عدد المستعمرات الافتراضية

📅 آخر تحديث: ٢٧ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٧ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 4 صور
الموسوعة الحرة

يُعدّ عدّ المستعمرات الافتراضي ( VCC ) اختبارًا حركيًا ميكروبيولوجيًا يُجرى في 96 بئرًا، وقد طُوّر في الأصل لقياس نشاط الديفينسينات . [ 1 ] ومنذ ذلك الحين، طُبّق على ببتيدات مضادة للميكروبات أخرى ، بما في ذلك LL-37 . [ 2 ] يعتمد هذا الاختبار على طريقة لحساب البكتيريا تُسمى حركية النمو الكمي، والتي تُقارن الوقت اللازم لمزرعة بكتيرية دفعة للوصول إلى عتبة كثافة ضوئية معينة مع الوقت اللازم لسلسلة من منحنيات المعايرة. كما استُخدم اسم VCC لوصف تطبيق حركية النمو الكمي لحساب البكتيريا في نماذج عدوى مزارع الخلايا. [ 3 ] يُمكن إجراء اختبار حساسية المضادات الحيوية (AST) على صفائح 96 بئرًا عن طريق تخفيف العامل المضاد للميكروبات بتراكيز مختلفة في مرق مُلقّح بالبكتيريا وقياس الحد الأدنى للتركيز المثبط الذي لا يُؤدي إلى أي نمو. ومع ذلك، لا يُمكن استخدام هذه الطرق لدراسة بعض الببتيدات المضادة للميكروبات النشطة على الأغشية ، والتي يُثبّطها المرق نفسه. تستغل طريقة العد الافتراضي للمستعمرات هذه الحقيقة، حيث تُعرَّض الخلايا البكتيرية أولًا للعامل المضاد للميكروبات النشط في محلول منخفض الملوحة لمدة ساعتين، ثم تُثبَّط فعالية العامل المضاد للميكروبات وتُحفَّز النمو الأسي في الوقت نفسه بإضافة مرق مغذي. بعد ذلك، يمكن مراقبة حركية نمو الخلايا الباقية باستخدام قارئ لوحات مضبوط الحرارة . ثم يُحوَّل الوقت اللازم لكل منحنى نمو للوصول إلى عتبة تغير في الكثافة الضوئية إلى قيم بقاء افتراضية، تُستخدم كمقياس لفعالية العامل المضاد للميكروبات.

اختبار حساسية المضادات الحيوية

توجد طرق لاختبار فعالية المضادات الحيوية المضادة للبكتيريا منذ عقود عديدة. [ 4 ] [ 5 ] تتضمن هذه الطرق عادةً تعريض البكتيريا للمضاد الحيوي في وجود مغذيات تسمح بنمو البكتيريا بشكل جيد. يمكن إجراء التجارب إما على أطباق تحتوي على الآجار كدعامة صلبة، أو في مرق سائل بدون آجار. [ 6 ] وقد طُوِّرت العديد من المضادات الحيوية ذات الجزيئات الصغيرة باستخدام هذه الطرق. مع ذلك، ظهرت مشكلة عندما أراد الباحثون دراسة فعالية بعض الببتيدات المضادة للبكتيريا، لأنها تُثبَّط في الأوساط الغنية، سواءً وُضِعت على طبق آجار أو في مرق. على سبيل المثال، الديفينسينات هي ببتيدات مضادة للميكروبات تُعد جزءًا من جهاز المناعة الفطرية للعديد من الكائنات الحية، بما في ذلك الإنسان. وهي تُقسَّم إلى عدة فئات هيكلية، منها ألفا وبيتا وثيتا، بناءً على نمط روابط ثنائي الكبريتيد. توجد أربعة أنواع من ديفينسينات ألفا البشرية في حبيبات العدلات ، وتُعرف باسم ببتيدات العدلات البشرية (HNP) 1-4. في المراحل الأولى لدراسة الديفينسينات، اكتُشف أن تركيزات الأملاح الفسيولوجية تُثبّط بشدة عمل هذه الببتيدات. لقياس النشاط المضاد للميكروبات، كان لا بد من حضنها مع الخلايا في محلول ملحي منخفض التركيز كخطوة أولية منفصلة، ​​قبل إضافة وسط غذائي غني يسمح بحساب عدد الخلايا المتبقية. ولأنه لا توجد طريقة لتحليل ببتيدات مثل ديفينسين HNP1 في وجود تركيزات ملحية فسيولوجية، فإن أي تحليل يقيس نشاط HNP1 يستخدم ظروفًا مختلفة عن تلك الموجودة في الجسم.

