عمود HPLC متجانس

📅 آخر تحديث: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
الموسوعة الحرة

عمود HPLC المتجانس ، أو العمود المتجانس، هو عمود يُستخدم في كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC). يُصمم الهيكل الداخلي لهذا العمود بحيث تتشكل قنوات عديدة داخله. يمكن أن تكون المادة الموجودة داخل العمود، والتي تفصل بين هذه القنوات، مسامية وقابلة للتعديل. في المقابل، تستخدم معظم أنظمة HPLC أعمدة معبأة بجزيئات دقيقة؛ حيث تُستخدم في هذه الأنظمة حبيبات صغيرة من مادة خاملة، عادةً ما تكون سيليكا مُعدلة ، داخل العمود. [ 1 ] يمكن تصنيف الأعمدة المتجانسة إلى فئتين: أعمدة سيليكا وأعمدة بوليمر. تُعرف أعمدة السيليكا بكفاءتها في فصل الجزيئات الصغيرة، بينما تُعرف أعمدة البوليمر بكفاءتها في فصل جزيئات البروتين الكبيرة.

نظرة عامة على التكنولوجيا

في الكروماتوغرافيا التحليلية، يهدف التحليل إلى فصل كل مركب من مركبات المادة وتحديد هويته بدقة. أما الكروماتوغرافيا التحضيرية، فهي طريقة لتنقية كميات كبيرة من المواد في بيئة إنتاجية. تعتمد طرق الفصل الأساسية في كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) على تمرير طور متحرك (ماء، مذيبات عضوية ، إلخ) عبر طور ثابت (حشوات السيليكا الجزيئية، أو الأعمدة المتجانسة، إلخ) في بيئة مغلقة (عمود). وتُستخدم الاختلافات في التفاعل بين المذيب المراد فصله والطورين المتحرك والثابت لتمييز المركبات عن بعضها البعض من خلال سلسلة من عمليات الامتزاز والتحلل. ثم تُعرض النتائج بصريًا في مخطط كروماتوغرافي . تتوفر الأطوار الثابتة بأنواع عديدة من الحشوات والتركيبات الكيميائية، ويمكن تعديلها وظيفيًا لزيادة الخصوصية. تُعد الأعمدة المتجانسة، أو الأعمدة المتجانسة، أحد أنواع هياكل الأطوار الثابتة.

تُعرف الأعمدة المتجانسة، في المصطلحات الكروماتوغرافية، بأنها هياكل قضيبية مسامية تتميز بوجود مسامات متوسطة وكبيرة. تُكسب هذه المسامات الأعمدة المتجانسة نفاذية عالية، وعددًا كبيرًا من القنوات، ومساحة سطحية واسعة متاحة للتفاعل. يتكون الهيكل الأساسي للعمود المتجانس من مادة عضوية أو غير عضوية ، ويمكن تعديله كيميائيًا بسهولة لتطبيقات محددة. يمنحها تركيبها الفريد العديد من الخصائص الفيزيائية والميكانيكية التي تُمكّنها من الأداء التنافسي مع الأعمدة المعبأة التقليدية. [ 2 ]

Historically, the typical HPLC column consists of high-purity particulate silica compressed into stainless steel tubing. To decrease run times and increase selectivity, smaller diffusion distances have been pursued. To achieve smaller diffusion distances there has been a decrease in the particle sizes. However, as the particle size decreases, the backpressure (for a given column diameter and a given volumetric flow) increases proportionally. Pressure is inversely proportional to the square of the particle size; i.e., when particle size is halved, pressure increases by a factor of four. This is because as the particle sizes get smaller, the interstitial voids (the spaces between the particles) do as well, and it is harder to push the compounds through the smaller spaces. Modern HPLC systems are generally designed to withstand about 18,000 pounds per square inch (1,200 bar) of backpressure in order to deal with this problem.

Monoliths also have very short diffusion distances, while also providing multiple pathways for solute dispersion. Packed particle columns have pore connectivity values of about 1.5, while monoliths have values ranging from 6 to greater than 10. This means that, in a particulate column, a given analyte may diffuse into and out of the same pore, or enter through one pore and exit through a connected pore. By contrast, an analyte in a monolith is able to enter one channel and exit through any of 6 or more different venues.[3] Little of the surface area in a monolith is inaccessible to compounds in the mobile phase. The high degree of interconnectivity in monoliths confers an advantage seen in the low backpressures and readily achievable high flow rates.

