تعطيل الجينات

إعادة التركيب المتماثل هي عملية تبادل الجينات بين سلسلتي الحمض النووي DNA، وتتضمن مناطق واسعة من تسلسلات القواعد المتطابقة. في الكائنات حقيقية النواة، والبكتيريا، وبعض الفيروسات، تحدث إعادة التركيب المتماثل تلقائيًا، وهي أداة مفيدة في الهندسة الوراثية. تحدث إعادة التركيب المتماثل أثناء الانقسام الاختزالي في حقيقيات النوى، وهي ضرورية لإصلاح كسور الحمض النووي DNA المزدوجة، وتعزز التنوع الجيني من خلال السماح بانتقال المعلومات الوراثية أثناء عبور الكروموسومات. تُعد إعادة التركيب المتماثل آلية رئيسية لإصلاح الحمض النووي DNA في البكتيريا، حيث تُمكّن من إدخال المادة الوراثية المكتسبة من خلال النقل الأفقي للجينات وتحويلها إلى DNA. تؤثر إعادة التركيب المتماثل في الفيروسات على مسار تطورها. تُعد إعادة التركيب المتماثل نوعًا من أنواع استهداف الجينات المستخدمة في الهندسة الوراثية، وتتضمن إدخال طفرة مُهندسة في جين معين بهدف فهم وظيفته بشكل أفضل. تتضمن هذه الطريقة إدخال حمض نووي غريب إلى خلية، يحمل تسلسلًا مشابهًا للجين المستهدف، ومحاطًا بتسلسلات متطابقة في اتجاهي 5' و3' من الجين المستهدف. يُستبدل الحمض النووي للجين المستهدف بتسلسل الحمض النووي الغريب أثناء التضاعف، عندما تكتشف الخلية المناطق المجاورة المتشابهة باعتبارها متماثلة. يؤدي هذا الاستبدال إلى تعطيل الجين المستهدف. باستخدام هذه التقنية لاستهداف أليلات معينة في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران، يُمكن إنتاج فئران معدلة وراثيًا. بفضل استهداف الجينات، تم تعطيل العديد من جينات الفئران، مما أدى إلى إنشاء مئات النماذج المختلفة من الفئران لأمراض بشرية متنوعة، مثل السرطان والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والاضطرابات العصبية. أجرى ماريو كابيكي والسير مارتن ج. إيفانز وأوليفر سميثيز أبحاثًا رائدة حول إعادة التركيب المتماثل في الخلايا الجذعية للفئران، وتقاسموا جائزة نوبل في الطب أو علم وظائف الأعضاء لعام 2007 تقديرًا لاكتشافاتهم. ^{[ 5 ]} تقليديًا، كان إعادة التركيب المتماثل الطريقة الرئيسية لإحداث تعطيل جيني. تتضمن هذه الطريقة إنشاء بنية DNA تحتوي على الطفرة المطلوبة. ولأغراض التعطيل الجيني، يتضمن ذلك عادةً استبدال جين التعطيل بعلامة مقاومة دوائية. ^{[ 6 ]} تحتوي البنية أيضًا على ما لا يقل عن 2 كيلوبايت من التماثل مع التسلسل المستهدف. يمكن إيصال البنية إلى الخلايا الجذعية إما عن طريق الحقن المجهري أو التثقيب الكهربائي . تعتمد هذه الطريقة بعد ذلك على آليات إصلاح الخلية لإعادة تركيب بنية DNA في DNA الموجود. ينتج عن ذلك تغيير في تسلسل الجين، وفي معظم الحالات تتم ترجمة الجين.يتحول إلى بروتين غير وظيفي ، إن تُرجم أصلاً. مع ذلك، تُعد هذه العملية غير فعالة، إذ لا يُمثل إعادة التركيب المتماثل سوى 10⁻² ^إلى 10⁻³ ^من عمليات دمج الحمض النووي. ^{[ 6 ] [ 7 ]} غالبًا ما يُستخدم واسم اختيار الدواء الموجود على التركيب لاختيار الخلايا التي حدثت فيها عملية إعادة التركيب.

يمكن استخدام هذه الخلايا الجذعية التي تفتقر الآن إلى الجين في الكائنات الحية ، على سبيل المثال في الفئران، عن طريق إدخالها في الأجنة في مراحلها المبكرة. إذا احتوى الفأر الهجين الناتج على التغيير الجيني في خطه الجرثومي، فيمكن توريثه للنسل. ^{[ 6 ]}

في الكائنات ثنائية المجموعة الكروموسومية ، التي تحتوي على أليلين لمعظم الجينات، وقد تحتوي أيضًا على عدة جينات مترابطة تتعاون في نفس الدور، تُجرى جولات إضافية من التحويل والاختيار حتى يتم تعطيل كل جين مستهدف. وقد يتطلب الأمر تربية انتقائية لإنتاج حيوانات متماثلة الزيجوت معطلة الجينات.

توجد حاليًا ثلاث طرق مستخدمة تتضمن استهداف تسلسل الحمض النووي بدقة لإحداث كسر في سلسلتي الحمض النووي. بمجرد حدوث ذلك، تحاول آليات إصلاح الخلية إصلاح هذا الكسر، غالبًا من خلال الربط غير المتجانس للنهايات (NHEJ)، والذي يتضمن ربط طرفي القطع معًا مباشرةً. ^{[ 7 ]} قد لا تتم هذه العملية بشكل كامل، مما قد يؤدي أحيانًا إلى إدخال أو حذف أزواج من القواعد، والتي بدورها تُسبب طفرات إزاحة الإطار . يمكن لهذه الطفرات أن تجعل الجين الذي تحدث فيه غير وظيفي، مما يؤدي إلى تعطيل هذا الجين. تُعد هذه العملية أكثر كفاءة من إعادة التركيب المتماثل، وبالتالي يمكن استخدامها بسهولة أكبر لإنشاء حالات تعطيل ثنائية الأليل. ^{[ 7 ]}

إن إدخال الجينات يشبه حذف الجينات، ولكنه يستبدل جيناً بآخر بدلاً من حذفه.

يُتيح تعطيل الجين المشروط حذف الجين في نسيجٍ ما بطريقةٍ خاصةٍ به. ويُعدّ هذا الإجراء ضروريًا بدلًا من تعطيل الجين بشكلٍ كاملٍ إذا كانت الطفرة الصفرية ستؤدي إلى موت الجنين ، ^{[ 15 ]} أو إذا كان نسيجٌ أو نوعٌ خلويٌ مُحددٌ ذا أهميةٍ خاصة. ويتم ذلك عن طريق إدخال تسلسلاتٍ قصيرةٍ تُسمى مواقع loxP حول الجين. تُدخل هذه التسلسلات إلى الخلايا الجرثومية عبر نفس آلية تعطيل الجين. بعد ذلك، يُمكن تهجين هذه الخلايا الجرثومية مع خلايا جرثومية أخرى تحتوي على إنزيم Cre-recombinase ، وهو إنزيمٌ فيروسيٌّ قادرٌ على التعرّف على هذه التسلسلات، وإعادة تركيبها، وحذف الجين المُحاط بهذه المواقع. ^{[ 16 ]} وقد تم تطوير أنواعٍ أخرى من إنزيمات إعادة التركيب واستخدامها في تجارب تعطيل الجين المشروط. ^{[ 17 ]}