محاذاة التسلسل

المرجع  : GTCGTAGAATA القراءة : CACGTAG—TA CIGAR: 2S5M2D2M حيث: 2S = قصّان ناعمان (قد يكونان عدم تطابق، أو قراءة أطول من التسلسل المطابق) 5M = 5 تطابقات أو عدم تطابقات 2D = حذفان 2M = تطابقان أو عدم تطابقان

لم يميز تنسيق CIGAR الأصلي من برنامج المحاذاة exonerate بين حالات عدم التطابق أو التطابقات التي تحتوي على الحرف M.

تحدد وثيقة مواصفات SAMv1 رموز CIGAR الأحدث. في معظم الحالات، يُفضل استخدام الرمزين '=' و'X' للدلالة على التطابقات أو عدم التطابقات بدلاً من الرمز 'M' القديم، الذي يُعد غامضاً.

• يشير "يستهلك الاستعلام" و "يستهلك المرجع" إلى ما إذا كانت عملية CIGAR تتسبب في أن يتحرك المحاذاة على طول تسلسل الاستعلام وتسلسل المرجع على التوالي.
• لا يمكن أن يكون H موجودًا إلا كعملية أولى و/أو أخيرة.
• لا يمكن أن تحتوي S إلا على عمليات H بينها وبين نهايات سلسلة CIGAR.
• في عملية محاذاة الحمض النووي الريبوزي الرسول مع الجينوم، تمثل العملية N إنترونًا. أما في أنواع المحاذاة الأخرى، فإن تفسير N غير محدد.
• يجب أن يساوي مجموع أطوال عمليات M/I/S/=/X طول التسلسل SEQ

إحدى طرق قياس فائدة محاذاة ثنائية معينة هي " التطابق الفريد الأقصى " (MUM)، أو أطول تسلسل فرعي يظهر في كلا تسلسلي الاستعلام. تعكس تسلسلات MUM الأطول عادةً قرابة أوثق ^{[ 9 ]} في محاذاة التسلسلات المتعددة للجينومات في علم الأحياء الحاسوبي . يُعد تحديد MUMs وغيرها من نقاط الارتكاز المحتملة الخطوة الأولى في أنظمة المحاذاة الأكبر مثل MUMmer . نقاط الارتكاز هي المناطق بين جينومين حيث يكونان متشابهين للغاية. لفهم ماهية MUM، يمكننا تحليل كل كلمة في الاختصار. تعني كلمة "تطابق" أن السلسلة الفرعية تظهر في كلا التسلسلين المراد محاذاتهما. تعني كلمة "فريد" أن السلسلة الفرعية تظهر مرة واحدة فقط في كل تسلسل. وأخيرًا، تعني كلمة "أقصى" أن السلسلة الفرعية ليست جزءًا من سلسلة أخرى أطول تستوفي الشرطين السابقين. الفكرة وراء ذلك هي أن التسلسلات الطويلة التي تتطابق تمامًا وتظهر مرة واحدة فقط في كل جينوم هي بالتأكيد جزء من المحاذاة الشاملة.

وبشكل أدق:

"بالنظر إلى جينومين A و B، فإن السلسلة الفرعية ذات التطابق الفريد الأقصى (MUM) هي سلسلة فرعية مشتركة بين A و B بطول أطول من الحد الأدنى المحدد d (افتراضيًا d = 20) بحيث

• إنها قصوى، أي لا يمكن تمديدها من أي من طرفيها دون حدوث عدم تطابق؛ و
• إنها فريدة في كلا التسلسلين" ^{[ 10 ]}

يُعدّ أسلوب المصفوفة النقطية، الذي يُنتج ضمنيًا مجموعة من المحاذاة لمناطق التسلسل الفردية، أسلوبًا نوعيًا وبسيطًا من الناحية المفاهيمية، ولكنه يستغرق وقتًا طويلًا عند تحليله على نطاق واسع. في غياب التشويش، يُمكن بسهولة تحديد بعض سمات التسلسل بصريًا - مثل الإضافات، والحذف، والتكرارات، أو التكرارات المعكوسة - من مخطط المصفوفة النقطية. لإنشاء مخطط المصفوفة النقطية ، يُكتب التسلسلان على طول الصف العلوي والعمود الأيسر لمصفوفة ثنائية الأبعاد، وتُوضع نقطة عند أي نقطة تتطابق فيها الأحرف في الأعمدة المناسبة - وهذا هو مخطط التكرار النموذجي . تُغيّر بعض التطبيقات حجم النقطة أو شدتها اعتمادًا على درجة تشابه الحرفين، لاستيعاب الاستبدالات المحافظة. ستظهر مخططات النقاط للتسلسلات شديدة الترابط كخط واحد على طول القطر الرئيسي للمصفوفة .