Monoliths are ideally suited for large molecules; although the purification of larger molecules can be very time-consuming.[2] As mentioned previously, particle sizes are decreasing in an attempt to achieve higher resolution and faster separations, which led to higher backpressures. When the smaller particle sizes are used to separate biomolecules, backpressures increase further because of the large molecule size. In monoliths, where backpressures are low and channel sizes are large, small molecule separations are less efficient. This is demonstrated by the dynamic binding capacities, a measure of how much sample can bind to the surface of the stationary phase. Dynamic binding capacities of monoliths for large molecules can be an order of ten times greater than that for particulate packings.[3]

لا تُظهر المواد المتجانسة قوى قص أو تأثيرات دوامية. يسمح الترابط العالي بين المسام المتوسطة بوجود مسارات متعددة للتدفق الحراري عبر العمود. لا يتأثر انتقال كتلة المواد المذابة عبر العمود بشكل ملحوظ بمعدل التدفق. وهذا يتناقض تمامًا مع الحشوات الجزيئية التقليدية، حيث تُساهم التأثيرات الدوامية وقوى القص بشكل كبير في فقدان الدقة والسعة، كما هو موضح في منحنى فان ديمتر. مع ذلك، قد تُعاني المواد المتجانسة من عيب آخر في التدفق: تأثيرات الجدار. تميل المواد المتجانسة المصنوعة من السيليكا، على وجه الخصوص، إلى الانفصال عن جوانب غلاف العمود. عندما يحدث هذا، يتدفق الطور المتحرك حول الطور الثابت وكذلك من خلاله، مما يُقلل من الدقة. وقد تم تقليل تأثيرات الجدار بشكل كبير بفضل التطورات في تصميم الأعمدة.

تشمل المزايا الأخرى للأعمدة المتجانسة، التي يمنحها تصميمها الفردي، زيادة إمكانية تكرار النتائج بين الأعمدة وبين الدفعات. إحدى تقنيات تصنيع الأعمدة المتجانسة هي بلمرة البنية في الموقع . تتضمن هذه التقنية ملء القالب أو أنابيب العمود بمزيج من المونومرات ، وعامل ربط متقاطع، ومحفز للجذور الحرة، ومذيب مُولِّد للمسام، ثم بدء عملية البلمرة في ظل ظروف حرارية أو إشعاعية مضبوطة بدقة. تتجنب البلمرة المتجانسة في الموقع المصدر الرئيسي للاختلافات بين الأعمدة، وهو عملية التعبئة. [ 4 ]

بالإضافة إلى ذلك، يجب حفظ أعمدة الجسيمات المعبأة في بيئة مذيبة، ولا يجوز تعريضها للهواء أثناء عملية التعبئة أو بعدها. ففي حال تعرضها للهواء، تجف المسامات، ما يؤدي إلى فقدان مساحة السطح الكافية للتفاعل، وبالتالي يجب إعادة تعبئة العمود أو التخلص منه. علاوة على ذلك، ولأن ضغط الجسيمات وتجانس التعبئة لا ينطبقان على الأعمدة المتجانسة، فإنها تتميز بمتانة ميكانيكية أكبر؛ فإذا سقطت أعمدة الجسيمات، على سبيل المثال، فقد تتضرر سلامة العمود. وتُعد الأعمدة المتجانسة أكثر استقرارًا من الناحية الفيزيائية من نظيراتها من أعمدة الجسيمات.

تطوير التكنولوجيا

The roots of liquid chromatography extend back over a century ago to 1900, when Russian botanist Mikhail Tsvet began experimenting with plant pigments in chlorophyll.[5] He noted that, when a solvent was applied, distinct bands appeared that migrated at different rates along a stationary phase. For this new observation, he coined the term “chromatography,” a colored picture. His first lecture on the subject was presented in 1903, but his most important contribution occurred three years later, in 1906, when the paper “Adsorption analysis and chromatographic method. Applications on the chemistry of chlorophyll,” was published. Rivalry with a colleague who readily and vocally denounced his work meant that chromatographic analysis was shelved for almost 25 years. The great irony of the matter is that it was his rival's students who later took up the chromatography banner in their work with carotins.

Greatly unchanged from Tswett's time until the 1940s, normal phase chromatography was performed by passing a gravity-fed solvent through small glass tubes packed with pellicular adsorbent beads. It was in the 1940s, however, that there was a great revolution in gas chromatography (GC). Although GC was a wonderful technique for analyzing inorganic compounds, less than 20% of organic molecules are able to be separated using this technique. It was Richard Synge, who in 1952 won the Nobel Prize in Chemistry for his work with partition chromatography, who applied the theoretical knowledge gained from his work in GC to LC. From this revolution, the 1950s also saw the advent of paper chromatography, reversed-phase partition chromatography (RPC), and hydrophobic interaction chromatography (HIC). The first gels for use in LC were created using cross-linked dextrans (Sephadex) in an attempt to realize Synge's prediction that a unique single-piece stationary phase could provide an ideal chromatographic solution.

In the 1960s, polyacrylamide and agarose gels were created in a further attempt to create a single-piece stationary phase, but the purity of and stability of available components did not prove useful for implementation in the HPLC. In this decade, affinity chromatography was invented, an ultra-violet (UV) detector was used for the first time in conjunction with LC, and, most importantly, the modern HPLC was born. Csaba Horvath led the development of modern HPLC by piecing together laboratory equipment to suit his purposes. In 1968, Picker Nuclear Company marketed the first commercially available HPLC as a “Nucleic Acid Analyzer.” The following year, the first international symposia on HPLC was held, and Kirkland at DuPont was able to functionalize controlled porosity pellicular particles for the first time.

