المجهر الضوئي

يستخدم المجهر البسيط عدسة أو مجموعة عدسات لتكبير الجسم من خلال التكبير الزاوي فقط، مما يعطي المشاهد صورة افتراضية مكبرة معتدلة . ^{[ 6 ] [ 7 ]} ويُستخدم عدسة محدبة واحدة أو مجموعات من العدسات في أجهزة التكبير البسيطة مثل العدسة المكبرة ، والعدسات المكبرة ، والعدسات العينية للتلسكوبات والمجاهر .

يستخدم المجهر المركب عدسة قريبة من الجسم المراد فحصه لتجميع الضوء (تسمى العدسة الشيئية )، والتي بدورها تركز صورة حقيقية للجسم داخل المجهر. ثم تُكبَّر هذه الصورة بواسطة عدسة ثانية أو مجموعة عدسات (تسمى العدسة العينية ) تُعطي المشاهد صورة وهمية مقلوبة مكبرة للجسم. ^{[ 5 ]}

يُتيح استخدام عدسة موضوعية مركبة وعدسة عينية تكبيرًا زاويًا أعلى بكثير: بالنسبة لجسم ذي ارتفاع${\displaystyle h}$، ويمكن أن يشغل على الأكثر حجمًا زاويًا غير مكبر${\displaystyle \theta _{0}=h/d_{0}}$مع الحفاظ على التركيز، وهو ما يتحقق عند وضعها على مسافة النقطة القريبة${\displaystyle d_{0}}$يبلغ قطرها حوالي 11 سم. وتصل الصورة الافتراضية التي يُنشئها المجهر المركب إلى حجم زاوي قدره ${\displaystyle \theta =-hs/f_{\text{objective}}f_{\text{eyepiece}}}$، أين${\displaystyle s}$هي المسافة بين نقطتي البؤرة المجاورة للعدسة الشيئية والعدسة العينية. وهذا تكبير زاوي لـ${\displaystyle \theta /\theta _{0}=-sd_{0}/f_{\text{objective}}f_{\text{eyepiece}}}$.

تتميز المجاهر المركبة الشائعة عادةً بعدسات موضوعية قابلة للتبديل، مما يسمح للمستخدم بضبط التكبير بسرعة. ^{[ 5 ]} كما يتيح المجهر المركب إعدادات إضاءة أكثر تقدماً، مثل تباين الطور .

توجد العديد من أنواع تصميم المجهر الضوئي المركب لأغراض متخصصة. بعض هذه الاختلافات عبارة عن اختلافات في التصميم المادي تسمح بالتخصيص لأغراض معينة:

• المجهر المجسم ، وهو مجهر ذو طاقة منخفضة يوفر رؤية مجسمة للعينة، ويستخدم عادة في التشريح.
• يحتوي المجهر المقارن على مسارين ضوئيين منفصلين يسمحان بالمقارنة المباشرة بين عينتين من خلال صورة واحدة في كل عين.
• المجهر المقلوب ، لدراسة العينات من الأسفل؛ مفيد لزراعة الخلايا في السوائل أو لعلم المعادن.
• مجهر فحص موصلات الألياف الضوئية، مصمم لفحص سطح نهاية الموصل
• مجهر متنقل ، لدراسة عينات ذات دقة بصرية عالية .

تم تصميم أنواع أخرى من المجاهر لتقنيات إضاءة مختلفة:

• المجهر البتروغرافي ، الذي يتضمن تصميمه عادةً مرشح استقطاب، ومنصة دوارة، ولوحة جبسية لتسهيل دراسة المعادن أو المواد البلورية الأخرى التي يمكن أن تختلف خصائصها البصرية باختلاف الاتجاه.
• المجهر المستقطب ، وهو مشابه للمجهر البتروغرافي.
• المجهر ذو التباين الطوري ، الذي يستخدم طريقة الإضاءة بالتباين الطوري.
• مجهر التألق الضوئي ، مصمم لتحليل العينات التي تحتوي على مواد فلورية.
• المجهر البؤري ، وهو نوع شائع الاستخدام من الإضاءة فوق البنفسجية التي تستخدم ليزرًا ماسحًا لإضاءة العينة من أجل الفلورة.
• المجهر ثنائي الفوتون ، يستخدم لتصوير الفلورة في أعماق الأوساط المشتتة وتقليل التبييض الضوئي، وخاصة في العينات الحية.
• مجهر الطلاب – مجهر ذو قوة تكبير منخفضة في الغالب، مزود بأدوات تحكم مبسطة وأحيانًا ببصريات منخفضة الجودة، مصمم للاستخدام المدرسي أو كأداة تمهيدية للأطفال. ^{[ 8 ]}
• المجهر فائق الدقة ، وهو مجهر ضوئي مُعدَّل يستخدم تشتت الضوء للسماح برؤية الجسيمات الصغيرة التي يقل قطرها عن أو يقارب طول موجة الضوء المرئي (حوالي 500 نانومتر)؛ وقد أصبح في الغالب قديمًا منذ ظهور المجاهر الإلكترونية
• المجهر الراماني المُحسَّن بالطرف هو نوع من أنواع المجاهر الضوئية يعتمد على مطيافية رامان المُحسَّنة بالطرف ، دون قيود الدقة التقليدية القائمة على الطول الموجي. ^{[ 9 ] [ 10 ]} يُصنع هذا المجهر بشكل أساسي على منصات مجاهر المسح الضوئي باستخدام أدوات بصرية بالكامل.

المجهر الرقمي هو مجهر مزود بكاميرا رقمية تتيح مراقبة العينة عبر الحاسوب . ويمكن التحكم بالمجاهر جزئيًا أو كليًا بواسطة الحاسوب بمستويات مختلفة من الأتمتة. يتيح المجهر الرقمي تحليلًا أدق لصورة المجهر، كقياس المسافات والمساحات، وتحديد كمية الصبغة الفلورية أو النسيجية .

تتوفر تجارياً أيضاً مجاهر رقمية منخفضة الطاقة، تُعرف بمجاهر USB . وهي عبارة عن كاميرات ويب مزودة بعدسة ماكرو عالية الطاقة ، ولا تستخدم عادةً تقنية الإضاءة الخلفية . تُوصل الكاميرا مباشرةً بمنفذ USB في الكمبيوتر لعرض الصور مباشرةً على الشاشة. وتُوفّر الإضاءة عالية الطاقة عادةً بواسطة مصدر أو مصادر LED مجاورة لعدسة الكاميرا.

تتوفر تقنية المجهر الرقمي بمستويات إضاءة منخفضة للغاية لتجنب إتلاف العينات البيولوجية الحساسة، وذلك باستخدام كاميرات رقمية حساسة تعتمد على عدّ الفوتونات . وقد ثبت أن مصدر الضوء الذي يوفر أزواجًا من الفوتونات المتشابكة قد يقلل من خطر تلف العينات الأكثر حساسية للضوء. في هذا التطبيق للتصوير الطيفي في المجهر ذي الفوتونات القليلة، تُضاء العينة بفوتونات الأشعة تحت الحمراء، يرتبط كل منها مكانيًا بنظير متشابك في نطاق الضوء المرئي، وذلك للحصول على تصوير فعال بواسطة كاميرا عدّ الفوتونات. ^{[ 11 ]}

كانت أقدم المجاهر عبارة عن عدسات مكبرة أحادية ذات تكبير محدود، ويعود تاريخها على الأقل إلى الاستخدام الواسع النطاق للعدسات في النظارات في القرن الثالث عشر. ^{[ 12 ]}

ظهرت المجاهر المركبة لأول مرة في أوروبا حوالي عام 1620 ^{[ 13 ] [ 1 ]} بما في ذلك مجهر عرضه كورنيليس دريبل في لندن (حوالي عام 1621) وآخر عُرض في روما عام 1624. ^{[ 14 ] [ 1 ]}

