ب، يان ل، لي ر، هو ب، ليان ي، وآخرون . (يوليو 2014). "خريطة مثيلة الحمض النووي في الأجنة البشرية المبكرة". نيتشر . 511 (7511): 606-610 . Bibcode : 2014Natur.511..606G . doi : 10.1038/ nature13544 . PMID 25079557. S2CID 4450377 .   
  40. ↑ جكونتيلا إس، كاسترو جينر إف، سزكزيربا بي إم، فيتر إم، لاندين جيه، شيرير آر، وآخرون . (يناير 2019). "تجميع الخلايا السرطانية المنتشرة يشكل مثيلة الحمض النووي لتمكين زرع ورم خبيث" . خلية . 176 ( 1– 2): 98–112.هـ14. دوى : 10.1016/j.cell.2018.11.046 . بمك 6363966 . بميد 30633912 .   
  41. ↑ شتاين، ر. أ. (1 يوليو 2019). "تسلسل الخلية الواحدة يفحص العديد من البيانات الجينومية" . تم الاطلاع عليه في 1 أغسطس 2019 .
  42. 1 2 3 " شابيرو إي، بيزونر تي، لينارسون إس (سبتمبر 2013). "التقنيات القائمة على تسلسل الخلايا المفردة ستُحدث ثورة في علم الكائنات الحية الكاملة". مراجعات الطبيعة. علم الوراثة . 14 (9): 618-630 . doi : 10.1038/nrg3542 . PMID 23897237. S2CID 500845 .  "
  43. ↑ كولودزيجيك، أ.أ.، كيم، ج.ك.، سفينسون، ف.، ماريوني، ج.س.، تايخمان، س.أ. (مايو 2015). "تقنية وبيولوجيا تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية" . الخلية الجزيئية . 58 (4): 610-620 . doi : 10.1016/j.molcel.2015.04.005 . PMID 26000846 . 
  44. ↑ تاميلا تي، سيج جيه ​​(مارس 2020). " دراسة عدم تجانس الأورام في نماذج الفئران" . المراجعة السنوية لبيولوجيا السرطان . 4 (1): 99-119 . doi : 10.1146/annurev-cancerbio-030419-033413 . PMC 8218894. PMID 34164589 .  
  45. ↑ هاريس سي (2020). تحليل النسخ الجيني للخلايا المفردة في سرطان البروستاتا (ماجستير). جامعة أوتاغو. hdl : 10523/10111 .
  46. ↑ كيلديسيوت جي، خولوسي دبليو إم، يونغ إم دي، روبرتس كيه، إلمنتايت آر، فان هوف إس آر، وآخرون . (فبراير 2021). "مقارنات الحمض النووي الريبوزي المرسال للخلايا المفردة بين الورم والخلايا الطبيعية تكشف عن خلية سرطانية شاملة في الورم الأرومي العصبي" . ساينس أدفانسز . 7 (6) eabd3311. Bibcode : 2021SciA....7.3311K . doi : 10.1126/sciadv.abd3311 . PMC 7864567. PMID 33547074 .   
  47. ↑ كلاين إيه إم، مازوتيس إل، أكارتونا آي، تالابراجادا إن، فيريس إيه، لي في، وآخرون . (مايو 2015). " الترميز الشريطي للقطرات لتحليل النسخ أحادي الخلية المطبق على الخلايا الجذعية الجنينية" . مجلة Cell . 161 (5): 1187-1201 . doi : 10.1016/j.cell.2015.04.044 . PMC 4441768. PMID 26000487 .   
  48. ↑ ماكوسكو إي زد، باسو أ، ساتيجا ر، نيميش ج، شيخار ك، غولدمان م، وآخرون . (مايو 2015). " تحليل التعبير الجيني المتوازي للغاية على مستوى الجينوم للخلايا الفردية باستخدام قطرات نانولترية" . مجلة Cell . 161 (5): 1202-1214 . doi : 10.1016/j.cell.2015.05.002 . PMC 4481139. PMID 26000488 .   