تشمل مشاكل مخططات النقاط كتقنية لعرض المعلومات: التشويش، وعدم الوضوح، وعدم سهولة الاستخدام، وصعوبة استخراج إحصائيات ملخص التطابق ومواقع التطابق على التسلسلين. كما يوجد مساحة مهدرة كبيرة حيث تتكرر بيانات التطابق بشكل طبيعي عبر القطر، وتشغل المساحة الفارغة أو التشويش معظم مساحة المخطط، وأخيرًا، تقتصر مخططات النقاط على تسلسلين. لا تنطبق أي من هذه القيود على مخططات محاذاة Miropeats، ولكنها تعاني من عيوبها الخاصة.

يمكن استخدام مخططات النقاط لتقييم التكرار في تسلسل واحد. يُرسم التسلسل مقابل نفسه، وتظهر المناطق التي تتشارك في أوجه تشابه كبيرة كخطوط خارج القطر الرئيسي. يحدث هذا التأثير عندما يتكون البروتين من نطاقات هيكلية متعددة متشابهة .

يمكن تطبيق تقنية البرمجة الديناميكية لإنتاج محاذاة شاملة باستخدام خوارزمية نيدلمان-وونش ، ومحاذاة محلية باستخدام خوارزمية سميث-واترمان . في الاستخدام المعتاد، تستخدم محاذاة البروتينات مصفوفة استبدال لتعيين درجات لتطابق أو عدم تطابق الأحماض الأمينية، وعقوبة فجوة لمطابقة حمض أميني في تسلسل ما مع فجوة في تسلسل آخر. قد تستخدم محاذاة الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA مصفوفة تسجيل، ولكن عمليًا غالبًا ما يتم تعيين درجة تطابق موجبة، ودرجة عدم تطابق سالبة، وعقوبة فجوة سالبة. (في البرمجة الديناميكية القياسية، تكون درجة كل موضع حمض أميني مستقلة عن هوية جيرانه، وبالتالي لا تُؤخذ تأثيرات تكديس القواعد في الاعتبار. ومع ذلك، من الممكن مراعاة هذه التأثيرات عن طريق تعديل الخوارزمية). من الامتدادات الشائعة لتكاليف الفجوة الخطية القياسية تكاليف الفجوة الأفينية. هنا، يتم تطبيق عقوبتين مختلفتين لفتح فجوة ولتمديدها. عادةً ما تكون الأولى أكبر بكثير من الثانية، على سبيل المثال -10 لفتح الفجوة و-2 لتمديدها. ينتج عن ذلك عدد أقل من الفجوات في المحاذاة، مع الحفاظ على بقايا الأحماض الأمينية والفجوات معًا، وهي سمات أكثر تمثيلًا للتسلسلات البيولوجية. تُطبّق خوارزمية غوتو تكاليف الفجوات الخطية باستخدام ثلاث مصفوفات. ^{[ 11 ] [ 12 ]}

يمكن أن تكون البرمجة الديناميكية مفيدة في محاذاة تسلسلات النيوكليوتيدات مع تسلسلات البروتينات، وهي مهمة معقدة بسبب الحاجة إلى مراعاة طفرات الإزاحة الإطارية (عادةً ما تكون إدخالات أو حذف). تُنتج طريقة البحث عن الإطار سلسلة من المحاذيات الثنائية العالمية أو المحلية بين تسلسل نيوكليوتيدات مُستعلم عنه ومجموعة بحث من تسلسلات البروتينات، أو العكس. إن قدرتها على تقييم إزاحات الإطار التي تُزاح بعدد عشوائي من النيوكليوتيدات تجعل هذه الطريقة مفيدة للتسلسلات التي تحتوي على أعداد كبيرة من الإدخالات والحذف، والتي قد يصعب محاذاتها باستخدام طرق استدلالية أكثر كفاءة. عمليًا، تتطلب هذه الطريقة قدرة حاسوبية كبيرة أو نظامًا مُصممًا خصيصًا للبرمجة الديناميكية. توفر مجموعتا BLAST و EMBOSS أدوات أساسية لإنشاء محاذيات مُترجمة (على الرغم من أن بعض هذه الأساليب تستفيد من الآثار الجانبية لقدرات البحث عن التسلسل في هذه الأدوات). تتوفر طرق أكثر عمومية من خلال برامج مفتوحة المصدر مثل GeneWise .