لا يزال المخترع الحقيقي للمجهر المركب مجهولاً، على الرغم من كثرة الادعاءات التي طُرحت على مر السنين. من بين هذه الادعاءات، ادعاءٌ صدر بعد 35 ^{عامًا من ظهورها} ، من ^صانع النظارات الهولندي يوهانس زاكارياسن ^، بأن والده، ^زكرياس يانسن ، ^{هو من} اخترع المجهر المركب و/أو التلسكوب في وقت مبكر من عام 1590. وتُشير شهادة يوهانس، التي يشكك البعض في صحتها، إلى أن ^{تاريخ الاختراع يعود إلى زمنٍ بعيدٍ جدًا ،} لدرجة أن زكرياس كان طفلاً آنذاك، مما يُثير تكهناتٍ بأنه لكي يكون ادعاء يوهانس صحيحًا، كان لا بد أن يكون جد يوهانس، هانز مارتنز، هو من اخترع المجهر المركب. ^{وهناك ادعاءٌ آخر} مفاده أن منافس يانسن، هانز ليبرشي (الذي تقدم بطلب للحصول على براءة اختراع التلسكوب الأولى عام 1608)، هو أيضًا من اخترع المجهر المركب. ^{[ 19 ]} ويشير مؤرخون آخرون إلى المبتكر الهولندي كورنيليس دريبل ومجهره المركب الذي صنعه عام 1621. ^{[ 14 ] [ 1 ]}

يُنسب اختراع المجهر المركب أحيانًا إلى غاليليو غاليلي . فبعد عام 1610، اكتشف أنه يستطيع ضبط بؤرة تلسكوبه بدقة لرؤية الأجسام الصغيرة، كالذباب، عن قرب ^{[ 20 ]} ، أو النظر من خلال الطرف الآخر لتكبير الأجسام الصغيرة. ^{[ 21 ]} وكان العيب الوحيد هو أن تلسكوبه، الذي يبلغ طوله قدمين، كان يحتاج إلى تمديده إلى ستة أقدام لرؤية الأجسام القريبة جدًا. ^{[ 22 ]} وبعد أن شاهد غاليليو المجهر المركب الذي صنعه دريبل معروضًا في روما عام 1624، صنع نسخة محسّنة خاصة به. ^{[ 14 ] [ 1 ]} وفي عام 1625، أطلق جيوفاني فابر اسم " مجهر" على المجهر المركب الذي قدمه غاليليو إلى أكاديمية لينسي عام 1624 ^{[ 23 ]} (كان غاليليو قد أطلق عليه اسم " أوكولينو " أو " العين الصغيرة "). صاغ فابر الاسم من الكلمتين اليونانيتين μικρόν (ميكرون) بمعنى "صغير"، و σκοπεῖν (سكوبين) بمعنى "ينظر إلى"، وهو اسم يقصد به أن يكون مماثلاً لكلمة "تلسكوب"، وهي كلمة أخرى صاغها اللينسيون. ^{[ 24 ]}

قام كريستيان هويغنز ، وهو هولندي آخر، بتطوير نظام عدسة عينية بسيط ثنائي العدسات في أواخر القرن السابع عشر، وكان مصححًا لونيًا ، مما شكّل نقلة نوعية في تطوير المجاهر. ولا تزال عدسة هويغنز العينية تُصنع حتى يومنا هذا، إلا أنها تعاني من صغر حجم مجال الرؤية، وبعض العيوب الطفيفة الأخرى.

يُنسب إلى أنطوني فان ليفينهوك (1632-1724) الفضل في لفت انتباه علماء الأحياء إلى المجهر، على الرغم من أن العدسات المكبرة البسيطة كانت تُصنع بالفعل في القرن السادس عشر. كانت مجاهر فان ليفينهوك المنزلية الصنع مجاهر بسيطة، مزودة بعدسة واحدة صغيرة جدًا ولكنها قوية. كانت صعبة الاستخدام، لكنها مكّنت فان ليفينهوك من رؤية صور مفصلة. استغرق الأمر حوالي 150 عامًا من التطوير البصري قبل أن يتمكن المجهر المركب من توفير نفس جودة الصورة التي توفرها مجاهر فان ليفينهوك البسيطة، وذلك بسبب صعوبات في تركيب عدسات متعددة. في خمسينيات القرن التاسع عشر، اخترع جون ليونارد ريدل ، أستاذ الكيمياء في جامعة تولين ، أول مجهر ثنائي العدسات عملي أثناء إجرائه واحدة من أوائل وأشمل الدراسات المجهرية الأمريكية للكوليرا . ^{[ 26 ] [ 27 ]}

على الرغم من أن تقنية المجهر الأساسية والبصريات كانت متاحة لأكثر من 400 عام، إلا أنه في الآونة الأخيرة تم تطوير تقنيات إضاءة العينات لإنتاج الصور عالية الجودة التي نراها اليوم.