  49. ↑ " هيبنستريت د (نوفمبر 2012). " أساليب وتحديات وإمكانيات تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية" . علم الأحياء . 1 (3): 658-667 . doi : 10.3390/biology1030658 . PMC 4009822. PMID 24832513 .  "
  50. ↑ تانغ ف، بارباتشورو س، وانغ ي، نوردمان إ، لي س، شو ن، وآخرون . (مايو 2009). "تحليل كامل النسخ الجيني لخلية واحدة باستخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA-Seq)". مجلة Nature Methods . 6 (5): 377-382 . doi : 10.1038/NMETH.1315 . PMID 19349980. S2CID 16570747 .   
  51. ↑ إسلام س، كيالكيست يو، مولينر أ، زاجاك ب، فان جيه بي، لونربيرغ ب، لينارسون س (يوليو 2011). " توصيف المشهد النسخي للخلايا المفردة باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبوزي عالي التعدد" . أبحاث الجينوم . 21 (7): 1160-1167 . doi : 10.1101/gr.110882.110 . PMC 3129258. PMID 21543516 .  
  52. ↑ رامسكولد د، لو س، وانغ واي سي، لي ر، دينغ كيو، فريداني أو آر، وآخرون . (أغسطس 2012). "تسلسل الحمض النووي الريبوزي الرسول كامل الطول من مستويات الحمض النووي الريبوزي على مستوى الخلية الواحدة وخلايا الورم المنتشرة الفردية" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 30 (8): 777-782 . doi : 10.1038/nbt.2282 . PMC 3467340. PMID 22820318 .   
  53. ↑ مورارو إم جي، دارمادهيكاري جي، جرون د، جروين إن، ديلين تي، يانسن إي، وآخرون . (أكتوبر 2016). "أطلس نسخة أحادية الخلية من البنكرياس البشري" . أنظمة الخلية . 3 (4): 385-394.e3. دوى : 10.1016/j.cels.2016.09.002 . بمك 5092539 . بميد 27693023 .   
  54. ↑ هاشمشوني ت، فاغنر ف، شير ن، ياناي إ (سبتمبر 2012). "CEL-Seq: تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية بواسطة التضخيم الخطي المتعدد" . تقارير الخلية . 2 (3): 666-673 . doi : 10.1016/j.celrep.2012.08.003 . PMID 22939981 . 
  55. ↑ سينغ م، العرياني ج، كارزويل س، فيرغسون ج م، بلاكبيرن ج، بارتون ك، وآخرون . (يوليو 2019). "التسلسل عالي الإنتاجية للخلايا المفردة المستهدفة طويلة القراءة يكشف عن المشهد النسيلي والنسخي للخلايا اللمفاوية" . نيتشر كوميونيكيشنز . 10 (1): 3120. Bibcode : 2019NatCo..10.3120S . doi : 10.1038/s41467-019-11049-4 . PMC 6635368. PMID 31311926 .   
  56. ↑ ساساغاوا واي، نيكيدو آي، هاياشي تي، دانو إتش، أونو كيه دي، إيماي تي، أويدا إتش آر (أبريل 2013). "Quartz-Seq: طريقة تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية عالية الحساسية وقابلة للتكرار، تكشف عن عدم تجانس التعبير الجيني غير الجيني" . علم الأحياء الجينومي . 14 (4): R31. doi : 10.1186/gb-2013-14-4-r31 . PMC 4054835. PMID 23594475 .  
  57. ↑ كونو تي، مودي جيه، كوون إيه تي، شيباياما واي، كاتو إس، هوانغ واي، وآخرون . (يناير 2019). "يكشف C1 CAGE عن مواقع بدء النسخ ونشاط المُحسِّن بدقة الخلية الواحدة" . نيتشر كوميونيكيشنز . 10 (1): 360. Bibcode : 2019NatCo..10..360K . doi : 10.1038/ s41467-018-08126-5 . PMC 6341120. PMID 30664627 .   
  58. ↑ دال مولين أ، دي كاميلو ب (يوليو 2019). "كيفية تصميم تجربة تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية: المخاطر والتحديات والآفاق". موجزات في المعلوماتية الحيوية . 20 (4): 1384-1394 . doi : 10.1093/bib/bby007 . hdl : 11577/3267609 . PMID 29394315 . 
  59. ↑ بيترسون، في. إم.، تشانغ، ك. إكس.، كومار، ن.، وونغ، ج.، لي، ل.، ويلسون، د. سي.، وآخرون . (أكتوبر 2017). "القياس الكمي المتعدد للبروتينات والنسخ في الخلايا المفردة". مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 35 (10): 936-939 . doi : 10.1038/nbt.3973 . PMID 28854175. S2CID 205285357 .   