تعداد المستعمرات التقليدي

إحدى الطرق الشائعة لقياس النشاط المضاد للميكروبات في السوائل هي تعريض الخلايا للعامل المضاد للميكروبات خلال فترة حضانة، كساعتين مثلاً، ثم عدّ الخلايا المتبقية بتخفيف المزيج ونشر جزء منه على طبق أجار يحتوي على وسط غذائي غني. [ 2 ] تُجرى عملية الحضانة عادةً في صفيحة ذات 96 بئراً. بعد النشر، تُحضن أطباق الأجار طوال الليل، ويُحسب عدد وحدات تكوين المستعمرات (CFU) في اليوم التالي. لهذه الطرق عدة عيوب، منها عدم الدقة الناتجة عن التخفيف، واحتمالية الحاجة إلى عدد كبير من أطباق الأجار للحصول على عدد مقبول من المستعمرات في كل طبق. [ 7 ] تجدر الإشارة إلى أنه لقياس النشاط المضاد للميكروبات لعوامل مثل الديفينسينات، تُجرى عملية الحضانة لمدة ساعتين في محلول منظم منخفض الملوحة، مثل فوسفات الصوديوم بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 7.4.

الحد الأدنى للتركيز المثبط

تُستخدم طريقة أخرى شائعة لقياس النشاط المضاد للميكروبات في السوائل، وهي تعريض الخلايا لسلسلة تخفيف من العامل المضاد للميكروبات في مرق غني، مثل مرق مولر-هينتون (MHB)، في صفيحة ذات 96 بئرًا، ثم حضن الصفيحة عند درجة حرارة 37  درجة مئوية طوال الليل. ستتعكر كل بئر إما بنمو البكتيريا أو تبقى صافية. يُسجل الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) على أنه أقل تركيز يُنتج بئرًا صافيًا، وبالتالي يثبط النمو. [ 8 ] لا تُطبق طرق MIC المعيارية باستخدام مرق مولر-هينتون على العوامل المضادة للميكروبات مثل الديفينسينات، لأن الديفينسينات يجب حضنها في محلول ملحي منخفض التركيز، وليس في مرق غني، لقياس نشاطها.

عدد المستعمرات الافتراضية

يمكن تعديل طريقة عد المستعمرات التقليدية لقياس النشاط المضاد للميكروبات في صفيحة 96 بئرًا دون الحاجة إلى أخذ عينات من الآبار ونشر الخلايا الباقية على أطباق الآجار، وذلك ببساطة عن طريق إضافة حجم مساوٍ من مرق مُركّز مرتين بعد ساعتين من الحضانة في محلول ملحي منخفض التركيز. يلزم إيجاد طريقة لتحديد عدد الخلايا الباقية في نهاية فترة الحضانة باستخدام مزارع الدفعات. لحسن الحظ، توفر رياضيات النمو الأسي طريقةً لتحقيق ذلك. إذا تمت مراقبة العكارة، أو الكثافة الضوئية، لمزارع الدفعات داخل صفيحة 96 بئرًا في الوقت الفعلي، وتم تسجيل الوقت اللازم لوصول البئر إلى عتبة معينة، ومعرفة زمن تضاعف الخلايا النامية أُسّيًا، فإنه يمكن حساب عدد الخلايا الموجودة أصلاً في اللقاح. هذا العدد الابتدائي من الخلايا يساوي عدد الخلايا الباقية في نهاية ساعتين من الحضانة مع العامل المضاد للميكروبات. لأن هذه العملية لا تتطلب تكوين مستعمرات أو عدّها فعليًا، تُسمى "العدّ الافتراضي للمستعمرات". حتى الآن، اقتصر استخدام تقنية العدّ الافتراضي للمستعمرات على الببتيدات المضادة للميكروبات. ويمكن تطبيقها مع عوامل مضادة للميكروبات أخرى، شريطة أن يُعطّل مرق مولر-هينتون المُركّز مرتين فعالية العامل المضاد للميكروبات. تستطيع طريقة العدّ الافتراضي للمستعمرات الكشف عن النشاط القاتل للبكتيريا أو المُثبّط لنموها، لكنها لا تستطيع التمييز بينهما. مع ذلك، يمكن قياس النشاط المُثبّط لنمو البكتيريا كميًا عن طريق قياس الفرق في أوقات العتبة بين عنصري التحكم "المدخل" و"المخرج" (انظر أدناه).