The 1970s and 1980s witnessed a renewed interest in separations media with reduced interparticular void volumes.Perfusion chromatography showed, for the first time, that chromatography media could support high flow rates without sacrificing resolution.[6] Monoliths aptly fit into this new class of media, as they exhibit no void volume and can withstand flow rates up to 9mL/minute. Polymeric monoliths as they exist today were developed independently by three different labs in the late 1980s led by Hjerten, Svec, and Tennikova. Simultaneously, bioseparations became increasingly important, and monolith technologies proved beneficial in biotechnology separations.

Though industry focus in the 1980s was on biotechnology, focus in the 1990s shifted to process engineering. While mainstream chromatographers were using 3μm particulate columns, sub-2μm columns were in research phase. The smaller particles meant better resolution and shorter run times; there was also an associated increase in backpressure. In order to withstand the pressure, a new field of chromatography came into being: UHPLC or UPLC- ultra high pressure liquid chromatography. The new instruments were able to endure pressures of up to 15,000 pounds per square inch (1,000 bar), as opposed to conventional machines, which, as previously state, can hold up to 5,000 pounds per square inch (340 bar). UPLC is an alternative solution to the same problems monolithic columns solve. Similarly to UPLC, monolith chromatography can help the bottom line by increasing sample throughput, but without the need to spend capital on new equipment.

في عام ١٩٩٦، قام نوبو تاناكا ، في معهد كيوتو للتكنولوجيا ، بتحضير أعمدة سيليكا متجانسة باستخدام طريقة التخليق بالتعليق الغرواني (المعروفة أيضًا باسم " سول-جل ") التي طورها أحد زملائه. تختلف هذه العملية عن تلك المستخدمة في الأعمدة المتجانسة البوليمرية. فالأعمدة المتجانسة البوليمرية، كما ذُكر سابقًا، تُصنع في الموقع باستخدام مزيج من المونومرات ومادة مسامية داخل أنبوب العمود. أما أعمدة السيليكا المتجانسة، فتُصنع في قالب، وتخضع لانكماش كبير، ثم تُغلّف بأنبوب بوليمري قابل للانكماش مثل PEEK (بولي إيثر إيثر كيتون) لتقليل تأثيرات الجدار. يحد هذا الأسلوب من حجم الأعمدة التي يمكن إنتاجها إلى أقل من ١٥ سم، وعلى الرغم من سهولة تحقيق الأقطار الداخلية التحليلية القياسية ، إلا أن هناك توجهًا حاليًا نحو تطوير أعمدة سيليكا متجانسة نانوية الحجم، سواءً كانت شعرية أو تحضيرية. 

دورة حياة التكنولوجيا

لم تُطرح كتل السيليكا المتجانسة تجاريًا إلا منذ عام 2001، عندما بدأت شركة ميرك حملتها التسويقية لتقنية كروموليث. [ 7 ] وقد حصلت الشركة على ترخيص تقنية كروموليث من مجموعة سوغا وناكانيشي في جامعة كيوتو. وفاز المنتج الجديد بجائزة بيتكون الذهبية لأفضل منتج جديد، بالإضافة إلى جائزة R&D 100 ، وكلاهما في عام 2001.

تتميز أعمدة المونوليث الفردية بدورة حياة تتجاوز عمومًا دورة حياة أعمدة الجزيئات المنافسة. عند اختيار مورد لأعمدة HPLC، لم يكن عمر العمود سوى ثاني أهم عامل بالنسبة للمشتري بعد قابلية تكرار النتائج بين الأعمدة. على سبيل المثال، أثبتت أعمدة الكروموليث قابلية تكرار النتائج لـ 3300 حقنة عينة و50000 حجم عمود من الطور المتحرك. ومن العوامل المهمة أيضًا لدورة حياة المونوليث متانته الميكانيكية العالية؛ إذ تستطيع المونوليثات البوليمرية تحمل نطاقات الأس الهيدروجيني من 1 إلى 14، وتحمل درجات حرارة مرتفعة، ولا تتطلب عناية خاصة. ويؤكد فرانتيسيك سفيك، الرائد في مجال الأطوار الثابتة الجديدة لتقنية LC: "لا تزال المونوليثات في مراحلها الأولى". [ 8 ]

تطور الصناعة

بدأت تقنية الاستشراب السائل بشكلها الحالي في عام 1969، عندما صُمم أول جهاز استشراب سائل عالي الأداء (HPLC) حديث وسُوِّق كمحلل للأحماض النووية . [ 9 ] كانت الأعمدة المستخدمة خلال سبعينيات القرن الماضي غير موثوقة، وكانت معدلات تدفق المضخات غير منتظمة، مما أدى إلى إفلات العديد من المركبات النشطة بيولوجيًا من الكشف بواسطة أجهزة الكشف بالأشعة فوق البنفسجية والفلورية . تحول التركيز من طرق التنقية في السبعينيات إلى تحليلات أسرع في الثمانينيات، عندما دُمجت أنظمة التحكم المحوسبة في أجهزة HPLC. ثم أدى ازدياد مستوى الحوسبة إلى التركيز على أجهزة أكثر دقة وسرعة وأتمتة في التسعينيات. وعلى عكس العديد من تقنيات الستينيات والسبعينيات، لم يكن التركيز في التحسينات على "الأكبر والأفضل"، بل على "الأصغر والأفضل". في الوقت الذي كانت فيه واجهة مستخدم HPLC تتحسن، كان من الضروري القدرة على عزل مئات الببتيدات أو المؤشرات الحيوية من أحجام عينات متناقصة باستمرار.