  60. ↑ ستوكيوس م، هافيميستر س، ستيفنسون و، هوك-لوميس ب، تشاتوبادياي ب ك، سويردلو هـ، وآخرون . (سبتمبر 2017). " القياس المتزامن للمستضدات والنسخ الجيني في الخلايا المفردة" . نيتشر ميثودز . 14 (9): 865-868 . doi : 10.1038/nmeth.4380 . PMC 5669064. PMID 28759029 .   
  61. ↑ تريباثي إس جيه، توكر إل، بومكامب سي، مانكارسي بي أو، بلمداني إم، بافليديس بي (2018-10-08). "تقييم جودة النسخ الجيني في مجموعات بيانات Patch-Seq" . مجلة Frontiers in Molecular Neuroscience . 11 : 363. doi : 10.3389/fnmol.2018.00363 . PMC 6187980. PMID 30349457 .  
  62. ↑ كلارك، شيلا. "تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية: نظرة عامة تمهيدية وأدوات للبدء" . 10xgenomics.com .
  63. ↑ غوداباتي، هـ؛ داي، م؛ أوزبولات، إ (سبتمبر 2016). "مراجعة شاملة للطباعة الحيوية القائمة على القطرات: الماضي والحاضر والمستقبل" . مواد حيوية . 102 : 20-42 . doi : 10.1016/j.biomaterials.2016.06.012 . PMID 27318933 . 
  64. 1 2 غاو، سي؛ تشانغ، إم؛ تشين، إل (ديسمبر 2020). "مقارنة منصتي تسلسل الخلايا المفردة: BD Rhapsody و10x Genomics Chromium" . Current Genomics . 21 (8): 602–609 . doi : 10.2174/1389202921999200625220812 . PMC 7770630. PMID 33414681 .  
  65. ↑ "حلول التعبير الجيني للخلايا المفردة باستخدام تقنية الترميز الشريطي المميز" (ملف PDF) . 10xgenomics.com .
  66. ↑ وانغ، إكس؛ هي، واي؛ تشانغ، كيو؛ رين، إكس؛ تشانغ، زد (أبريل 2021). "تحليلات مقارنة مباشرة بين تقنيتي 10X Genomics Chromium و Smart-seq2" . علم الجينوم، علم البروتينات والمعلوماتية الحيوية . 19 (2): 253-266 . doi : 10.1016/j.gpb.2020.02.005 . PMC 8602399. PMID 33662621 .  
  67. ↑ كوك، هين؛ لوي، شوان. "الخلية المفردة (علم الجينوم 10X)" . CPOS HKUMed .
  68. ↑ هاغمان-جنسن م، عبد الله إ، ساندبرغ ر، فريداني أ.ر (أكتوبر 2018). "تقنية التسلسل الصغير لتسلسل الحمض النووي الريبوزي الصغير أحادي الخلية". بروتوكولات الطبيعة . 13 (10): 2407-2424 . doi : 10.1038/s41596-018-0049-y . PMID 30250291. S2CID 52813142 .  
  69. 1 2 هاياشي تي، أوزاكي إتش، ساساغاوا واي، أوميدا إم، دانو إتش، نيكيدو آي (فبراير 2018). "التسلسل الكامل للحمض النووي الريبوزي الكلي أحادي الخلية يكشف ديناميكيات التضفير المتكرر والحمض النووي الريبوزي المعزز" . نيتشر كوميونيكيشنز . 9 (1): 619. Bibcode : 2018NatCo...9..619H . doi : 10.1038/ s41467-018-02866-0 . PMC 5809388. PMID 29434199 .  
  70. ↑ أرمور سي دي، كاسل جيه سي، تشين آر، باباك تي، لورش بي، جاكسون إس، وآخرون (سبتمبر 2009). " تحليل النسخ الرقمي باستخدام التمهيد السداسي الانتقائي لتخليق الحمض النووي المكمل". نيتشر ميثودز . 6 (9): 647-649 . doi : 10.1038/nmeth.1360 . PMID 19668204. S2CID 12164981 .   
  71. ↑ لوي دي إس، يو إل، وو إيه آر (15 يناير 2021). " استنزاف فعال للرنا الريبوسومي لتسلسل الرنا الكلي أحادي الخلية بواسطة scDASH" . PeerJ . 9 e10717. doi : 10.7717/peerj.10717 . PMC 7812930. PMID 33520469 .  