في أغسطس 1893، طوّر أوغست كولر تقنية إضاءة كولر . تُنتج هذه الطريقة إضاءةً متجانسةً للغاية للعينات، وتتغلب على العديد من قيود التقنيات القديمة لإضاءة العينات. قبل تطوير إضاءة كولر، كانت صورة مصدر الضوء، مثل فتيل المصباح الكهربائي ، ظاهرةً دائمًا في صورة العينة.

مُنحت جائزة نوبل في الفيزياء للعالم الفيزيائي الهولندي فريتس زيرنيكه عام 1953 لتطويره تقنية إضاءة التباين الطوري التي تُتيح تصوير العينات الشفافة. وباستخدام التداخل بدلاً من امتصاص الضوء، يُمكن تصوير عينات شفافة للغاية، مثل خلايا الثدييات الحية ، دون الحاجة إلى استخدام تقنيات التلوين. وبعد ذلك بعامين فقط، في عام 1955، نشر جورج نومارسكي نظرية مجهر التباين التداخلي التفاضلي ، وهي تقنية تصوير أخرى تعتمد على التداخل .

يعتمد المجهر البيولوجي الحديث بشكل كبير على تطوير مجسات فلورية لتصوير تراكيب محددة داخل الخلية. وعلى عكس المجهر الضوئي التقليدي، يُضاء المجهر الفلوري العينة من خلال العدسة الشيئية بنطاق ضيق من الأطوال الموجية. يتفاعل هذا الضوء مع جزيئات الفلوروفور في العينة، والتي بدورها تُصدر ضوءًا بطول موجي أطول . هذا الضوء المنبعث هو الذي يُشكل الصورة.

منذ منتصف القرن العشرين، استُخدمت الأصباغ الكيميائية الفلورية، مثل DAPI الذي يرتبط بالحمض النووي ، لتحديد تراكيب معينة داخل الخلية. ومن التطورات الحديثة تقنية التألق المناعي ، التي تستخدم أجسامًا مضادة موسومة بصبغات فلورية للتعرف على بروتينات محددة داخل العينة، بالإضافة إلى البروتينات الفلورية مثل GFP التي يمكن للخلايا الحية التعبير عنها، مما يجعلها فلورية.

العدسة العينية ، أو العدسة المُرَكَّبة، عبارة عن أسطوانة تحتوي على عدستين أو أكثر؛ ووظيفتها هي تركيز الصورة للعين. تُركَّب العدسة العينية في الطرف العلوي لأنبوب المجهر. العدسات العينية قابلة للتبديل، ويمكن تركيب أنواع مختلفة منها بدرجات تكبير متفاوتة. تشمل قيم التكبير الشائعة للعدسات العينية 5×، و10× (الأكثر شيوعًا)، و15×، و20×. في بعض المجاهر عالية الأداء، يُطابق التكوين البصري للعدسة الشيئية والعدسة العينية لتحقيق أفضل أداء بصري ممكن. ويحدث هذا غالبًا مع العدسات الشيئية اللا لونية .

برج العدسات الموضوعية، أو القرص الدوار، أو قطعة الأنف الدوارة، هو الجزء الذي يحمل مجموعة العدسات الموضوعية. وهو يسمح للمستخدم بالتبديل بين العدسات الموضوعية. ^{[ 28 ]}

في الجزء السفلي من المجهر الضوئي المركب النموذجي، توجد عدسة موضوعية واحدة أو أكثر تجمع الضوء من العينة. عادةً ما تكون العدسة الموضوعية داخل غلاف أسطواني يحتوي على عدسة زجاجية مركبة أحادية أو متعددة العناصر. في العادة، توجد حوالي ثلاث عدسات موضوعية مثبتة في قطعة دائرية قابلة للدوران لاختيار العدسة المطلوبة. صُممت هذه العدسات لتكون متحدة البؤرة ، أي أن العينة تبقى في بؤرة التركيز عند تغيير العدسة في المجهر . تتميز العدسات الموضوعية للمجهر بمعاملين رئيسيين: التكبير والفتحة العددية . يتراوح التكبير عادةً من 5× إلى 100×، بينما تتراوح الفتحة العددية من 0.14 إلى 0.7، ما يُقابل أطوال بؤرية تتراوح بين 40 و2 مم تقريبًا، على التوالي. تتميز العدسات الموضوعية ذات التكبيرات العالية بفتحة عددية أكبر وعمق مجال  أقصر في الصورة الناتجة. قد تتطلب بعض العدسات الموضوعية عالية الأداء عدسات عينية متوافقة لتحقيق أفضل أداء بصري.