لم يُعترف بأجهزة التحليل المختبري كصناعة مستقلة ومتميزة من قِبل نظام تصنيف الصناعات في أمريكا الشمالية (NAICS) ونظام التصنيف الصناعي القياسي (SIC) إلا منذ عام 1987. ويشمل هذا التقسيم السوقي ليس فقط أجهزة كروماتوغرافيا الغاز والسائل، بل أيضًا أجهزة قياس الطيف الكتلي وأجهزة قياس الطيف الضوئي. ومنذ الاعتراف بها كسوق مستقلة، ارتفعت مبيعات معدات المختبرات التحليلية من حوالي 3.5 مليار دولار أمريكي في عام 1987 إلى أكثر من 26 مليار دولار أمريكي في عام 2004. [ 10 ] ومن المتوقع أن تنمو إيرادات سوق كروماتوغرافيا السائل العالمية، على وجه الخصوص، من 3.4 مليار دولار أمريكي في عام 2007 إلى 4.7 مليار دولار أمريكي في عام 2013، مع توقع انخفاض طفيف في الإنفاق خلال عامي 2008 و2009 نتيجة للركود الاقتصادي العالمي وانخفاض الإنفاق أو ركوده. وتستحوذ صناعة الأدوية وحدها على 35% من إجمالي أجهزة كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (HPLC) المستخدمة. [ 11 ] وينبع المصدر الرئيسي للنمو في مجال كروماتوغرافيا السائل من شركات علوم الحياة والأدوية .

تطبيقات التكنولوجيا

في بداياتها، استُخدمت تقنية الاستشراب السائل لفصل أصباغ الكلوروفيل على يد عالم نبات روسي. وبعد عقود، استخدمها كيميائيون آخرون لدراسة الكاروتينات. ثم استُخدمت الاستشراب السائل لعزل الجزيئات الصغيرة والمركبات العضوية كالأحماض الأمينية ، ومؤخرًا استُخدمت في أبحاث الببتيدات والحمض النووي . وقد كان للأعمدة المتجانسة دورٌ محوري في تطوير مجال الأبحاث الجزيئية الحيوية.

في المعارض التجارية والاجتماعات الدولية الأخيرة لتقنية كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)، ازداد الاهتمام بشكل مطرد بالأعمدة المتجانسة وتطبيقاتها في مجال الجزيئات الحيوية، وهذا الترابط ليس من قبيل الصدفة. فقد أظهرت هذه الأعمدة إمكانات هائلة في مجالات "الأوميكس" - علم الجينوم ، وعلم البروتينات ، وعلم الأيض ، وعلم الصيدلة الجينية ، وغيرها. ويُعدّ النهج الاختزالي لفهم المسارات الكيميائية في الجسم وردود الفعل تجاه المحفزات المختلفة، كالأدوية، أساسيًا لموجات جديدة من الرعاية الصحية ، مثل الطب الشخصي .

يدرس علم الصيدلة الجينية كيفية اختلاف الاستجابات للمنتجات الصيدلانية من حيث الفعالية والسمية بناءً على الاختلافات في جينوم المريض؛ وهو عبارة عن ربط استجابة الدواء بالتعبير الجيني لدى المريض. استخدم جيريمي ك. نيكلسون من إمبريال كوليدج لندن منظورًا ما بعد الجينومي لفهم التفاعلات الدوائية الضارة والأساس الجزيئي للأمراض البشرية. [ 12 ] درس فريقه الملامح الأيضية للميكروبات المعوية ، وتمكنوا من رؤية اختلافات واضحة في الاستجابات لسمية الدواء واستقلابه حتى بين التوزيعات الجغرافية المختلفة لنفس العرق. يوفر كروماتوغرافيا التقارب المتجانس نهجًا آخر لقياس استجابة الدواء. يقوم ديفيد هاج في جامعة نبراسكا-لينكولن بربط الروابط بالدعامات المتجانسة ويقيس ظواهر التوازن لتفاعلات الربط بين الأدوية وبروتينات المصل . [ 8 ] يُستخدم حاليًا نهج قائم على المتجانس في جامعة بولونيا ، إيطاليا ، للفحص عالي السرعة للمرشحين الدوائيين في علاج مرض الزهايمر . [ 6 ] في عام 2003، وصف رينييه وليو من جامعة بيردو إجراءً متعدد الأبعاد للفصل الكروماتوغرافي السائل لتحديد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) في البروتينات . [ 13 ] تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة هي تغيرات في الشفرة الوراثية قد تُسبب أحيانًا تغيرات في بنية البروتين ، كما هو الحال في فقر الدم المنجلي . تُعدّ المواد المتجانسة مفيدة بشكل خاص في هذا النوع من عمليات الفصل نظرًا لقدراتها الفائقة على نقل الكتلة ، وانخفاض الضغط الخلفي المصاحب لمعدلات التدفق العالية، وسهولة تعديل سطح الدعم نسبيًا.