  72. ↑ أمينت، سيث أ.؛ بولوبولوس، ألكسندروس (2023). "النسخة الجينية الخفية للدماغ: تسلسل الحمض النووي الريبوزي في الأجزاء البعيدة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية" . الرأي الحالي في علم الأحياء العصبي . 81 102725. doi : 10.1016/j.conb.2023.102725 . PMC 10524153. PMID 37196598 .  
  73. ↑ غريفيثز، جيه إيه، وسكيالدون، إيه، وماريوني، جيه سي (أبريل 2018). "استخدام علم الجينوم أحادي الخلية لفهم العمليات التطورية وقرارات مصير الخلية" . بيولوجيا الأنظمة الجزيئية . 14 (4) e8046. doi : 10.15252/msb.20178046 . PMC 5900446. PMID 29661792 .  
  74. ↑ راج ب، فاغنر دي إي، ماكينا أ، باندي إس، كلاين إيه إم، شندور ج، وآخرون . (يونيو 2018). "التحليل المتزامن للخلايا المفردة للسلالات وأنواع الخلايا في دماغ الفقاريات" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 36 (5): 442-450 . doi : 10.1038/nbt.4103 . PMC 5938111. PMID 29608178 .   
  75. ↑ أولموس د، أركيناو هـ ت، أنج ج إي، ليداكي إي، أتارد ج، كاردن س ب، وآخرون . (يناير 2009). "عدد الخلايا السرطانية المنتشرة (CTC) كمؤشرات وسيطة في سرطان البروستاتا المقاوم للإخصاء (CRPC): تجربة مركز واحد" . حوليات علم الأورام . 20 (1): 27-33 . doi : 10.1093/annonc/mdn544 . PMID 18695026 .  
  76. ↑ ليفيتين إتش إم، يوان جيه، سيمز بي إيه (أبريل 2018). " تحليل النسخ الجيني للخلايا المفردة لتغاير الأورام" . اتجاهات في السرطان . 4 (4): 264-268 . doi : 10.1016/j.trecan.2018.02.003 . PMC 5993208. PMID 29606308 .  
  77. ↑ جيربي-أرنون إل، شاه بي، كوكو إم إس، رودمان سي، سو إم جيه، ميلمز جيه سي، وآخرون . (نوفمبر 2018). "برنامج خلية سرطانية يعزز استبعاد الخلايا التائية ومقاومة حجب نقاط التفتيش المناعية" . مجلة Cell . 175 (4): 984–997.e24. doi : 10.1016/j.cell.2018.09.006 . PMC 6410377. PMID 30388455 .   
  78. ↑ نيو كي إي، تانغ كيو، ويلسون بي سي، خان إيه إيه (فبراير 2017). "علم جينوم الخلية المفردة: المناهج والفائدة في علم المناعة" . اتجاهات في علم المناعة . 38 (2): 140-149 . doi : 10.1016/j.it.2016.12.001 . PMC 5479322. PMID 28094102 .  
  79. ↑ ستيفنسون وآخرون (فبراير 2018). "تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية لأنسجة الغشاء الزلالي في التهاب المفاصل الروماتويدي باستخدام أجهزة ميكروفلويدية منخفضة التكلفة" . نيتشر كوميونيكيشنز . 9 (1): 791. Bibcode : 2018NatCo...9..791S . doi : 10.1038/s41467-017-02659- x . PMC 5824814. PMID 29476078 .   
  80. ↑ باريسيتش، داركو؛ تشين، كريستوفر ر.؛ ميدان، سيم؛ تياتر، مات؛ تسيالتا، إيوانا؛ ملينارتشيك، كورالين؛ تشادبورن، إيمي؛ وانغ، شوهاي؛ ساركوزي، مارغو؛ شيا، مين؛ كارسون، ساندرا إي.؛ راجيري، سانتو؛ ديبك، سونيا؛ بيلزر، بينيديكت؛ دورماز، سيدا (أبريل 2024). "ينظم ARID1A الارتباط المتسلسل لعوامل النسخ بوساطة SWI/SNF، حيث يؤدي فقدان ARID1A إلى تحديد مصير خلايا B قبل الذاكرة وتكوّن الأورام اللمفاوية" . Cancer Cell . 42 (4): 583–604.e11. doi : 10.1016/j.ccell.2024.02.010 . PMC 11407687 . PMID 38458187 .  
