التشخيص الجزيئي

أدى تصنيع أدوات التحليل البيولوجي الجزيئي إلى جعل استخدامها عمليًا في العيادات. ^{[ 2 ] : مقدمة.} يمكن لتصغير حجم هذه الأدوات إلى جهاز محمول واحد أن يُتيح إجراء التشخيص الطبي في العيادة، وفي المكتب، أو المنزل. ^{[ 2 ] : مقدمة.} يتطلب المختبر السريري معايير عالية من الموثوقية؛ وقد تتطلب التشخيصات اعتماد أو تخضع للوائح الأجهزة الطبية. ^{[ 15 ]} اعتبارًا من عام 2011ومع ذلك، استخدمت بعض المختبرات السريرية الأمريكية فحوصات تُباع "للاستخدام البحثي فقط". ^{[ 16 ]}

يجب أن تلتزم العمليات المختبرية باللوائح، مثل تعديلات تحسين المختبرات السريرية ، وقانون قابلية نقل التأمين الصحي والمساءلة ، وممارسات المختبرات الجيدة ، ومواصفات إدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة. وتساعد أنظمة إدارة معلومات المختبرات في تتبع هذه العمليات. ^{[ 17 ]} وتسري اللوائح على كل من الموظفين والمستلزمات. اعتبارًا من عام 2012تشترط اثنتا عشرة ولاية أمريكية حصول أخصائيي علم الأمراض الجزيئية على ترخيص؛ كما تقوم عدة مجالس، مثل المجلس الأمريكي لعلم الوراثة الطبية والمجلس الأمريكي لعلم الأمراض ، باعتماد الفنيين والمشرفين ومديري المختبرات. ^{[ 18 ]}

تساهم الأتمتة ووضع الرموز الشريطية للعينات في زيادة الإنتاجية إلى أقصى حد وتقليل احتمالية الخطأ أو التلوث أثناء المعالجة اليدوية وإعداد التقارير. تتوفر الآن أجهزة فردية لإجراء التحليل من البداية إلى النهاية. ^{[ 15 ]}

تستخدم التشخيصات الجزيئية فحوصات بيولوجية مخبرية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل المقترن بإنزيم الإليزا أو التهجين الموضعي الفلوري . ^{[ 19 ] [ 20 ]} يكشف هذا الفحص عن جزيء، غالبًا بتراكيز منخفضة، يُعد مؤشرًا على المرض أو خطر الإصابة به في عينة مأخوذة من المريض. يُعد حفظ العينة قبل التحليل أمرًا بالغ الأهمية، ويجب تقليل التعامل اليدوي معها إلى أدنى حد. ^{[ 21 ]} يُشكل جزيء الحمض النووي الريبوزي (RNA) الهش تحديات معينة. فهو، كجزء من العملية الخلوية للتعبير عن الجينات كبروتينات، يوفر مقياسًا للتعبير الجيني، ولكنه عرضة للتحلل المائي والتفكك بواسطة إنزيمات الريبونوكلياز (RNAse) الموجودة باستمرار . يمكن تجميد العينات تجميدًا سريعًا في النيتروجين السائل أو حضنها في مواد حافظة. ^{[ 2 ] : الفصل 39}