تضمن طريقة البرمجة الديناميكية إيجاد محاذاة مثالية بناءً على دالة تقييم محددة؛ إلا أن تحديد دالة تقييم جيدة غالبًا ما يكون مسألة تجريبية وليست نظرية. ورغم إمكانية توسيع نطاق البرمجة الديناميكية لتشمل أكثر من سلسلتين، إلا أنها بطيئة للغاية عند التعامل مع أعداد كبيرة من السلاسل أو السلاسل الطويلة جدًا.

تُعرف طرق الكلمات، أو طرق k -tuple، بأنها طرق استدلالية لا تضمن إيجاد حل محاذاة مثالي، ولكنها أكثر كفاءة بشكل ملحوظ من البرمجة الديناميكية. تُعد هذه الطرق مفيدة بشكل خاص في عمليات البحث في قواعد البيانات واسعة النطاق، حيث يُفترض أن نسبة كبيرة من التسلسلات المرشحة لن يكون لها تطابق يُذكر مع تسلسل الاستعلام. تشتهر طرق الكلمات بتطبيقها في أدوات البحث في قواعد البيانات FASTA وعائلة BLAST . ^{[ 1 ]} تُحدد طرق الكلمات سلسلة من التسلسلات الفرعية القصيرة غير المتداخلة ("الكلمات") في تسلسل الاستعلام، والتي تُطابق بعد ذلك مع تسلسلات قاعدة البيانات المرشحة. يُطرح الموضع النسبي للكلمة في التسلسلين المُقارنين للحصول على إزاحة؛ وهذا يُشير إلى منطقة محاذاة إذا أنتجت كلمات متعددة ومختلفة نفس الإزاحة. فقط في حال اكتشاف هذه المنطقة، تُطبق هذه الطرق معايير محاذاة أكثر حساسية؛ وبالتالي، يتم التخلص من العديد من المقارنات غير الضرورية مع التسلسلات التي لا يوجد تشابه يُذكر.

في طريقة FASTA، يُحدد المستخدم قيمة k لاستخدامها كطول الكلمة للبحث في قاعدة البيانات. تكون هذه الطريقة أبطأ ولكنها أكثر حساسية عند قيم k المنخفضة ، وهي القيم المُفضلة أيضًا لعمليات البحث التي تتضمن تسلسل استعلام قصير جدًا. توفر عائلة BLAST من طرق البحث عددًا من الخوارزميات المُحسّنة لأنواع مُحددة من الاستعلامات، مثل البحث عن تطابقات تسلسلية متباعدة الصلة. طُوّرت BLAST لتوفير بديل أسرع لـ FASTA دون التضحية بالكثير من الدقة؛ فمثل FASTA، تستخدم BLAST بحثًا عن الكلمات بطول k ، ولكنها تُقيّم فقط تطابقات الكلمات الأكثر أهمية، بدلًا من كل تطابق كلمة كما تفعل FASTA. تستخدم معظم تطبيقات BLAST طول كلمة افتراضيًا ثابتًا مُحسّنًا لنوع الاستعلام وقاعدة البيانات، ولا يتغير إلا في ظروف خاصة، مثل البحث باستخدام تسلسلات استعلام متكررة أو قصيرة جدًا. يمكن العثور على التطبيقات عبر عدد من البوابات الإلكترونية، مثل EMBL FASTA و NCBI BLAST .

تُعدّ تقنية البرمجة الديناميكية قابلة للتطبيق نظريًا على أي عدد من التسلسلات؛ إلا أنها، نظرًا لتكلفتها الحسابية العالية من حيث الوقت والذاكرة ، نادرًا ما تُستخدم لأكثر من ثلاثة أو أربعة تسلسلات في أبسط صورها. تتطلب هذه الطريقة إنشاء مكافئ ذي n بُعد لمصفوفة التسلسل المُشكّلة من تسلسلين، حيث n هو عدد التسلسلات في الاستعلام. تُطبّق البرمجة الديناميكية القياسية أولًا على جميع أزواج تسلسلات الاستعلام، ثم تُملأ "مساحة المحاذاة" من خلال النظر في التطابقات أو الفجوات المحتملة في المواضع الوسيطة، لتُنشئ في النهاية محاذاة بين كل محاذاة لتسلسلين. على الرغم من أن هذه التقنية مُكلفة حسابيًا، إلا أن ضمانها لحل أمثل عالمي يُعدّ مفيدًا في الحالات التي لا تتطلب سوى محاذاة عدد قليل من التسلسلات بدقة. وقد طُبّقت إحدى طرق تقليل المتطلبات الحسابية للبرمجة الديناميكية، والتي تعتمد على دالة الهدف "مجموع الأزواج"، في حزمة برامج MSA ^{[ تم حذف الرابط ]} . ^{[ 15 ]}