  81. ↑Kuppe C, Ibrahim MM, Kranz J, Zhang X, Ziegler S, Perales-Patón J, et al. (January 2021). "Decoding myofibroblast origins in human kidney fibrosis". Nature. 589 (7841): 281–286. Bibcode:2021Natur.589..281K. doi:10.1038/s41586-020-2941-1. hdl:20.500.11820/a0a63f61-934c-4036-80d7-79c2e3095885. PMC 7611626. PMID 33176333. S2CID 226309826.
  82. ↑Kuppe C, Flores RO, Li Z, Hannani M, Tanevski J, Halder M, et al. (2022-08-10). "Spatial multi-omic map of human myocardial infarction". Nature. 608 (7924): 766–777. Bibcode:2022Natur.608..766K. doi:10.1038/s41586-022-05060-x. ISSN 1476-4687. PMC 9364862. PMID 35948637.
  83. ↑Xiang R, Wang J, Chen Z, Tao J, Peng Q, Ding R, Zhou T, Tu Z, Wang S, Yang T, Chen J, Jia Z, Li X, Zhang X, Chen S, Cheng N, Zhao M, Li J, Xue Q, Zhang H, Jiang C, Xing N, Ouyang K, Pekny A, Michalowska MM, de Pablo Y, Wilhelmsson U, Mitsios N, Liu C, Xu X, Fan X, Pekna M, Pekny M, Chen X, Liu L, Mulder J, Wang M, Wang J (July 2025). "Spatiotemporal transcriptomic maps of mouse intracerebral hemorrhage at single-cell resolution". Neuron. 113 (13): 2102–2122.e7. doi:10.1016/j.neuron.2025.04.026. PMID 40412375.
  84. ↑Avraham R, Haseley N, Brown D, Penaranda C, Jijon HB, Trombetta JJ, et al. (September 2015). "Pathogen Cell-to-Cell Variability Drives Heterogeneity in Host Immune Responses". Cell. 162 (6): 1309–1321. doi:10.1016/j.cell.2015.08.027. PMC 4578813. PMID 26343579.
  85. ↑ بوسيل بن موشيه ن، هين أفيفي س، ليفيتين ن، يحزقيل د، أوستينغ م، جوستين ل أ، وآخرون . (يوليو 2019). "التنبؤ بنتائج العدوى البكتيرية باستخدام تحليل تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية للخلايا المناعية البشرية" . نيتشر كوميونيكيشنز . 10 (1): 3266. Bibcode : 2019NatCo..10.3266B . doi : 10.1038/s41467-019-11257- y . PMC 6646406. PMID 31332193 .   
  86. ↑ ميركاتيلي د، راي ف، جيورجي إف إم (2019). "نمذجة التغيرات الجينومية من خلال التعبير الجيني في جميع أنواع السرطان وعلى مستوى الخلية الواحدة" . فرونتيرز إن جينيتكس . 10 : 671. doi : 10.3389/fgene.2019.00671 . PMC 6657420. PMID 31379928 .  
  87. ↑ ريد إيه جيه، تالمان إيه إم، بينيت إتش إم، غوميز إيه آر، ساندرز إم جيه، إيلينغورث سي جيه، وآخرون . (مارس 2018). "يكشف تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية عن تباين نسخي خفي في طفيليات الملاريا" . eLife . 7 e33105. doi : 10.7554/eLife.33105 . PMC 5871331. PMID 29580379 .   
  88. ↑ بوران أ، نوتزل س، علي أ، مينسيا-ترينشانت ن، هاريس س ت، غوزمان م ل، وآخرون . (نوفمبر 2017). "تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية يكشف عن بصمة الالتزام الجنسي في طفيليات الملاريا" . نيتشر . 551 (7678): 95-99 . Bibcode : 2017Natur.551...95P . doi : 10.1038/nature24280 . PMC 6055935. PMID 29094698 .   