Bioseparations on a production scale are enhanced by monolith column technologies as well. The fast separations and high resolving power of monoliths for large molecules means that real-time analysis on production fermentors is possible.Fermentation is well known for its use in making alcoholic beverages, but is also an essential step in the production of vaccines for rabies and other viruses. Real-time, on-line analysis is critical for monitoring of production conditions, and adjustments can be made if necessary. Boehringer Ingelheim Austria has validated a method with cGMP (commercial good manufacturing practices) for production of pharmaceutical-grade DNA plasmids. They are able to process 200L of fermentation broth on an 800mL monolith.[6] At BIA Separations, processing time of the tomato mosaic virus decreased considerably from the standard five days of manually intensive work to equivalent purity and better recovery in only two hours with a monolith column.[6] Other viruses have been purified on monoliths as well.

Affinity monoliths have also been applied to the isolation of nanoscale particles from human plasma. Tandem monolithic disks functionalized with chondroitin-6-sulfate and anti-apolipoprotein B-100 antibodies enabled the selective isolation of low-density lipoprotein in less than 30 minutes,[14] while a monolith carrying an anti-CD61 antibody isolated platelet-derived extracellular vesicles in 19 minutes.[15] Monolithic disks carrying antibodies against apoB-100, CD9, or CD61 were subsequently coupled online to asymmetric flow field-flow fractionation, allowing automated isolation and size fractionation of lipoproteins and extracellular-vesicle subpopulations.[16] Extracellular-vesicle fractions obtained using these monolith-based systems have also been characterized by Raman spectroscopy and comprehensive two-dimensional gas chromatography,[17] and used in quartz crystal microbalance studies of binding between extracellular-vesicle subpopulations and affinity ligands.[18] A detailed protocol for the automated monolith–field-flow fractionation method for isolation of extracellular vesicles (including e.g., exosomes and exomeres) was published in 2023.[19]

يُعدّ التحليل الجنائي مجالًا آخرًا ذا أهمية لتقنية كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC ). وتُعتبر تقنية كروماتوغرافيا الغاز-مطياف الكتلة ( GC-MS ) المعيار الذهبي للتحليل الجنائي. تُستخدم هذه التقنية بالتزامن مع قواعد البيانات الإلكترونية للتحليل السريع للمركبات في اختبارات نسبة الكحول في الدم ، وتحديد سبب الوفاة، والكشف عن المخدرات، وتحليل الأغذية، لا سيما في حالات التسمم. [ 13 ] وقد أظهر تحليل البوبرينورفين ، وهو بديل للهيروين ، الفائدة المحتملة لتقنية كروماتوغرافيا السائل متعددة الأبعاد (LC) كطريقة للكشف عن المستويات المنخفضة. تستطيع طرق HPLC قياس هذا المركب بتركيز 40 نانوغرام / مل ، مقارنةً بتقنية GC-MS التي تبلغ 0.5  نانوغرام/مل، بينما تستطيع تقنية LC-MS-MS الكشف عن البوبرينورفين بمستويات منخفضة تصل إلى 0.02  نانوغرام/مل. وبالتالي، فإن حساسية تقنية LC متعددة الأبعاد تفوق حساسية تقنية HPLC التقليدية بألفي ضعف.

التطبيقات الصناعية

سوق كروماتوغرافيا السوائل شديد التنوع. تتصدر خمس إلى عشر شركات السوق باستمرار، ومع ذلك، فإن ما يقرب من نصف السوق يتكون من شركات صغيرة متفرقة. سيركز هذا القسم من التقرير على الأدوار التي اضطلعت بها بعض الشركات في طرح تقنيات الأعمدة المتجانسة في السوق التجارية.

في عام ١٩٩٨، تأسست شركة BIA Separations الناشئة في مجال التكنولوجيا الحيوية في ليوبليانا ، سلوفينيا . طُوّرت هذه التقنية في الأصل على يد تاتيانا تينيكوفا وفرانتيشيك سفيك خلال تعاون بين معهديهما. حصلت BIA Separations على براءة اختراع هذه الأعمدة، وقام أليس بودغورنيك وميلوس باروت بتطوير أول عمود متجانس تجاريًا على شكل قرص قصير مُغلّف بغلاف بلاستيكي. ومنذ ذلك الحين، طرحت BIA Separations، التي تحمل علامتها التجارية CIM، خطوط إنتاج كاملة من الأعمدة المتجانسة البوليمرية ذات الطور العكسي، والطور العادي، وتبادل الأيونات، والتقارب. ثم قام أليس بودغورنيك وجانيز جانكار بتطوير أعمدة أنبوبية متجانسة واسعة النطاق للاستخدام الصناعي. يبلغ حجم أكبر عمود متوفر حاليًا ٨ لترات. في مايو ٢٠٠٨، وافقت شركة Agilent Technologies، الرائدة في مجال أجهزة كروماتوغرافيا السائل، على تسويق أعمدة BIA Separations التحليلية القائمة على تقنية الأعمدة المتجانسة. قامت شركة Agilent بتسويق الأعمدة ذات مراحل التبادل الأيوني القوية والضعيفة والبروتين A في سبتمبر 2008 عندما كشفت النقاب عن خط إنتاجها الجديد Bio-Monolith في مؤتمر BioProcess الدولي.