إجراء مختبري عام للاستخدام في فحوصات VCC

إجراء العد الافتراضي للمستعمرات

تُلقّح مزرعة بكتيرية بحجم 2 مل من مستعمرة واحدة وتُزرع طوال الليل في وسط فوسفات مولر-هينتون (PMH) أو وسط فوسفات مولر-هينتون مع مرق الصويا التريبتيكي (PMHT). يتكون وسط PMH من مزيج بنسبة 1:1 من مرق مولر-هينتون و10 ملي مولار من فوسفات الصوديوم عند درجة حموضة 7.4. يمكن استخدام وسط MHB مُعدّل أو غير مُعدّل من حيث الكاتيونات. في بعض التجارب، أُضيف 1% من مرق الصويا التريبتيكي (TSB) إلى محلول الفوسفات لتعزيز نشاط الديفينسين خلال فترة الحضانة التي تستغرق ساعتين؛ في هذه الحالة، احتوى المزيج المماثل بنسبة 1:1 من المحلول والمرق على 0.5% من مرق الصويا التريبتيكي، ويُسمى PMHT. يُنقل 250 ميكرولتر من هذه المزرعة إلى 25 مل من وسط PMH في قارورة ترشيح للاستخدام مرة واحدة سعتها 125 مل. تُزرع هذه المزرعة عند درجة حرارة 37  درجة مئوية مع رجّها بسرعة 250 دورة في الدقيقة لمدة تتراوح عادةً بين ساعتين وثلاث ساعات، حتى تصل الكثافة الضوئية للمزرعة عند 650  نانومتر إلى ما بين 0.45 و0.55. في هذه الأثناء، تُخفف الببتيدات المضادة للميكروبات في صفيحة ذات 96 بئرًا (Costar 3595، وهي صفيحة مُعالجة لزراعة الأنسجة) في محلول فوسفات الصوديوم بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 7.4، بحيث يكون الحجم النهائي 90 ميكرولترًا. تم تعريف وحدات تكوين المستعمرات الافتراضية (CFUv) في منشور VCC الأصلي [ 1 ] ، ويُعاد تعريفها هنا: تم تثبيت قيمة CFUv بين السلالات الست المختبرة بحيث تكون العكارة، وبالتالي كمية غشاء الخلية، متساوية تقريبًا في كل تجربة. ولأن قيمة CFUv تم توحيدها وفقًا لوحدات تكوين المستعمرات لبكتيريا الإشريكية القولونية ATCC 25922، فإنه يمكن الإبلاغ عن وحدات تكوين المستعمرات (CFU) لهذه السلالة، وليس CFUv. في الجزء التجريبي من التحليل، تُخفف الخلايا في محلول فوسفات الصوديوم بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 7.4، بحيث يكون تركيز الخلايا النهائي في 10 ميكرولترات 5 ملايين وحدة تشكيل مستعمرة/مل. يُسحب 10 ميكرولترات من هذا المعلق الخلوي ويُوضع أسفل 90 ميكرولترًا من محلول الببتيدات المضادة للميكروبات، مما ينتج عنه معلق خلوي بتركيز قياسي قدره 5 × 10⁵ وحدة تشكيل مستعمرة/مل أثناء تعريض الخلايا للببتيدات المضادة للميكروبات. تُستخدم عدة آبار من صفيحة 96 بئرًا كضوابط، حيث لا تتعرض هذه الآبار لأي عامل مضاد للميكروبات؛ وتُسمى هذه الضوابط "ضوابط الإخراج". بعد ذلك، تُحضن صفيحة 96 بئرًا لمدة ساعتين في جهاز قراءة الصفائح، مع ضبطه على الرج وأخذ القراءات كل خمس دقائق. خلال فترة التحضين هذه، حُفظت مزرعة البذور على الجليد. لإنشاء منحنى معايرة، أُضيف 1 مل من مزرعة البذور إلى 1.5 مل من وسط PMH بعد ساعتين من التحضين، لتكوين معلق بتركيز 10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة/مل. ثم أُجريت سلسلة تخفيف عشرية لهذا المعلق، تتراوح تركيزاتها من 10⁷ إلى 10⁰ وحدة تشكيل مستعمرة /مل، في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر من وسط PMH، موزعة على ثمانية آبار من صفيحة 96 بئرًا. في هذه المرحلة، أُضيفت خلايا غير معرضة لأي عامل مضاد للميكروبات إلى عدة آبار من الصفيحة، من المزرعة المحفوظة على الجليد؛ وتُسمى هذه الخلايا ضوابط "الإدخال"، لأنها تُشير إلى عدد الخلايا الموجودة في بداية فترة التحضين التي استمرت ساعتين. في تجارب VCC المنشورة سابقًا [ 1 ]استُخدمت فقط الآبار الستين الداخلية من الصفيحة، نظرًا لتغير حجم الآبار الطرفية بفعل التبخر خلال فترة الحضانة التي استمرت 12 ساعة. مع ذلك، يمكن استخدام جميع الآبار الـ 96 في صفيحة الـ 96 بئرًا للتجربة، شريطة تغليف حافة الصفيحة بقطعة من غشاء بارافين M، طولها ستة مربعات وعرضها نصف مربع. يُبطئ غشاء البارافين، النفاذ للغازات، التبخر مع السماح بالتنفس الخلوي ومنع دخول الجسيمات إلى صفيحة الـ 96 بئرًا في جهاز قراءة الصفائح. بعد تغليف الصفيحة بالبارافين، تُنقل من خزانة السلامة البيولوجية إلى جهاز قراءة الصفائح. وقد استُخدمت بنجاح عدة نماذج من أجهزة قراءة الصفائح ذات التحكم في درجة الحرارة في فحوصات VCC، بما في ذلك جهاز Molecular Devices Vmax المحفوظ في غرفة دافئة، وجهاز Molecular Devices Spectramax، وجهاز Tecan Infinite M1000. يُضبط جهاز قراءة الصفائح لقراءة الكثافة الضوئية عند 650  نانومتر كل 5 دقائق لمدة 12 ساعة، مع رجه قبل كل قراءة. يتم استيراد البيانات الأولية إلى برنامج Microsoft Excel، حيث يتم تشغيل الماكرو VCC Calculate لتحديد الوقت اللازم لكل منحنى نمو للوصول إلى عتبة الكثافة البصرية البالغة 0.02.