عدسة غمر الزيت

تستخدم بعض المجاهر عدسات غمر زيتي أو عدسات غمر مائي للحصول على دقة أعلى عند التكبير العالي. وتُستخدم هذه العدسات مع مواد مطابقة لمعامل الانكسار ، مثل زيت الغمر أو الماء، وغطاء زجاجي مطابق بين العدسة الشيئية والعينة. معامل انكسار المادة المطابقة أعلى من معامل انكسار الهواء، مما يسمح للعدسة الشيئية بفتحة عددية أكبر (أكبر من 1)، بحيث ينتقل الضوء من العينة إلى السطح الخارجي للعدسة الشيئية بأقل قدر من الانكسار. ويمكن الوصول إلى فتحات عددية تصل إلى 1.6. ^{[ 29 ]} تسمح الفتحة العددية الأكبر بتجميع كمية أكبر من الضوء، مما يُتيح الملاحظة الدقيقة للتفاصيل الصغيرة. عادةً ما يكون تكبير عدسة الغمر الزيتي من 40 إلى 100 ضعف.

تُحرّك مقابض الضبط المنصة لأعلى ولأسفل مع إمكانية ضبط التركيز الخشن والدقيق بشكل منفصل. وتُمكّن هذه المقابض المجهر من التكيف مع عينات ذات سماكات مختلفة. في التصاميم القديمة للمجاهر، كانت عجلات ضبط التركيز تُحرّك أنبوب المجهر لأعلى أو لأسفل بالنسبة للحامل، وكانت المنصة ثابتة.

تُثبّت المجموعة البصرية بأكملها عادةً على ذراع صلبة، والتي بدورها تُثبّت على قاعدة متينة على شكل حرف U لتوفير الصلابة اللازمة. ويمكن تعديل زاوية الذراع لضبط زاوية الرؤية.

يوفر الإطار نقطة تثبيت لمختلف أدوات التحكم في المجهر. عادةً ما تشمل هذه الأدوات أدوات ضبط التركيز، كعجلة كبيرة مُسننة لضبط التركيز التقريبي، وعجلة أصغر مُسننة لضبط التركيز الدقيق. وقد تشمل الميزات الأخرى أدوات التحكم في المصباح و/أو أدوات ضبط المكثف.

المنصة عبارة عن سطح أسفل العدسة الشيئية يدعم العينة المراد فحصها. يوجد في مركز المنصة فتحة يمر الضوء من خلالها لإضاءة العينة. عادةً ما تحتوي المنصة على أذرع لحمل الشرائح الزجاجية (ألواح زجاجية مستطيلة بأبعاد نموذجية 25×75  مم، تُثبّت عليها العينة).

عند التكبيرات التي تتجاوز 100 ضعف، يصبح تحريك الشريحة يدويًا غير عملي. لذا، توفر المنصة الميكانيكية، الموجودة عادةً في المجاهر متوسطة وعالية السعر، إمكانية تحريك الشريحة بدقة متناهية عبر مقابض تحكم تُعيد وضع العينة/الشريحة حسب الحاجة. وإذا لم يكن المجهر مزودًا بمنصة ميكانيكية في الأصل، فمن الممكن إضافة واحدة.

تتحرك جميع المنصات لأعلى ولأسفل لضبط التركيز. أما المنصة الميكانيكية، فتتحرك الشرائح على محورين أفقيين لتحديد موضع العينة وفحص تفاصيلها.

يبدأ التركيز عند تكبير منخفض لتمكين المستخدم من توسيط العينة على المنصة. يتطلب الانتقال إلى تكبير أعلى رفع المنصة عموديًا لإعادة التركيز عند التكبير الأعلى، وقد يتطلب أيضًا تعديلًا طفيفًا في موضع العينة أفقيًا. يُعدّ تعديل موضع العينة أفقيًا السبب الرئيسي لوجود منصة ميكانيكية.

نظراً لصعوبة تحضير العينات وتثبيتها على الشرائح، فمن الأفضل للأطفال البدء بشرائح محضرة مسبقاً ومتمركزة ويمكن التركيز عليها بسهولة بغض النظر عن مستوى التركيز المستخدم.