While BIA Separations was the first to commercially market polymeric monoliths, Merck KGaA was the first company to market silica monoliths. In 1996, Tanaka and coworkers at the Kyoto Institute of Technology published extensive work on silica monolith technologies. Merck was later issued a license from Kyoto Institute of Technology to develop and produce the silica monoliths. Promptly thereafter, in 2001, Merck introduced its Chromolith line of monolithic HPLC columns at analytical instrumentation trade show PittCon. Initially, says Karin Cabrera, senior scientist at Merck, the high flow rate was the selling point for the Chromolith line. Based on customer feedback, though, Merck soon learned that the columns were more stable and longer-lived than particle-packed columns.[8] The columns were the recipients of various new product awards. Difficulties in production of the silica monoliths and tight patent protection have precluded attempts by other companies at developing a similar product. It has been noted that there are more patents concerning how to encapsulate the silica rod than there are on the manufacture of the silica itself.

Historically, Merck has been known for its superior chemical products, and, in liquid chromatography, for the purity and reliability of its particulate silica. Merck is not known for its LC columns. Five years after the introduction of its Chromolith line, Merck made a very strategic marketing decision. They granted a worldwide sublicense of the technology to a small (less than $100M in sales), innovative company well known for its cutting-edge column technology: Phenomenex. This was a superior strategic move for two reasons. As mentioned above, Merck is not well known for its column manufacturing. Furthermore, having more than one silica monolith manufacturer serves to better validate the technology. Having sublicensed the technology from Merck, Phenomenex introduced its Onyx product line in January 2005.

On the other side of monolith technologies are the polymerics. Unlike the inorganic silica columns, the polymer monoliths are made of an organic polymer base. Dionex, traditionally known for its ion chromatography capabilities, has led this side of the field. In the 1990s, Dionex first acquired a license for the polymeric monolith technology developed by leading monolithic chromatography researcher Frantisec Svec while he was at Cornell University. In 2000, they acquired LC Packings, whose competencies were in LC column packings. LC Packings/Dionex revealed their first monolithic capillary column at the Montreux LC-MS Conference. Earlier that year, another company, Isco, introduced a polystyrene divinylbenzene (PS-DVB) monolith column under the brand SWIFT. In January 2005, Dionex was sold the rights to Teledyne Isco's SWIFT media products, intellectual property, technology, and related assets. Though the core competencies of Dionex have traditionally been in ion chromatography, through strategic acquisitions and technology transfers, it has quickly established itself as the primary producer of polymeric monoliths.

Economic impact

Though the many advances of HPLC and monoliths are highly visible within the confines of the analytical and pharmaceutical industries, it is unlikely that general society is aware of these developments. Currently, consumers may witness technology developments in the analytical sciences industry in the form of a broader array of available pharmaceutical products of higher purity, advanced forensic testing in criminal trials, better environmental monitoring, and faster returns on medical tests. In the future, presumably, this may not be the case. As medicine becomes more individualized over time, consumer awareness that something is improving their quality of care seems more likely. The further thought that monoliths or HPLC are involved is unlikely to concern the general public, however.

There are two main cost drivers behind technological change in this industry. Though many different analytical areas use LC, including food and beverage industries, forensics labs, and clinical testing facilities, the largest impetus toward technology developments comes from the research and development and production arms of the pharmaceutical industry. The areas in which high-throughput monolithic column technologies are likely to have the largest economic impact are R&D and downstream processing.

ينبع من مجال البحث والتطوير الرغبة في الحصول على فصل أكثر دقة وسرعة من كميات عينات أصغر. تُعدّ مرحلة البحث والتطوير المرحلة الوحيدة في تطوير الأدوية التي تخضع لسيطرة شركات الأدوية المباشرة. يهدف العمل التحليلي إلى استخلاص أكبر قدر ممكن من المعلومات من العينة. في هذه المرحلة، يُعدّ التحليل عالي الإنتاجية وتحليل كميات العينات الصغيرة أمرًا بالغ الأهمية. تبحث شركات الأدوية عن أدوات تُمكّنها من قياس فعالية الأدوية المرشحة والتنبؤ بها بشكل أفضل في أوقات أقصر وبتكاليف أقل للتجارب السريرية. [ 12 ] ولتحقيق هذه الغاية، أصبحت تقنيات الفصل النانوية، وأجهزة كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) المؤتمتة للغاية، والكروماتوغرافيا متعددة الأبعاد، أدوات مؤثرة.