  89. ↑ غاش إيه بي، يو إف بي، هوز جيه، إسكالانتي إل إي، بليس إم، باخر آر، وآخرون (ديسمبر 2017). بالابان إن (محرر). "يكشف تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية عن عدم تجانس تنظيمي داخلي وخارجي في الخميرة المستجيبة للإجهاد" . مجلة PLOS Biology . 15 (12) e2004050. doi : 10.1371/journal.pbio.2004050 . PMC 5746276. PMID 29240790 .   
  90. ↑ كانغ واي، نوريس إم إتش، زارزيكي-سيك جيه، نيرمان دبليو سي، دوناتشي إس بي، هوانغ تي تي (يونيو 2011). "تضخيم النسخ من بكتيريا واحدة لتحليل النسخ الجيني" . أبحاث الجينوم . 21 (6): 925-935 . doi : 10.1101/gr.116103.110 . PMC 3106325. PMID 21536723 .  
  91. ↑ Cao J, Packer JS, Ramani V, Cusanovich DA, Huynh C, Daza R, et al. (أغسطس 2017). "تحليل شامل للتعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة لكائن متعدد الخلايا" . مجلة ساينس . 357 (6352): 661-667 . Bibcode : 2017Sci...357..661C . doi : 10.1126/science.aam8940 . PMC 5894354. PMID 28818938 .   
  92. ↑ بلاس م، سولانا ج، وولف ف.أ، أيوب س، ميسيوس أ، غلازار ب، وآخرون . (مايو 2018). "أطلس أنواع الخلايا وشجرة السلالة لحيوان معقد كامل باستخدام علم النسخ أحادي الخلية" . مجلة ساينس . 360 (6391) eaaq1723. doi : 10.1126/science.aaq1723 . PMID 29674432 .  
  93. ^ فينشر سي تي، ورتزل أو، دي هوغ تي، كرافاريك كيه إم، ريدين بي دبليو (مايو 2018). "أطلس النسخ من نوع الخلية للمستورقات Schmidtea mediterranea " . علوم . 360 (6391) eaaq1736. دوى : 10.1126/science.aaq1736 . بمك 6563842 . بميد 29674431 .  
  94. ↑ جيربر تي، موراوالا بي، كناب دي، ماسلينك دبليو، شويز إم، هيرمان إس، وآخرون . (أكتوبر 2018). "تحليل الخلية المفردة يكشف عن تقارب هويات الخلايا أثناء تجدد أطراف الأكسولوتل" . مجلة ساينس . 362 (6413) eaaq0681. Bibcode : 2018Sci...362..681G . doi : 10.1126/science.aaq0681 . PMC 6669047. PMID 30262634 .   
  95. ↑ لي، ن. د.، ودنلاب، ج. س.، وجونسون، ك.، وماريانو، ر.، وأوشيرو، ر.، وونغ، أ. ي.، وآخرون . (ديسمبر 2018). "الخريطة الجينية لمنطقة البلاستيما في أطراف الأكسولوتل البالغة المتجددة بدقة الخلية الواحدة" . نيتشر كوميونيكيشنز . 9 (1): 5153. Bibcode : 2018NatCo...9.5153L . doi : 10.1038/ s41467-018-07604-0 . PMC 6279788. PMID 30514844 .   
  96. ↑ فاغنر دي إي، واينريب سي، كولينز زد إم، بريغز جيه إيه، ميغاسون إس جي، كلاين إيه إم (يونيو 2018). " رسم خرائط التعبير الجيني والسلالة على مستوى الخلية الواحدة في جنين سمكة الزيبرا" . مجلة ساينس . 360 (6392): 981-987 . Bibcode : 2018Sci...360..981W . doi : 10.1126/science.aar4362 . PMC 6083445. PMID 29700229 .  
  97. ↑ فاريل، جيه. إيه.، وانغ، واي.، ريزنفيلد، إس. جيه.، شيخار، ك.، ريغيف، إيه.، شير، إيه. إف. (يونيو 2018). " إعادة بناء مسارات النمو على مستوى الخلية الواحدة خلال تكوين جنين سمكة الزيبرا" . مجلة ساينس . 360 (6392) eaar3131. doi : 10.1126/science.aar3131 . PMC 6247916. PMID 29700225 .  
  98. ↑ ظفر ح، لين س، بار-جوزيف ز (يونيو 2020). "تتبع سلالة الخلايا المفردة من خلال دمج طفرات CRISPR-Cas9 مع بيانات النسخ الجيني" . Nature Communications . 11 (1): 3055. Bibcode : 2020NatCo..11.3055Z . doi : 10.1038/s41467-020-16821-5 . PMC 7298005. PMID 32546686 .  