يمكن استخدام مصادر إضاءة متعددة. في أبسط صورها، يُوجَّه ضوء النهار عبر مرآة . مع ذلك، تحتوي معظم المجاهر على مصدر إضاءة خاص بها قابل للتعديل والتحكم، وغالبًا ما يكون مصباح هالوجين ، على الرغم من أن الإضاءة باستخدام مصابيح LED والليزر أصبحت أكثر شيوعًا. أما إضاءة كولر، فتُستخدم عادةً في الأجهزة الأكثر تكلفة.

المكثف عدسة مصممة لتركيز الضوء من مصدر الإضاءة على العينة. وقد يشتمل المكثف أيضًا على مكونات أخرى، مثل غشاء و/أو مرشحات، للتحكم في جودة الإضاءة وشدتها. في تقنيات الإضاءة مثل المجهر ذي الحقل المظلم ، ومجهر تباين الطور ، ومجهر تباين التداخل التفاضلي ، يجب محاذاة المكونات البصرية الإضافية بدقة في مسار الضوء.

تُحسب قوة التكبير الفعلية للمجهر الضوئي المركب بضرب قوة العدسة العينية في قوة العدسة الشيئية. فعلى سبيل المثال، ينتج عن تكبير العدسة العينية 10x وتكبير العدسة الشيئية 100x تكبير إجمالي قدره 1000x. ويمكن لبعض الظروف المُعدّلة، كاستخدام الزيت أو الأشعة فوق البنفسجية، أن تزيد من دقة الصورة وتتيح رؤية تفاصيل واضحة عند تكبيرات تتجاوز 1000x.

تتوفر العديد من التقنيات التي تُعدّل مسار الضوء لإنتاج صورة ذات تباين مُحسّن من العينة. تشمل التقنيات الرئيسية لزيادة التباين من العينة: الضوء المستقطب المتقاطع ، والمجال المظلم ، وتباين الطور ، وإضاءة تباين التداخل التفاضلي . وتجمع تقنية حديثة ( سارفوس ) بين الضوء المستقطب المتقاطع وشرائح مُحسّنة التباين لتصوير العينات النانومترية.

• أربعة أمثلة على تقنيات الإضاءة الخلفية المستخدمة لتوليد التباين في عينة من ورق المناديل . 1.559 ميكرومتر/بكسل.
• 
  في الإضاءة الساطعة ، يأتي تباين العينة من امتصاص الضوء في العينة.
• 
  الإضاءة المستقطبة المتقاطعة ، تباين العينة ناتج عن دوران الضوء المستقطب عبر العينة.
• 
  في الإضاءة ذات المجال المظلم ، يأتي تباين العينة من الضوء المتناثر بواسطة العينة.
• 
  في إضاءة التباين الطوري ، يأتي تباين العينة من تداخل أطوال المسارات المختلفة للضوء عبر العينة.

تتيح المجاهر الحديثة أكثر من مجرد مراقبة صورة الضوء النافذ للعينة؛ فهناك العديد من التقنيات التي يمكن استخدامها لاستخلاص أنواع أخرى من البيانات. ويتطلب معظم هذه التقنيات معدات إضافية إلى جانب المجهر المركب الأساسي.

• الضوء المنعكس، أو الإضاءة الساقطة (لتحليل هياكل الأسطح)
• المجهر الفلوري، كلاهما:

• المجهر الفلوري
• المجهر متحد البؤر

• التحليل الطيفي المجهري (حيث يتم دمج مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية مع مجهر ضوئي)
• المجهر فوق البنفسجي
• المجهرية القريبة من الأشعة تحت الحمراء
• المجهر متعدد الإرسال ^{[ 30 ]} لتحسين التباين وتقليل الانحراف.
• الأتمتة (للمسح التلقائي لعينة كبيرة أو التقاط الصور)

تتوفر تقنيات متعددة للوصول إلى دقة أعلى من حد الضوء المنقول المذكور أعلاه. كما أن تقنيات التصوير المجسم، كما وصفها كورجون وبولابوا في عام 1979، قادرة أيضاً على تجاوز حد الدقة هذا، على الرغم من أن الدقة كانت محدودة في تحليلهما التجريبي. ^{[ 39 ]}

باستخدام العينات الفلورية، تتوفر تقنيات أخرى. ومن الأمثلة على ذلك تقنية Vertico SMI ، والمجهر الضوئي الماسح للمجال القريب الذي يستخدم الموجات المتلاشية ، وتقنية استنزاف الانبعاث المحفز . في عام 2005، وُصف مجهر قادر على كشف جزيء واحد كأداة تعليمية. ^{[ 40 ]}

على الرغم من التقدم الكبير الذي أحرز في العقد الماضي، إلا أن تقنيات تجاوز حد الانعراج لا تزال محدودة ومتخصصة.