حركية النمو الكمية

منحنيات معايرة VCC

تُعرف طريقة تعداد الخلايا الباقية [ 9 ] المستخدمة في VCC باسم حركية النمو الكمية (QGK). وهي تربط الوقت الحركي اللازم لوصول عكارة مزرعة بكتيرية ميكروبيولوجية في بئر من صفيحة ميكروبية ذات 96 بئراً إلى فرق عتبة في العكارة بسلسلة تخفيف عشرية لمنحنيات نمو المعايرة.

يتم تحديد عدد الخلايا الحية باستخدام عملية مطابقة رياضياً لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (QPCR)، باستثناء أن خلايا QGK ، بدلاً من نسخ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل، تنمو أُسّياً. يُطلق على الوقت اللازم للوصول إلى العتبة اسم "وقت العتبة" (T<sub> t</sub> )، وهو ما يُعادل قيمة "وقت الدورة" (C<sub> t</sub> ) في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي .

هناك خمس عمليات على الأقل تتسبب في تأخيرات في أوقات العتبة في فحوصات VCC:

  1. يؤدي الالتصاق إلى التصاق الخلايا بالصفيحة الدقيقة، وربما تكوين أغشية حيوية . ما لم تكن هذه الخلايا موجودة مباشرة في مسار الضوء، فلن يؤثر نموها على قراءات الكثافة الضوئية.
  2. يؤدي التماسك إلى تجمع الخلايا في كتل بأحجام مختلفة بدلاً من معلق متجانس من الخلايا الفردية التي تخضع للانشطار الثنائي . يمكن أن يتسبب التماسك في عدم دقة وتقلبات في زمن الاسترخاء T t . قد تكون الكتل المتماسكة أيضًا لاصقة، مما يؤدي إلى عدم دقة بسبب التماسك وعدم دقة (زيادة زمن الاسترخاء T t ) بسبب الالتصاق.
  3. النشاط المثبط لنمو البكتيريا ، مما يجعل الخلايا غير قادرة على الدخول في مرحلة النمو الأسي حتى وإن لم تُقتل. يمكن أن يتسبب النشاط المثبط لنمو البكتيريا العابر في فترات تأخير، مما يزيد من زمن النمو (T t) .
  4. مرحلة التباطؤ الأيضي لنمو البكتيريا . من المتوقع حدوث هذه المرحلة في الاختبار، حيث تتحول الخلايا التي تنمو ببطء أو لا تنمو إطلاقًا خلال التعرض الأولي للببتيدات المضادة للميكروبات في محلول منخفض الملوحة إلى النمو الأسي عند إضافة وسط غني مُركّز مرتين. إذا زادت هذه المرحلة الأيضية في وجود الببتيد المضاد للميكروبات، فيمكن اعتبارها شكلًا من أشكال النشاط المُثبِّط للبكتيريا العابر في الفئة 3 المذكورة أعلاه، على الرغم من إمكانية وجود مصادر أخرى لهذا النشاط، مثل التأخير الناتج عن الوقت اللازم لإصلاح تراكيب الخلية التالفة كالجدران الخلوية أو الأغشية الخلوية .
  5. النشاط المبيد للبكتيريا ، أو القتل. يؤدي انخفاض عدد الخلايا الباقية إلى تأخير في زمن التعكر (T t) ، حيث تستغرق الخلايا الباقية وقتًا أطول لإنتاج نفس كمية التعكر من خلال النمو الأسي. إذا كانت جميع العمليات الأخرى التي تسبب زيادة في زمن التعكر ضئيلة ، يصبح اختبار VCC اختبارًا مبيدًا للبكتيريا، ويمكن استخدام زمن التعكر (T t) لحساب عدد البكتيريا الحية بواسطة QGK. في هذه الحالة المبسطة، تكون نتائج "البقاء الافتراضي" لاختبار VCC مكافئة لنتائج "البقاء" لاختبار مبيد البكتيريا التقليدي القائم على عد المستعمرات.

البكتيريا

استُخدمت تقنية VCC في البداية لتحديد كمية النشاط المضاد للبكتيريا للببتيدات ضد ست سلالات من الإشريكية القولونية ، والمكورات العنقودية الذهبية ، والعصوية الشمعية ، والمعوية الهوائية . [ 1 ] عادةً، تتم مقارنة سلالتين قياسيتين من البكتيريا سالبة الغرام وموجبة الغرام كعينة مرجعية للجودة . استُخدمت الإشريكية القولونية ATCC 25922 والمكورات العنقودية الذهبية ATCC 29213 كسلالتين قياسيتين سالبة الغرام وموجبة الغرام، على التوالي. كما طُبقت تقنية VCC على العصوية الجمرية ، المسبب لمرض الجمرة الخبيثة . [ 10 ] بالإضافة إلى ذلك، طُبقت تقنية VCC على السالمونيلا المعوية نمط مصلي التيفيموريوم [ 11 ] والأسينيتوباكتر بوماني . [ 12 ]