نظرًا لقدرة أساليب التشخيص الجزيئي على الكشف عن مؤشرات حساسة، تُعد هذه الاختبارات أقل توغلاً من الخزعة التقليدية . فعلى سبيل المثال، نظرًا لوجود الأحماض النووية الخالية من الخلايا في بلازما الدم البشري ، قد تكفي عينة دم بسيطة لأخذ عينة من المعلومات الوراثية من الأورام أو الأعضاء المزروعة أو الجنين. ^{[ 2 ] : الفصل 45.} تستخدم العديد من أساليب التشخيص الجزيئي، وليس جميعها، القائمة على الكشف عن الأحماض النووية، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لزيادة عدد جزيئات الحمض النووي بشكل كبير، وبالتالي تضخيم التسلسل (التسلسلات) المستهدف في عينة المريض. ^{[ 2 ] : مقدمة} . يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) طريقة يتم فيها تضخيم قالب الحمض النووي باستخدام بادئات اصطناعية، وإنزيم بوليميراز الحمض النووي، و dNTPs. يتم تدوير الخليط بين درجتي حرارة على الأقل: درجة حرارة عالية لفصل الحمض النووي المزدوج إلى جزيئات أحادية السلسلة، ودرجة حرارة منخفضة لتهجين البادئ مع القالب ولإطالة البادئ بواسطة إنزيم البوليميراز. نظريًا، تُضاعف كل دورة حرارية كمية التسلسل المستهدف. يتضمن الكشف عن اختلافات التسلسل باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عادةً تصميم واستخدام كواشف قليلة النوكليوتيدات التي تُضخّم المتغير المطلوب بكفاءة أعلى من التسلسل الأصلي. يُعدّ تفاعل البوليميراز المتسلسل حاليًا الطريقة الأكثر استخدامًا للكشف عن تسلسلات الحمض النووي. ^{[ 22 ]} قد يستخدم الكشف عن الواسم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي، أو التسلسل المباشر، ^{[ 2 ] أو} رقائق المصفوفات الدقيقة ^{ch 17} - وهي رقائق مُصنّعة مسبقًا لاختبار العديد من الواسمات في وقت واحد، ^{[ 2 ] أو ch 24} أو MALDI-TOF . ^{[ 23 ]} ينطبق المبدأ نفسه على البروتينوم والجينوم . يمكن لمصفوفات البروتين عالية الإنتاجية استخدام الحمض النووي التكميلي أو الأجسام المضادة للارتباط، وبالتالي يمكنها الكشف عن العديد من البروتينات المختلفة بالتوازي. ^{[ 24 ]} تختلف اختبارات التشخيص الجزيئي اختلافًا كبيرًا في الحساسية، ووقت الاستجابة، والتكلفة، والتغطية، والموافقات التنظيمية. كما تختلف أيضًا في مستوى التحقق المطبق في المختبرات التي تستخدمها. لذا، فإن التحقق المحلي القوي وفقًا للمتطلبات التنظيمية واستخدام الضوابط المناسبة أمر ضروري، لا سيما عندما يمكن استخدام النتيجة لاتخاذ قرار بشأن علاج المريض. ^{[ 25 ]}

فوائد

تعتمد الفحوصات التقليدية قبل الولادة للكشف عن التشوهات الكروموسومية ، مثل متلازمة داون، على تحليل عدد الكروموسومات ومظهرها - النمط النووي . أما الفحوصات التشخيصية الجزيئية، مثل فحص التهجين الجينومي المقارن باستخدام المصفوفات الدقيقة ، فتعتمد على عينة من الحمض النووي، ونظرًا لوجود الحمض النووي الحر في البلازما، قد تكون أقل توغلاً، ولكنها لا تزال، حتى عام 2013، تُعتبر فحصًا مكملاً للفحوصات التقليدية. ^{[ 26 ]}

يمكن لبعض التغيرات الجينية في النوكليوتيدات المفردة لدى المريض - وهي اختلافات طفيفة في حمضه النووي - أن تساعد في التنبؤ بسرعة استقلابه لأدوية معينة؛ وهذا ما يُعرف بعلم الصيدلة الجينية . ^{[ 27 ]} على سبيل المثال، يقوم إنزيم CYP2C19 باستقلاب العديد من الأدوية، مثل دواء كلوبيدوغريل المضاد للتخثر ، إلى أشكالها الفعالة. يمتلك بعض المرضى تغيرات جينية في مواقع محددة على جين 2C19 تجعلهم أقل قدرة على استقلاب هذه الأدوية؛ ويمكن للأطباء إجراء اختبارات للكشف عن هذه التغيرات الجينية ومعرفة ما إذا كانت الأدوية ستكون فعالة تمامًا لهذا المريض. ^{[ 28 ]} وقد ساعدت التطورات في البيولوجيا الجزيئية على إظهار أن بعض المتلازمات التي كانت تُصنف سابقًا كمرض واحد هي في الواقع أنواع فرعية متعددة ذات أسباب وعلاجات مختلفة تمامًا. يمكن أن تساعد التشخيصات الجزيئية في تشخيص النوع الفرعي - على سبيل المثال، العدوى والسرطانات - أو التحليل الجيني لمرض ذي مكون وراثي، مثل متلازمة سيلفر-راسل . ^{[ 1 ] [ 29 ]}