تُعدّ تقنية الكروماتوغرافيا متعددة الأبعاد الطريقة السائدة لزيادة حساسية الطرق التحليلية. وتعتمد هذه التقنية على استخدام تقنيات تحليلية أخرى بالتزامن مع الكروماتوغرافيا السائلة. فعلى سبيل المثال، اكتسبت مطيافية الكتلة (MS) شعبية واسعة كتقنية تحليلية مباشرة بعد الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC). إلا أنها محدودة، إذ أن مطيافية الكتلة، مثل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو تقنيات التأين بالرذاذ الإلكتروني (ESI)، لا تُجدي نفعًا إلا عند استخدام كميات ضئيلة جدًا من المذاب والمذيب؛ بينما تُستخدم تقنية LC-MS مع تقنيات النانو أو الشعيرات الدموية، ولكن لا يمكن استخدامها على نطاق التحضير. ومن الأساليب الأخرى لزيادة الانتقائية في الكروماتوغرافيا متعددة الأبعاد استخدام عمودين بانتقائية مختلفة بشكل متعامد؛ أي ربط عمود التبادل الأيوني بعمود ذي نهايات C18. في عام 2007، أفاد كارغر أنه باستخدام تقنية الاستشراب متعدد الأبعاد وغيرها من التقنيات، انطلاقًا من حوالي 12000 خلية تحتوي على 1-4 ميكروغرام من البروتين، تمكن من تحديد 1867 بروتينًا فريدًا. ومن بين هذه البروتينات، استطاع كارغر عزل 4 بروتينات قد تكون ذات أهمية كعلامات لسرطان عنق الرحم. [ 12 ] واليوم، يستطيع خبراء الاستشراب السائل باستخدام الاستشراب السائل متعدد الأبعاد عزل المركبات بمستويات الفيمتومول (10⁻¹⁵ مول ) والأتومول (10⁻¹⁸ مول ).

بعد حصول دواء ما على موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA)، ينصبّ تركيز شركات الأدوية على طرح المنتج في السوق. وهنا يبرز دور كروماتوغرافيا التحضير أو كروماتوغرافيا العمليات. فعلى عكس التحليل التحليلي، تركز كروماتوغرافيا التحضير على عزل المركبات ونقائها. وهناك مفاضلة بين درجة نقاء المركب والوقت اللازم لتحقيق هذا النقاء. وللأسف، فإن العديد من حلول كروماتوغرافيا التحضير أو كروماتوغرافيا العمليات التي تستخدمها شركات الأدوية هي حلول احتكارية، نظرًا لصعوبة الحصول على براءة اختراع للعملية. ولذلك، لا تتوفر الكثير من المراجع العلمية في هذا المجال. ومع ذلك، تشمل بعض المحاولات لمعالجة مشاكل كروماتوغرافيا التحضير استخدام وحدات كروماتوغرافيا متجانسة وأسرّة متحركة محاكاة .

تُظهر مقارنة عملية استخلاص بروتين الغلوبولين المناعي على عمود تقليدي وعمود متجانس نتائج ذات جدوى اقتصادية. [ 3 ] إذا تساوت أوقات المعالجة، فإن حجم معالجة IgG ، وهو جسم مضاد ، يبلغ 3120 لترًا للأعمدة التقليدية مقابل 5538 لترًا للأعمدة المتجانسة. وهذا يُمثل زيادة بنسبة 78% في كفاءة حجم المعالجة، بينما لا يتجاوز حجم نفايات الوسط المُولّد عُشر حجم نفايات الوسط. لا يُعد العمود المتجانس أكثر جدوى اقتصادية عند النظر إلى قيمة أوقات معالجة المنتج فحسب، بل إنه يستخدم كمية أقل من الوسط، مما يُمثل انخفاضًا كبيرًا في التكاليف المتغيرة.