تُنشئ الطرق التدريجية أو الهرمية أو الشجرية محاذاة تسلسلية متعددة من خلال محاذاة التسلسلات الأكثر تشابهًا أولًا، ثم إضافة التسلسلات أو المجموعات الأقل تشابهًا تدريجيًا إلى المحاذاة حتى يتم دمج مجموعة الاستعلام بأكملها في الحل. تعتمد الشجرة الأولية التي تصف ترابط التسلسلات على مقارنات ثنائية قد تتضمن طرق محاذاة ثنائية استدلالية مشابهة لـ FASTA . تعتمد نتائج المحاذاة التدريجية على اختيار التسلسلات "الأكثر ترابطًا"، وبالتالي قد تتأثر بعدم دقة المقارنات الثنائية الأولية. بالإضافة إلى ذلك، تُرجّح معظم طرق المحاذاة التدريجية المتعددة التسلسلات في مجموعة الاستعلام وفقًا لترابطها، مما يقلل من احتمالية اختيار تسلسلات أولية غير مناسبة، وبالتالي يُحسّن دقة المحاذاة.

تُستخدم العديد من صيغ تطبيق Clustal التدريجي ^{[ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]} في محاذاة التسلسلات المتعددة، وبناء الأشجار التطورية، وكبيانات إدخال للتنبؤ ببنية البروتين . ويُعرف أحد المتغيرات الأبطأ ولكن الأكثر دقة من الطريقة التدريجية باسم T-Coffee . ^{[ 19 ]}

تسعى الطرق التكرارية إلى التغلب على الاعتماد الكبير على دقة عمليات المحاذاة الثنائية الأولية، والتي تُعدّ نقطة ضعف الطرق التقدمية. تعمل هذه الطرق على تحسين دالة الهدف بناءً على طريقة مُختارة لتقييم المحاذاة، وذلك بتحديد محاذاة شاملة أولية ثم إعادة محاذاة مجموعات فرعية من التسلسل. بعد ذلك، تُحاذى المجموعات الفرعية المُعاد محاذاتها بدورها لإنتاج محاذاة التسلسل المتعددة للتكرار التالي. تُستعرض طرق مختلفة لاختيار مجموعات التسلسل الفرعية ودالة الهدف في المرجع ^{[ 20 ] .}

تعتمد تقنية البحث عن الأنماط، المعروفة أيضًا بتحليل الملفات التعريفية، على إنشاء محاذاة تسلسلية متعددة شاملة، بهدف تحديد أنماط التسلسل المحفوظة القصيرة بين التسلسلات في مجموعة الاستعلام. ويتم ذلك عادةً بإنشاء محاذاة تسلسلية متعددة شاملة أولًا، ثم عزل المناطق المحفوظة بدرجة عالية واستخدامها لإنشاء مجموعة من مصفوفات الملفات التعريفية. تُرتّب مصفوفة الملف التعريفي لكل منطقة محفوظة على غرار مصفوفة التسجيل، ولكن تُستمدّ قيم التكرار لكل حمض أميني أو نيوكليوتيد في كل موضع من توزيع الأحرف في المنطقة المحفوظة، بدلًا من توزيع تجريبي أكثر عمومية. تُستخدم مصفوفات الملفات التعريفية بعد ذلك للبحث في تسلسلات أخرى عن وجود النمط الذي تُميّزه. في الحالات التي تحتوي فيها مجموعة البيانات الأصلية على عدد قليل من التسلسلات، أو على تسلسلات شديدة الصلة فقط، تُضاف قيم افتراضية لتطبيع توزيعات الأحرف المُمثلة في النمط.