الببتيدات المضادة للميكروبات

قامت الدراسة الأولية لعدّ المستعمرات الافتراضية بقياس نشاط جميع أنواع الديفينسينات ألفا البشرية الستة في وقت واحد على نفس الصفيحة ذات 96 بئرًا: HNP1 ، و HNP2 ، وHNP3 ، وHNP4 ، و HD5 ، و HD6 . [ 1 ] لاحقًا، دُرست أشكال متحولة من بعض هذه الديفينسينات الستة باستخدام تقنية عدّ المستعمرات الافتراضية. استُبدل جليسين محفوظ في انتفاخ بيتا في HNP2 بسلسلة من الأحماض الأمينية D، مما أدى إلى نشاط عدّ المستعمرات الافتراضية يتناسب مع كراهية الماء والشحنة للسلسلة الجانبية. [ 13 ] أظهرت تقنية عدّ المستعمرات الافتراضية أن نشاط HNP2 المُؤَسْتَل من الطرف الأميني و/أو المُؤَمَّد من الطرف الكربوكسيلي يتناسب مع الشحنة الكهروستاتيكية . [ 14 ] كانت نتائج تقنية عدّ المستعمرات الافتراضية متناسبة مع الشحنة لسلسلة من الطفرات المُعطِّلة للجسر الملحي، مما يشير إلى أن الجسر الملحي ليس ضروريًا لوظيفة HNP2. [ 15 ] قاس VCC أهمية القطع الطرفية N الطبيعية والاصطناعية للببتيد الأولي HNP1، مما أدى إلى تغيير كبير في النشاط ضد الإشريكية القولونية والمكورات العنقودية الذهبية . [ 16 ] [ 17 ] أشارت الأشكال المتماثلة لـ HNP1 وHNP4 وHD5 وبيتا -ديفينسين 2، المكونة بالكامل من أحماض أمينية D، إلى آليات مختلفة لنشاط الديفينسين ضد البكتيريا موجبة وسالبة الجرام . [ 18 ] أظهرت نتائج VCC لأشكال HNP1 أحادية الوحدة المعاقة وثنائية الوحدة المرتبطة أهمية عملية التثني . [ 19 ] أدى استبدال الجليسين المحفوظ بالألانين L إلى اختلافات طفيفة في VCC. [ 20 ] أظهرت الطفرات الشاملة باستخدام مسح الألانين لـ HNP1 [ 21 ] [ 22 ] وHD5 [ 23 ] أهمية البقايا الكارهة للماء الضخمة. أدى اختزال روابط ثنائي الكبريتيد في HD5 إلى إضعاف نشاط VCC ولكنه عزز نشاط ارتباط الليبوبوليسكاريد ضد ثلاثة سلالات من البكتيريا سالبة الغرام. [ 11 ] أظهرت متغيرات HD5 التي تحتوي على رابطة ثنائي كبريتيد واحدة أو لا تحتوي على روابط ثنائي كبريتيد انخفاضًا كبيرًا في نشاط VCC ضد بكتيريا A. baumanniiفي حين أظهر مشتق مبسط من HD5، تم إنشاؤه عن طريق اختزال روابط ثنائي الكبريت وإدخال الأرجينين، فعالية قوية ضد سلالة مقاومة للأدوية المتعددة من بكتيريا A. baumannii . [ 12 ] وقد توسعت هذه الدراسات لتشمل ديفينسينات بيتا إضافية ، وديفينسينات ثيتا ، [ 10 ] والكاتيليسيدين البشري LL-37 والببتيدات ذات الصلة. [ 2 ] وأظهرت نتائج العد الافتراضي للمستعمرات في دراسة أجريت على كريبتدينات الفئران أن قتل بكتيريا E. coli بواسطة الكريبتدينات مستقل عمومًا عن بنيتها الثالثية والرابعية المهمة لقتل بكتيريا S. aureus ، مما يشير إلى آليتي عمل متميزتين. [ 24 ]

تأثير اللقاح

وُصِفَ سابقًا تأثير حجم اللقاح للعديد من العوامل المضادة للميكروبات، حيث يقلّ تأثير العامل عند إضافة المزيد من البكتيريا إلى الاختبار. [ 25 ] ويُلاحَظ هذا التأثير غالبًا مع مضادات البيتا لاكتام عند اختبارها ضد البكتيريا المنتجة لإنزيم بيتا لاكتاماز. وكان تأثير حجم اللقاح ذا صلة محتملة بدراسة أجريت على HNP1 وpro LL-37 وLL-37، والتي شملت كلًا من عدّ المستعمرات التقليدي واختبار VCC جنبًا إلى جنب. [ 2 ] في ذلك التقرير، وُجِدَ أن قيم بقاء البكتيريا في اختبار عدّ المستعمرات التقليدي كانت أقل من قيم البقاء الافتراضية لجميع الببتيدات والسلالات المختبرة. ولأن حجم لقاح البكتيريا كان أكبر بعشرين ضعفًا في اختبار VCC مقارنةً ببروتوكول عدّ المستعمرات التقليدي المُستخدم، فقد يكون هذا الاختلاف ناتجًا عن تأثير حجم اللقاح، على الرغم من أن هذا التأثير سيكون عكس تأثير حجم اللقاح الذي يُلاحَظ عادةً مع العوامل المضادة للميكروبات الأخرى، حيث أظهر حجم اللقاح الأكبر نشاطًا أكبر. تم التحقق من هذه الإمكانية في سلسلة من تجارب VCC، مع التركيز بشكل أساسي على بروتين الدفاع HNP1 وسلالات البكتيريا E. coli وS. aureus و B. cereus . وأظهرت نتائج ست تجارب تأثيرًا ملحوظًا لـ HNP1 على بكتيريا E. coli عند تلقيحها . [ 26 ]