تُستخدم التشخيصات الجزيئية لتحديد الأمراض المعدية مثل الكلاميديا ^{​​[ 30 ]} ، وفيروس الإنفلونزا ^{[ 31 ]} ، والسل [ ^{32 ] ؛} أو سلالات محددة مثل فيروس H1N1 ^{[ 33 ]} أو فيروس SARS-CoV-2 ^{[ 34 ]} . يمكن أن يكون التحديد الجيني سريعًا؛ فعلى سبيل المثال، يُستخدم اختبار التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة لتشخيص طفيل الملاريا ، وهو اختبار قوي بما يكفي للدول النامية ^{[ 35 ]} . ولكن على الرغم من هذه التطورات في تحليل الجينوم، لا تزال العدوى في عام 2013 تُشخص في أغلب الأحيان بوسائل أخرى - مثل البروتينات، أو العاثيات ، أو النمط الكروماتوغرافي ^{[ 36 ]} . كما تُستخدم التشخيصات الجزيئية لفهم السلالة المحددة لمسببات الأمراض - على سبيل المثال، من خلال الكشف عن جينات مقاومة الأدوية التي تمتلكها - وبالتالي تحديد العلاجات التي يجب تجنبها. ^{[ 37 ] [ 36 ]} بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق فحوصات تعتمد على تسلسل الجيل التالي للميتاجينوم لتحديد الكائنات الممرضة دون تحيز. ^{[ 38 ]}

قد يحتوي جينوم المريض على طفرة وراثية أو عشوائية تؤثر على احتمالية إصابته بمرض ما في المستقبل. ^{[ 27 ]} على سبيل المثال، متلازمة لينش مرض وراثي يزيد من احتمالية إصابة المرضى بسرطان القولون والمستقيم وأنواع أخرى من السرطان؛ ويمكن أن يؤدي الكشف المبكر إلى مراقبة دقيقة تُحسّن فرص المريض في الحصول على نتيجة جيدة. ^{[ 39 ]} يُشار إلى خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية بواسطة المؤشرات الحيوية، ويمكن للفحص قياس خطر ولادة طفل مصاب بمرض وراثي مثل التليف الكيسي . ^{[ 40 ]} يُعدّ الاختبار الجيني معقدًا من الناحية الأخلاقية: فقد لا يرغب المرضى في تحمل ضغط معرفة مستوى الخطر لديهم. ^{[ 41 ]} في البلدان التي لا توفر رعاية صحية شاملة، قد يؤدي معرفة مستوى الخطر إلى زيادة أقساط التأمين. ^{[ 42 ]}

السرطان هو تغير في العمليات الخلوية يؤدي إلى نمو الورم بشكل خارج عن السيطرة. ^{[ 27 ]} قد تحمل الخلايا السرطانية طفرات في الجينات الورمية ، مثل KRAS و CTNNB1 (β-catenin). ^{[ 43 ]} يُمكّن تحليل البصمة الجزيئية للخلايا السرطانية - الحمض النووي ومستويات تعبيره عبر الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA ) - الأطباء من تحديد خصائص السرطان واختيار العلاج الأمثل لمرضاهم. ^{[ 27 ]} اعتبارًا من عام 2010، تُعدّ المقايسات التي تتضمن مجموعة من الأجسام المضادة ضد جزيئات بروتينية محددة تقنية ناشئة؛ وهناك آمال معقودة على هذه المقايسات المتعددة التي يمكنها قياس العديد من المؤشرات في آن واحد. ^{[ 44 ]} تشمل المؤشرات الحيوية المستقبلية المحتملة الأخرى جزيئات الحمض النووي الريبوزي الميكروي (microRNA )، التي تُعبّر عنها الخلايا السرطانية بكميات أكبر من الخلايا السليمة. ^{[ 45 ]}