تم تطبيق مجموعة متنوعة من خوارزميات التحسين العامة الشائعة الاستخدام في علوم الحاسوب على مشكلة محاذاة التسلسلات المتعددة. استُخدمت نماذج ماركوف المخفية لإنتاج درجات احتمالية لمجموعة من محاذاة التسلسلات المتعددة المحتملة لمجموعة استعلام معينة؛ على الرغم من أن الطرق المبكرة القائمة على نماذج ماركوف المخفية لم تُحقق أداءً مُرضيًا، إلا أن التطبيقات اللاحقة وجدتها فعالة بشكل خاص في اكتشاف التسلسلات ذات الصلة البعيدة لأنها أقل عرضة للتشويش الناتج عن الاستبدالات المحافظة أو شبه المحافظة. ^{[ 21 ]} كما استُخدمت الخوارزميات الجينية ومحاكاة التلدين في تحسين درجات محاذاة التسلسلات المتعددة وفقًا لدالة تسجيل مثل طريقة مجموع الأزواج. يمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل وحزم البرامج في المقالة الرئيسية " محاذاة التسلسلات المتعددة" .

تم تطبيق تحويل بوروز-ويلر بنجاح على محاذاة القراءات القصيرة السريعة في أدوات شائعة مثل Bowtie و BWA . انظر فهرس FM .

طريقة DALI، أو محاذاة مصفوفة المسافة ، هي طريقة تعتمد على التجزئة لإنشاء محاذاة هيكلية بناءً على أنماط تشابه التلامس بين الببتيدات السداسية المتتالية في تسلسلات الاستعلام. ^{[ 24 ]} يمكنها توليد محاذاة ثنائية أو متعددة وتحديد الجيران الهيكليين لتسلسل الاستعلام في بنك بيانات البروتين (PDB). وقد استُخدمت لإنشاء قاعدة بيانات محاذاة FSSP الهيكلية (تصنيف الطيات بناءً على محاذاة بنية البروتينات، أو عائلات البروتينات المتشابهة هيكليًا). يمكن الوصول إلى خادم DALI عبر الإنترنت من خلال DALI ، بينما تقع قاعدة بيانات FSSP في قاعدة بيانات DALI .

برنامج SSAP (برنامج محاذاة البنية التسلسلية) هو طريقة تعتمد على البرمجة الديناميكية لمحاذاة البنية، وتستخدم متجهات الذرات في فضاء البنية كنقاط مقارنة. وقد تم توسيعه منذ وصفه الأصلي ليشمل المحاذاة المتعددة والثنائية، ^{[ 25 ]} واستُخدم في بناء قاعدة بيانات CATH (الفئة، البنية، الطوبولوجيا، التماثل) الهرمية لتصنيف طيات البروتين. ^{[ 26 ]} يمكن الوصول إلى قاعدة بيانات CATH من خلال CATH Protein Structure Classification .

تُنشئ طريقة التمديد التوافقي للمحاذاة الهيكلية محاذاة هيكلية ثنائية باستخدام الهندسة المحلية لمحاذاة أجزاء قصيرة من البروتينين قيد التحليل، ثم تُجمّع هذه الأجزاء في محاذاة أكبر. ^{[ 27 ]} استنادًا إلى مقاييس مثل متوسط ​​الجذر التربيعي للمسافة الصلبة ، ومسافات الأحماض الأمينية، والبنية الثانوية المحلية، وخصائص البيئة المحيطة مثل كراهية الماء بين الأحماض الأمينية المجاورة ، تُنشأ محاذاة محلية تُسمى "أزواج الأجزاء المُحاذية" وتُستخدم لبناء مصفوفة تشابه تُمثل جميع المحاذاة الهيكلية الممكنة ضمن معايير قطع مُحددة مسبقًا. بعد ذلك، يُتتبع مسار من حالة بنية بروتينية إلى أخرى عبر المصفوفة عن طريق تمديد المحاذاة المتنامية جزءًا تلو الآخر. يُحدد المسار الأمثل محاذاة التمديد التوافقي. يوجد خادم ويب يُنفذ هذه الطريقة ويُوفر قاعدة بيانات للمحاذاة الثنائية للهياكل في بنك بيانات البروتين على موقع التمديد التوافقي .