خوارزميات لتحليل حركية النمو الكمية

نُشرت جداول بيانات معقدة من مايكروسوفت إكسل تُستخدم لحساب قيم البقاء الافتراضي والجرعة المميتة الافتراضية، بالإضافة إلى ماكرو فيجوال بيسك يُستخدم لحساب أوقات العتبة. [ 26 ] كما تم إيداع جداول البيانات والماكرو على منصة جيت هاب. [ 27 ]

تقنية آمنة وفعالة للمعايرة

يُنصح مستخدمو جهاز VCC بنقل الخلايا في حجم صغير، مثل 10 ميكرولتر، أسفل حجم أكبر، مثل 90 ميكرولتر، على غرار منحنيات معايرة QGK الموضحة أعلاه ومنحنيات المعايرة الواردة في منشور VCC الأولي [ 1 ] ، ولكن على عكس الإجراء التجريبي المستخدم لاختبار نشاط الديفينسين في نفس الورقة. وُصفت تقنية السحب المحسّنة في عام 2011 في دراسة مسببات الأمراض من المستوى الثالث للسلامة البيولوجية (BSL-3)، وهي بكتيريا الجمرة الخبيثة (Bacillus anthracis ) [ 10 ] . تضمنت الطريقة الأصلية المنشورة في عام 2005 نقل 50 ميكرولتر من معلقات الخلايا إلى 50 ميكرولتر من السائل، مما يُولّد رغوة وفقاعات وعكارة لا تتوافق مع طريقة قياس العكارة عند نقل الخلايا مباشرةً إلى قاع الآبار أسفل محاليل الفوسفات العازلة. تجنب هذه المشكلة بإضافة معلقات الخلايا على شكل قطرات من الأعلى قد يُسبب رذاذًا يؤدي إلى التلوث المتبادل. [ 28 ] يمكن أن تشكل الهباءات الحيوية للبكتيريا الخطرة أيضًا مخاطر تتعلق بالسلامة يمكن تقليلها عن طريق إجراء التجارب داخل خزانة السلامة البيولوجية .

مراجع

قُدِّمَت هذه المقالة إلى ويكي جورنال أوف ساينس للمراجعة الأكاديمية الخارجية من قِبَل النظراء في عام ٢٠١٩ ( تقارير المراجعين ). أُعيد دمج المحتوى المُحدَّث في صفحة ويكيبيديا بموجب ترخيص CC-BY-SA-3.0 ( ٢٠٢١ ). النسخة المُعتمدة بعد المراجعة هي: برايان إريكسن وآخرون (١٦ فبراير ٢٠٢٠). "العد الافتراضي للمستعمرات" (ملف PDF) . ويكي جورنال أوف ساينس . ٣ (١): ٣. doi : 10.15347/WJS/2020.003 . ISSN 2470-6345 . Wikidata Q86161728 .   