السرطان مرضٌ ذو أسباب جزيئية متعددة وتطور مستمر. كما يتسم المرض بتنوع كبير حتى لدى الفرد الواحد. وقد أثبتت الدراسات الجزيئية للسرطان أهمية الطفرات المحفزة في نمو الأورام وانتشارها. ^{[ 46 ]} طُوّرت العديد من التقنيات للكشف عن تغيرات التسلسل الجيني لأغراض أبحاث السرطان. ويمكن تصنيف هذه التقنيات عمومًا إلى ثلاثة مناهج: تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والتهجين، وتقنية التسلسل من الجيل التالي (NGS). ^{[ 22 ]} حاليًا، اعتمدت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) العديد من فحوصات PCR والتهجين كأدوات تشخيصية مخبرية. ^{[ 47 ]} أما فحوصات NGS، فلا تزال في مراحلها الأولى في التشخيص السريري. ^{[ 48 ]}

لإجراء الاختبار التشخيصي الجزيئي للسرطان، تُعدّ دقة الكشف عن تغيرات تسلسل الحمض النووي (DNA) من أهمّ التحديات. تحتوي عينات خزعة الورم المستخدمة في التشخيص عادةً على نسبة ضئيلة تصل إلى 5% من الطفرة المستهدفة مقارنةً بالتسلسل الأصلي. كذلك، بالنسبة للتطبيقات غير الجراحية التي تُجرى على عينات الدم المحيطي أو البول، يجب أن يكون اختبار الحمض النووي دقيقًا بما يكفي للكشف عن الطفرات عند ترددات أليلية متغيرة تقل عن 0.1%. ^{[ 22 ]}

حالياً، ومن خلال تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR)، ظهر ابتكار جديد يُعرف بنظام الطفرات المقاومة للتضخيم (ARMS)، وهو طريقة للكشف عن متغيرات تسلسل الحمض النووي في السرطان. ويعتمد مبدأ عمل ARMS على حساسية نشاط التمديد الإنزيمي لبوليميراز الحمض النووي العالية لعدم التطابق بالقرب من النهاية 3' للبادئ. ^{[ 22 ]} وقد طورت العديد من الشركات اختبارات تشخيصية تعتمد على بادئات ARMS PCR. على سبيل المثال، طورت شركات Qiagen therascreen ^{[ 49 ]} و Roche cobas ^{[ 50 ]} وBiomerieux THxID ^{[ 51 ]} اختبارات PCR معتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) للكشف عن طفرات سرطان الرئة والقولون والورم الميلانيني النقيلي في جينات KRAS وEGFR وBRAF. وقد تم التحقق من صحة مجموعات التشخيص المختبري الخاصة بهم بشكل أساسي على الحمض النووي الجينومي المستخلص من أنسجة مثبتة بالفورمالين ومضمنة في البارافين (FFPE).

توجد أيضًا مصفوفات دقيقة تستخدم آلية التهجين لتشخيص السرطان. يمكن تصنيع أكثر من مليون مجس مختلف على مصفوفة باستخدام تقنية Genechip من Affymetrix، بحد كشف يتراوح بين نسخة واحدة وعشر نسخ من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) لكل بئر. ^{[ 22 ]} تُعتبر المصفوفات الدقيقة المُحسّنة قادرة على إنتاج قياس كمي نسبي قابل للتكرار لأهداف مختلفة. ^{[ 52 ]} حاليًا، وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على عدد من فحوصات التشخيص التي تستخدم المصفوفات الدقيقة: يمكن لفحوصات MammaPrint من Agendia تحديد خطر عودة سرطان الثدي من خلال تحليل التعبير عن 70 جينًا مرتبطًا بسرطان الثدي؛ ^{[ 53 ]} يمكن لفحص Autogenomics INFNITI CYP2C19 تحليل التعددات الشكلية الجينية، التي لها تأثير كبير على الاستجابة العلاجية لمضادات الاكتئاب؛ ^{[ 54 ]} ويمكن لفحص CytoScan Dx من Affymetrix تقييم الإعاقات الذهنية والاضطرابات الخلقية من خلال تحليل الطفرات الكروموسومية. ^{[ 55 ]}