تُعدّ محاذاة التسلسلات مفيدة في المعلوماتية الحيوية لتحديد تشابه التسلسلات، وإنتاج الأشجار التطورية، وتطوير نماذج التماثل لبنية البروتينات. مع ذلك، فإن الأهمية البيولوجية لمحاذاة التسلسلات ليست واضحة دائمًا. يُفترض غالبًا أن المحاذاة تعكس درجة من التغير التطوري بين التسلسلات المنحدرة من سلف مشترك؛ ومع ذلك، من الممكن نظريًا أن يحدث تطور تقاربي ينتج عنه تشابه ظاهري بين بروتينات غير مرتبطة تطوريًا ولكنها تؤدي وظائف متشابهة ولها بنى متشابهة.

في عمليات البحث في قواعد البيانات، مثل BLAST، تُستخدم الأساليب الإحصائية لتحديد احتمالية ظهور محاذاة معينة بين تسلسلات أو مناطق تسلسلية بالصدفة، وذلك بناءً على حجم قاعدة البيانات وتكوينها. وتختلف هذه الاحتمالية اختلافًا كبيرًا تبعًا لنطاق البحث. فعلى وجه الخصوص، تزداد احتمالية العثور على محاذاة معينة بالصدفة إذا كانت قاعدة البيانات تتكون فقط من تسلسلات من نفس الكائن الحي الذي ينتمي إليه تسلسل الاستعلام. كما أن التسلسلات المتكررة في قاعدة البيانات أو الاستعلام قد تُشوه نتائج البحث وتقييم الدلالة الإحصائية؛ لذا يقوم BLAST تلقائيًا بتصفية هذه التسلسلات المتكررة في الاستعلام لتجنب النتائج الظاهرية التي هي في الواقع نتائج غير دقيقة إحصائيًا.

تتوفر في الأدبيات العلمية طرق لتقدير الدلالة الإحصائية لمحاذاة التسلسلات ذات الفجوات. ^{[ 28 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ]}

تشير الدلالة الإحصائية إلى احتمالية ظهور محاذاة بجودة معينة بالصدفة، لكنها لا تُبين مدى تفوق محاذاة معينة على المحاذاة البديلة لنفس التسلسلات. تُشير مقاييس مصداقية المحاذاة إلى مدى تشابه أفضل المحاذاة المُسجلة لزوج معين من التسلسلات. تتوفر في الأدبيات العلمية طرق لتقدير مصداقية المحاذاة للتسلسلات ذات الفجوات. ^{[ 37 ]}

يُعدّ اختيار دالة تقييم تعكس الملاحظات البيولوجية أو الإحصائية حول التسلسلات المعروفة أمرًا بالغ الأهمية لإنتاج محاذاة جيدة. غالبًا ما تُحاذى تسلسلات البروتين باستخدام مصفوفات الاستبدال التي تعكس احتمالات استبدال الأحرف. تُشفّر سلسلة من المصفوفات تُسمى مصفوفات PAM (مصفوفات الطفرات المقبولة نقطيًا، والتي عرّفتها مارغريت دايوف في الأصل ، ويُشار إليها أحيانًا باسم "مصفوفات دايوف") بشكل صريح تقريبات تطورية تتعلق بمعدلات واحتمالات طفرات الأحماض الأمينية المحددة. وهناك سلسلة أخرى شائعة من مصفوفات التقييم، تُعرف باسم BLOSUM (مصفوفة استبدال الكتل)، تُشفّر احتمالات الاستبدال المستمدة تجريبيًا. تُستخدم متغيرات من كلا النوعين من المصفوفات للكشف عن التسلسلات ذات مستويات التباين المختلفة، مما يسمح لمستخدمي BLAST أو FASTA بتقييد عمليات البحث إلى التطابقات الأكثر ترابطًا أو توسيع نطاقها للكشف عن التسلسلات الأكثر تباينًا. تُراعي عقوبات الفجوات إدخال فجوة - في النموذج التطوري، طفرة إدخال أو حذف - في كل من تسلسلات النيوكليوتيدات والبروتينات، وبالتالي ينبغي أن تتناسب قيم العقوبات مع المعدل المتوقع لمثل هذه الطفرات. وعليه، تعتمد جودة عمليات المحاذاة الناتجة على جودة دالة التقييم.

قد يكون من المفيد والمثمر للغاية تجربة نفس عملية المحاذاة عدة مرات مع اختيار قيم مختلفة لمصفوفة التقييم و/أو جزاءات الفجوات، ثم مقارنة النتائج. ويمكن غالباً تحديد المناطق التي يكون فيها الحل ضعيفاً أو غير فريد من خلال ملاحظة أي مناطق المحاذاة تكون ثابتة في مواجهة التغيرات في معايير المحاذاة.