  1. 1 2 3 4 5 6 إريكسن ب، وو ز، لو و، ليرر ر.إ (2005). "النشاط المضاد للبكتيريا وخصوصية ستة من ديفينسينات ألفا البشرية" . مضادات الميكروبات والعلاج الكيميائي . 49 (1): 269-275 . doi : 10.1128/AAC.49.1.269-275.2005 . PMC 538877. PMID 15616305 .  
  2. بازجير م ، إريكسن ب، لينغ م، توث إي أ، شي ج ، لي إكس، غاليير-بيكيلي أ، لان ل، زو ج، زان سي، يوان و، بوزارسكي إي، لو و (2013). " التحليل البنيوي والوظيفي للنطاق الأولي من الكاثيليسيدين البشري، LL-37" . الكيمياء الحيوية . 52 (9): 1547-1558 . doi : 10.1021/bi301008r . PMC 3634326. PMID 23406372 .  
  3. ↑ هوفمان إس، والتر إس، بلوم إيه كيه، فوكس إس، شميدت سي، شولز إيه، جيرلاخ آر جي (2018). " القياس الكمي عالي الإنتاجية لتفاعلات الخلايا البكتيرية باستخدام تعداد المستعمرات الافتراضي" . فرونت سيل إنفكت ميكروبيول . 8 (43): 43. doi : 10.3389/fcimb.2018.00043 . PMC 5818393. PMID 29497603 .  
  4. ↑ جينكينز إس جي، شوتز إيه إن (2012). " المفاهيم الحالية في الاختبارات المعملية لتوجيه العلاج المضاد للميكروبات" . وقائع مايو كلينيك . 87 (3): 290-308 . doi : 10.1016/j.mayocp.2012.01.007 . PMC 3496983. PMID 22386185 .  
  5. ↑ يورغنسن جيه إتش، فيرارو إم جيه (2009). "اختبار حساسية المضادات الحيوية: مراجعة للمبادئ العامة والممارسات المعاصرة" . مجلة الأمراض المعدية السريرية . 49 (11): 1749-1755 . doi : 10.1086/647952 . PMID 19857164 . 
  6. ↑ جانو ك، بليسيات ب (2014). "اختبار حساسية الأدوية بطرق التخفيف". طرق وبروتوكولات الزائفة . طرق البيولوجيا الجزيئية. المجلد 1149. الصفحات 49-58 . doi : 10.1007/978-1-4939-0473-0_6 . ISBN   978-1-4939-0472-3PMID 24818896​​ 
  7. ↑ بريد آر إس، دوتيرر دبليو دي (1916). "عدد المستعمرات المسموح به على أطباق الآجار المرضية" . مجلة علم البكتيريا . 1 (3): 321-331 . doi : 10.1128/JB.1.3.321-331.1916 . PMC 378655. PMID 16558698 .  
  8. ↑ M07 طرق اختبار حساسية المضادات الحيوية بالتخفيف للبكتيريا التي تنمو هوائياً (ملف PDF) . معهد المعايير السريرية والمخبرية. 2018.
  9. ↑ بريستر، جيه دي. (2003). "اختبار نمو دقيق بسيط لحصر البكتيريا". مجلة أساليب علم الأحياء الدقيقة . 53 (1): 77-86 . doi : 10.1016/S0167-7012(02)00226-9 . PMID 12609726 . 
  10. ويلكوس إس، كوت سي كيه، هان يو، شاستاك أو، جيدرمان جيه، بوزو جيه، جونغ جي، روشالا بي، براتيكيا بي، تانغ تي، ليرر آر آي، باير دبليو (2011). " تعزز ثيتا- ديفينسينات المؤنسنة (ريتروسيكلينات) أداء البلاعم وتحمي الفئران من عدوى الجمرة الخبيثة التجريبية" . مضادات الميكروبات والعلاج الكيميائي . 55 (9): 4238-50 . doi : 10.1128/AAC.00267-11 . PMC 3165295. PMID 21768520 .  
  11. 1 2 وانغ، تشينغ؛ شين، مينجكيانج؛ تشانغ، نيكسين. وانغ، سونغ؛ شو، يانغ؛ تشن، شيلي. تشن، فانغ. يانغ، كه؛ هو تينغ. وانغ، آيبينج؛ سو، يونغ بينغ؛ تشنغ، تيانمين؛ تشاو، جينغهونغ؛ وانغ ، جون بينغ (2016). "التخفيض يضعف النشاط المضاد للبكتيريا ولكنه يفيد قدرة تحييد LPS للديفينسين المعوي البشري 5" . التقارير العلمية . 6 22875. بيب كود : 2016NatSR...622875W . دوى : 10.1038/srep22875 . بمك 4785407 . بميد 26960718 .  
  12. 1 2 وانغ سي، تشاو جي، وانغ إس، تشين واي، غونغ واي، تشين إس، شو واي، هو إم، وانغ إكس، تسنغ إتش، وانغ إيه، ليو دي، سو واي، تشنغ تي، تشين إف، وانغ جي (2011). "مشتق مبسط من ديفينسين 5 البشري ذو فعالية قوية وفعالة ضد بكتيريا أسينيتوباكتر بوماني المقاومة للأدوية المتعددة" . مضادات الميكروبات والعلاج الكيميائي . 62 (2): e01504-17. Bibcode : 2016NatSR...622875W . doi : 10.1038/ srep22875 . PMC 5786806. PMID 29158275 .  
  13. ↑ Xie C, Prahl A, Ericksen B, Wu Z, Zeng P, Li X, Lu WY, Lubkowski J, Lu W (2005). "إعادة بناء الانتفاخ بيتا المحفوظ في ديفينسينات الثدييات باستخدام الأحماض الأمينية D" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 280 (38): 32921-32929 . doi : 10.1074/jbc.M503084200 . PMID 15894545 . 
  14. ↑ شي سي، زينغ بي، إريكسن بي، وو زد، لو واي واي، لو دبليو (2005). "تأثير الشحنات الطرفية في ألفا-ديفينسين 2 في العدلات البشرية على نشاطه المبيد للجراثيم ونشاطه الغشائي". الببتيدات . 26 ( 12): 2377-83 . doi : 10.1016/j.peptides.2005.06.002 . PMID 16009464. S2CID 8613489 .  