مراجع

  1. ↑ ميلر، جيمس (2005). الكروماتوغرافيا (  الطبعة الثانية). هوبوكين، نيو جيرسي: جون وايلي وأولاده. ص  212. ISBN 978-0471472070.
  2. 1 2 غونزاليس-غونزاليس، ميرنا؛ مايولو-ديلويزا، كارلا؛ ريتو-بالوماريس، ماركو (2020-01-01)، "الفصل 5 - التطورات الحديثة في كروماتوغرافيا المونوليث القائمة على الأجسام المضادة للتطبيقات العلاجية"، في ماتي، آلان (محرر)، مناهج تنقية وتحليل وتوصيف العلاجات القائمة على الأجسام المضادة ، إلسيفير، ص 105-116 ، doi : 10.1016/b978-0-08-103019-6.00005-9 ، ISBN  978-0-08-103019-6، S2CID 226450210 
  3. 1 2 3 "القضاء على اختناق المعالجة اللاحقة باستخدام المونوليثات والكروماتوغرافيا ذات الطبقة المتحركة المحاكاة." بيت غانيون، BioProcess International، سبتمبر 2008.
  4. ↑ "الأعمدة المتجانسة المسامية: أحدث جيل من الأطوار الثابتة لتقنية HPLC والأساليب ذات الصلة." التطورات الحديثة في تكنولوجيا أعمدة LC، يونيو 2003، 24-28.
  5. ↑ تاريخ الكروماتوغرافيا
  6. 1 2 3 4 "يُنظر إلى الكتل المتجانسة على أنها تُعيد تنشيط عمليات الفصل البيولوجي: ستوسع الأبحاث الجديدة نطاق التطبيقات." أخبار الهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية، أكتوبر 2006 (المجلد 26، العدد 17).
  7. 1 2 3 "الكروماتوغرافيا المتجانسة: مواد الأعمدة غير التقليدية تحسن فصل المخاليط الحيوية." مؤرشف في 2008-08-29 في Wayback Machine Chemical & Engineering News، ديسمبر 2006، 84(50)، 14-19.
  8. ↑ إيتري، ليزلي (مايو 2005). "تشابا هورفاث وتطوير أول جهاز كروماتوغرافيا سائلة عالي الأداء حديث" . LCGC أمريكا الشمالية . LCGC أمريكا الشمالية - 1 مايو 2005. 23 (5). LC-GC أمريكا الشمالية: 486-495 . تم الاطلاع عليه في 1 مايو 2005 .
  9. ↑ "أجهزة التحليل المختبري: لمحة عامة عن الصناعة." www.galenet.galegroup.com، فبراير 2009.
  10. ↑ «تبلغ قيمة سوق أجهزة كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) عالميًا أكثر من 2.5 مليار دولار أمريكي» . www.laboratoryequipmentworld.com. مؤرشف من الأصل بتاريخ 4 فبراير 2009. تم الاطلاع عليه بتاريخ 14 مايو 2009 .
  11. 1 2 3 "أبرز التقنيات والتطبيقات في مؤتمر HPLC 2007". مؤرشف في 2011-07-11 في Wayback Machine LCGC أمريكا الشمالية، 25(10)، 1000-1012.
  12. 1 2 "أبرز أحداث HPLC 2003". مؤرشف في 2011-07-11 في Wayback Machine LCGC أمريكا الشمالية، 21(9)، 872-887.
  13. ^ ليانجسوبري، ثانابورن؛ مولتيا، إيفجين؛ ميتسو، جاري؛ جوهياينن، ماتي؛ فورسين، باتريك؛ فورنستيدت، تورجني؛ أورني، كاتارينا؛ بودجورنيك، أليس؛ ريكولا، مارجا ليزا (2019). "طريقة العزل الكروماتوجرافي السريع للـ LDL في البلازما البشرية بواسطة أقراص كوندرويتين-6-كبريتات الثابتة والأجسام المضادة لـ apoB-100 جنبًا إلى جنب" . التقارير العلمية . 9 11235. دوى : 10.1038/s41598-019-47750-z . بمك 6677805 . 
  14. ↑Multia, Evgen; Tear, Crystal Jing Ying; Palviainen, Mari; Siljander, Pia; Riekkola, Marja-Liisa (2019). "Fast isolation of highly specific population of platelet-derived extracellular vesicles from blood plasma by affinity monolithic column, immobilized with anti-human CD61 antibody". Analytica Chimica Acta. 1091: 160–168. doi:10.1016/j.aca.2019.09.022. hdl:10138/321264.
  15. ↑Multia, Evgen; Liangsupree, Thanaporn; Jussila, Matti; Ruiz-Jimenez, Jose; Kemell, Marianna; Riekkola, Marja-Liisa (2020). "Automated on-line isolation and fractionation system for nanosized biomacromolecules from human plasma". Analytical Chemistry. 92 (19): 13058–13065. doi:10.1021/acs.analchem.0c01986. PMC 7586295.
  16. ↑Liangsupree, Thanaporn; Multia, Evgen; Saarinen, Jukka; Ruiz-Jimenez, Jose; Kemell, Marianna; Riekkola, Marja-Liisa (2022). "Raman spectroscopy combined with comprehensive gas chromatography for label-free characterization of plasma-derived extracellular vesicle subpopulations". Analytical Biochemistry. 647 114672. doi:10.1016/j.ab.2022.114672. hdl:10138/346837.
  17. ↑Liangsupree, Thanaporn; Multia, Evgen; Forssén, Patrik; Fornstedt, Torgny; Riekkola, Marja-Liisa (2022). "Kinetics and interaction studies of anti-tetraspanin antibodies and ICAM-1 with extracellular vesicle subpopulations using continuous flow quartz crystal microbalance biosensor". Biosensors and Bioelectronics. 206 114151. doi:10.1016/j.bios.2022.114151. hdl:10138/344190.
  18. ↑Wiedmer, Susanne K.; Multia, Evgen; Liangsupree, Thanaporn; Riekkola, Marja-Liisa (2023). "Automated On-Line Isolation and Fractionation Method for Subpopulations of Extracellular Vesicles". In Vainio, Seppo (ed.). Cell-Secreted Vesicles: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Vol. 2668. Humana. pp. 99–108. doi:10.1007/978-1-0716-3203-1_8.
  • “History of HPLC.” https://web.archive.org/web/20100410045845/http://kerouac.pharm.uky.edu/.