  99. ↑ بريغز، جيه. إيه.، واينريب، سي.، فاغنر، دي. إي.، ميغاسون، إس.، بيشكين، إل.، كيرشنر، إم. دبليو.، كلاين، إيه. إم. (يونيو 2018). " ديناميكيات التعبير الجيني في تكوين الأجنة الفقارية بدقة الخلية الواحدة" . مجلة ساينس . 360 (6392) eaar5780. doi : 10.1126/science.aar5780 . PMC 6038144. PMID 29700227 .  
  100. ↑ يو ج. "إنجاز العام في العلوم لعام 2018: تتبع التطور خلية تلو الأخرى" . مجلة ساينس . الجمعية الأمريكية لتقدم العلوم.
  101. ↑ تشانغ و، شيا س، تشونغ ش، غاو غ، يانغ ج، وانغ س، وآخرون . (سبتمبر 2022). "توصيف سمية الخصية الناجمة عن 2،2'،4،4'-رباعي بروم ثنائي فينيل الإيثر (BDE47) عبر تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية" . الطب السريري الدقيق . 5 (3) pbac016. doi : 10.1093/pcmedi/pbac016 . PMC 9306015. PMID 35875604 .   
  102. ↑ كوريموتو ك، يابوتا ي، أوهيناتا ي، سايتو م (2007). "تضخيم الحمض النووي التكميلي أحادي الخلية على مستوى العالم لتوفير قالب لتحليل المصفوفات الدقيقة للأوليغونوكليوتيدات عالية الكثافة". بروتوكولات الطبيعة . 2 (3): 739-752 . doi : 10.1038/nprot.2007.79 . PMID 17406636. S2CID 7404545 .  
  103. ↑ ياشيدا إس، جونز إس، بوزيتش آي، أنتال تي، ليري آر، فو بي، وآخرون . (أكتوبر 2010). "يحدث الانتشار البعيد في مراحل متأخرة من التطور الجيني لسرطان البنكرياس" . مجلة نيتشر . 467 (7319): 1114-1117 . Bibcode : 2010Natur.467.1114Y . doi : 10.1038/ nature09515 . PMC 3148940. PMID 20981102 .   
  104. ↑ فرومكين د، واسرستروم أ، إيتزكوفيتز س، هارملين أ، ريشافي ج، شابيرو إي (فبراير 2008). "تضخيم مواقع جينومية متعددة من خلايا مفردة معزولة بواسطة التشريح المجهري بالليزر للأنسجة" . مجلة BMC للتكنولوجيا الحيوية . 8 (17): 17. doi : 10.1186/1472-6750-8-17 . PMC 2266725. PMID 18284708 .  
  105. ↑ داليربا ب، كاليسكي ت، ساهو د، راجندران ب س، روثنبرغ م إ، ليرات أ أ، وآخرون . (نوفمبر 2011). "تحليل التباين الجيني في أورام القولون البشري على مستوى الخلية الواحدة" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 29 (12): 1120-1127 . doi : 10.1038/nbt.2038 . PMC 3237928. PMID 22081019 .   
  106. ↑ وايت إيه كيه، فان إنسبرغ إم، بيتريف أو آي، حميدي إم، سيكورسكي دي، مارا إم إيه، وآخرون . (أغسطس 2011). "تقنية RT-qPCR عالية الإنتاجية للخلايا المفردة باستخدام الموائع الدقيقة" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 108 (34): 13999-14004 . Bibcode : 2011PNAS..10813999W . doi : 10.1073 / pnas.1019446108 . PMC 3161570. PMID 21808033 .   
  107. ↑ زيغينهاين، كريستوف؛ فيث، بيات؛ باريك، سواتي؛ رينيوس، بيورن؛ غيوميه-أدكينز، آمي؛ سميتس، مارثا؛ ليونهاردت، هاينريش؛ هاين، هولغر؛ هيلمان، إينيس؛ إينارد، وولفغانغ (فبراير 2017). "تحليل مقارن لطرق تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية". الخلية الجزيئية . 65 (4): 631-643.e4. doi : 10.1016/j.molcel.2017.01.023 . hdl : 10230/34928 . PMID 28212749 .