  15. ↑ وو ز، لي إكس، دي ليو إي، إريكسن ب، لو دبليو (2005). "لماذا يُحفظ الجسر الملحي Arg5-Glu13 في ألفا-ديفينسينات الثدييات؟" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 280 (52): 43039-43047 . doi : 10.1074/jbc.M510562200 . PMID 16246847 . 
  16. ↑ وو ز، لي إكس، إريكسن ب، دي ليو إي، زو جي، زينغ ب، شي سي، لي سي، لوبكوفسكي جي، لو واي، لو دبليو (2007). "تأثير القطع الأولية على طي ووظيفة ألفا-ديفينسينات العدلات البشرية" . مجلة البيولوجيا الجزيئية . 368 (2): 537-49 . doi : 10.1016/j.jmb.2007.02.040 . PMC 2754399. PMID 17355880 .  
  17. ↑ زو جي، دي ليو إي، لوبكوفسكي جيه، لو دبليو (2008). "المحددات الجزيئية لتفاعل ألفا ديفينسين 1 في العدلات البشرية مع ببتيده الأولي" . مجلة البيولوجيا الجزيئية . 381 (5): 1281-1291 . doi : 10.1016/j.jmb.2008.06.066 . PMC 2754386. PMID 18616948 .  
  18. ↑ وي جي، دي ليو إي، بازجير إم، يوان دبليو، زو جي، وانغ جي، إريكسن بي، لو دبليو واي، ليرر آر آي، لو دبليو (2009). "من خلال المرآة، رؤى آلية من الديفينسينات البشرية المتماثلة ضوئياً" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 284 (42): 29180-92 . doi : 10.1074/jbc.M109.018085 . PMC 2781462. PMID 19640840 .  
  19. ↑ بازجير م، وي ج، إريكسن ب، جونغ ج، وو ز، دي ليو إي، يوان و، شماسينسكي هـ، لو واي، لوبكوفسكي ج، ليرر آر آي، لو و (2012). "أحيانًا يتطلب الأمر اثنين للرقص: مساهمات التضاعف في وظائف ببتيد ألفا-ديفينسين البشري HNP1" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 287 (12): 8944-53 . doi : 10.1074/jbc.M111.332205 . PMC 3308808. PMID 22270360 .  
  20. ↑ تشاو إل، إريكسن بي، وو إكس، زان سي، يوان دبليو، لي إكس، بازجير إم، لو دبليو (2012). "بقايا الجليسين الثابتة مهمة لطي ألفا-ديفينسين، وتكوين ثنائياته، ووظيفته: دراسة حالة لألفا-ديفينسين العدلات البشري HNP1" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 287 (23): 18900-18912 . doi : 10.1074/jbc.M112.355255 . PMC 3365925. PMID 22496447 .  
  21. ^ وي جي، بازجير إم، دي ليو إي، رجبي إم، لي جي، زو جي، جونغ جي، يوان دبليو، لو واي، ليهرر ري، لو دبليو (2010). "Trp-26 يضفي تنوعًا وظيفيًا على ألفا ديفينسين HNP1 البشري" . جي بيول كيم . 285 (21): 16275– 85. دوى : 10.1074/jbc.M110.102749 . بمك 2871495 . بميد 20220136 .  
  22. ↑ تشاو إل، تولبرت دبليو دي، إريكسن بي، زان سي، وو إكس، يوان دبليو، لي إكس، بازجير إم، لو دبليو (2013). "استبدالات الألانين المفردة والمزدوجة والرباعية عند واجهات قليلة الوحدات تحدد كراهية الماء كعامل رئيسي في تحديد وظيفة ديفينسين ألفا العدلات البشرية HNP1" . PLOS ONE . 8 (11) e78937. Bibcode : 2013PLoSO...878937Z . doi : 10.1371/journal.pone.0078937 . PMC 3827289. PMID 24236072 .  
  23. ^ رجبي م، إريكسن ب، وو إكس، دي ليو إي، تشاو إل، بازجير إم، لو دبليو (2012). "المحددات الوظيفية للـ α-defensin HD5 المعوي البشري: دور حاسم في الكارهة للماء في الواجهة الخافتة" . جي بيول كيم . 287 (26): 21615–27 . دوى : 10.1074/jbc.M112.367995 . بمك 3381126 . بميد 22573326 .  
  24. ↑ وانغ كيو، يانغ واي، لو جي، تشو واي، تولبرت دبليو دي، بازجير إم، لياو سي، لو دبليو (2023). " ألفا-ديفينسينات الفئران: تحليل بنيوي ووظيفي لـ 17 نظيرًا من الكريبتدين تم تحديدها من خبايا معوية واحدة" . العدوى والمناعة . 91 (1): e0036122. doi : 10.1128/iai.00361-22 . PMC 9872612. PMID 36472443 .  
  25. ↑ بروك، آي (1989). "تأثير اللقاح". مجلة الأمراض المعدية . 11 (3): 361-368 . doi : 10.1093/clinids/11.3.361 . PMID 2664999 . 
  26. 1 2 إريكسن ب، وآخرون (2020). "العد الافتراضي للمستعمرات" . ويكي جورنال أوف ساينس . 3 (1): 3. doi : 10.15347/wjs/2020.003 . 
  27. ↑ إريكسن، برايان. "جيت هاب" .
  28. ↑ إريكسن ب (2014). "سلامة وفعالية وجدوى طرق نقل خلايا الإشريكية القولونية اللاصقة والمتماسكة إلى الصفائح الدقيقة لتجنب الهباء الجوي" . F1000Res . 3 : 267. doi : 10.12688/f1000research.5659.2 . PMC 4309163. PMID 25671086 .