في المستقبل، من المرجح أن تركز أدوات تشخيص السرطان على تقنية التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS). وباستخدام تسلسل الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبوزي RNA لتشخيص السرطان، ستشهد تقنيات التشخيص الجزيئي تطورًا ملحوظًا. ورغم انخفاض إنتاجية وتكلفة تقنية NGS بشكل كبير خلال السنوات العشر الماضية بنحو 100 ضعف، إلا أننا ما زلنا بعيدين، بمقدار ستة أضعاف على الأقل، عن إجراء تسلسل عميق على مستوى الجينوم الكامل. ^{[ 22 ]} وقد طورت شركة Ion Torrent حاليًا بعض لوحات NGS القائمة على تقنية AmpliSeq الانتقالية، مثل Oncomine Comprehensive Assay. ^{[ 56 ]} وتركز الشركة على استخدام التسلسل العميق للجينات المرتبطة بالسرطان للكشف عن المتغيرات الجينية النادرة.

يمكن استخدام أدوات التشخيص الجزيئي لتقييم خطر الإصابة بالسرطان. على سبيل المثال، يُقيّم اختبار BRCA1/2 من شركة Myriad Genetics خطر إصابة النساء بسرطان الثدي طوال حياتهن. ^{[ 22 ]} كما أن بعض أنواع السرطان لا تظهر عليها أعراض واضحة دائمًا. لذا، من المفيد إجراء فحوصات للأشخاص الذين لا تظهر عليهم أعراض واضحة، وبالتالي يمكن الكشف عن السرطان في مراحله المبكرة. على سبيل المثال، يمكن استخدام اختبار ColoGuard لفحص الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 55 عامًا للكشف عن سرطان القولون والمستقيم . ^{[ 57 ]} يُعد السرطان مرضًا طويل الأمد ذو مراحل تطور متعددة، ويمكن استخدام أدوات التشخيص الجزيئي للتنبؤ بمسار تطور السرطان. على سبيل المثال، يمكن لاختبار OncoType Dx من شركة Genomic Health تقدير خطر الإصابة بسرطان الثدي. إذ تُتيح تقنيتهم ​​للمرضى طلب العلاج الكيميائي عند الضرورة من خلال فحص مستويات التعبير الجيني في أنسجة خزعة سرطان الثدي. ^{[ 58 ]}

مع تزايد الدعم الحكومي لتشخيص السرطان الجزيئي، يُتوقع أن يتوفر قريباً عدد متزايد من فحوصات الكشف السريري عن الحمض النووي للكشف عن السرطان. وتشهد أبحاث تشخيص السرطان حالياً تطوراً سريعاً، بهدف خفض التكاليف وتقليل الوقت المستغرق في التشخيص، وتوفير أساليب أبسط للأطباء والمرضى.

يتزايد استخدام التشخيص الجزيئي في علم الحساسية، لا سيما حساسية الطعام والجهاز التنفسي. يعتمد التشخيص التقليدي على التاريخ المرضي، واختبار وخز الجلد، وقياس مستوى الغلوبولين المناعي E ( IgE) النوعي لمستخلصات مسببات الحساسية الكاملة في مصل الدم. أما التشخيص الجزيئي للحساسية، والذي يُعرف أيضًا بالتشخيص المُفصّل للمكونات، فيقيس مستوى IgE لجزيئات مسببات الحساسية الفردية، وليس فقط لمستخلصاتها. وهذا يُساعد في التمييز بين التحسس الحقيقي والتفاعل المتبادل، وتحسين تقييم المخاطر السريرية في بعض أنواع الحساسية، ودعم القرارات المتعلقة بالعلاج المناعي لمسببات الحساسية. تُمكّن المنصات متعددة التحليلات، مثل Allergy Explorer (ALEX)، من اختبار تفاعل IgE مع العديد من مستخلصات مسببات الحساسية والمكونات الجزيئية في اختبار واحد. يُعد التشخيص الجزيئي الدقيق للحساسية (PAMD®) نهجًا تشخيصيًا أوسع نطاقًا، حيث يستخدم ملامح IgE الجزيئية لتوجيه التنبؤ، وتقييم المخاطر، والإدارة الشخصية، مع ضرورة تفسير النتائج في ضوء التاريخ المرضي للمريض. ^{[ 59 ]}