بينما تركز معظم التقنيات على زيادة الدقة الجانبية، توجد أيضاً بعض التقنيات التي تهدف إلى تحليل العينات الرقيقة للغاية. على سبيل المثال، تضع طرق سارفوس العينة الرقيقة على سطح مُحسِّن للتباين، مما يسمح بتصوير الأغشية الرقيقة التي يصل سمكها إلى 0.3 نانومتر بشكل مباشر.

في 8 أكتوبر 2014، مُنحت جائزة نوبل في الكيمياء لإريك بيتزيج وويليام مورنر وستيفان هيل لتطويرهم تقنية المجهر الفلوري فائق الدقة . ^{[ 41 ] [ 42 ]}

المجهر الموضعي SPDMphymod

تقنية SPDM (مجهر المسافة الطيفي الدقيق)، وهي تقنية أساسية في مجهر التموضع، تعتمد على الضوء في مجهر التألق، وتتيح قياس الموقع والمسافة والزاوية لجزيئات "معزولة ضوئيًا" (مثل الجزيئات) بدقة أقل بكثير من الحد النظري لدقة المجهر الضوئي. ويعني مصطلح "معزولة ضوئيًا" أنه في لحظة معينة، يتم تسجيل جزيء واحد فقط ضمن منطقة ذات حجم محدد بدقة بصرية تقليدية ( قطرها  عادةً حوالي 200-250 نانومتر ). ويتحقق ذلك عندما تحمل الجزيئات ضمن هذه المنطقة علامات طيفية مختلفة (مثل ألوان مختلفة أو اختلافات أخرى قابلة للاستخدام في انبعاث الضوء من جزيئات مختلفة). ^{[ 45 ] [ 46 ] [ 47 ] [ 48 ]}

يمكن استخدام العديد من الأصباغ الفلورية القياسية، مثل GFP وأصباغ أليكسا وأصباغ أتو وCy2/Cy3 وجزيئات الفلورسين، في مجهر التموضع، شريطة توفر شروط فيزيائية ضوئية معينة. وباستخدام تقنية SPDMphymod (الفلوروفورات القابلة للتعديل الفيزيائي)، يكفي استخدام طول موجي ليزري واحد ذي شدة مناسبة للتصوير النانوي. ^{[ 49 ]}

ستيد

يُعدّ استنفاد الانبعاث المحفز مثالًا بسيطًا على إمكانية الحصول على دقة أعلى تتجاوز حدّ الانعراج، ولكنه ينطوي على قيود كبيرة. تقنية STED هي تقنية مجهرية فلورية تستخدم مزيجًا من نبضات الضوء لتحفيز الفلورة في مجموعة فرعية صغيرة من الجزيئات الفلورية في العينة. يُنتج كل جزيء بقعة ضوئية محدودة الانعراج في الصورة، ويتوافق مركز كل بقعة مع موقع الجزيء. نظرًا لانخفاض عدد الجزيئات الفلورية، فمن غير المرجح أن تتداخل بقع الضوء، وبالتالي يمكن تحديد مواقعها بدقة. تُكرر هذه العملية عدة مرات لتكوين الصورة. حصل ستيفان هيل، من معهد ماكس بلانك للكيمياء الفيزيائية الحيوية، على جائزة المستقبل الألمانية العاشرة عام 2006 وجائزة نوبل في الكيمياء عام 2014 لتطويره مجهر STED والمنهجيات المرتبطة به. ^{[ 51 ]}

• فان هيلدن، ألبرت؛ دوبري، سفين. فان جينت، روب (2011). أصول التلسكوب . مطبعة جامعة أمستردام. رقم ISBN 978-90-6984-615-6.