التطور الموجه

تتمثل الخطوة الأولى في تنفيذ دورة التطور الموجه في إنشاء مكتبة من الجينات المتغيرة. يُعدّ فضاء التسلسل العشوائي واسعًا للغاية ( ¹⁰¹³⁰ تسلسلًا محتملًا لبروتين مكون من 100 حمض أميني )، ولكنه يفتقر بشدة إلى البروتينات الوظيفية. لا يمكن للتطور التجريبي ^{[ 12 ]} ولا الطبيعي ^{[ 13 ]} أن يقتربا من استكشاف هذا الكم الهائل من التسلسلات. بالطبع، يستكشف التطور الطبيعي التسلسلات المتغيرة القريبة من تسلسلات البروتينات الوظيفية، ويُحاكى هذا في التطور الموجه عن طريق إحداث طفرات في جين وظيفي بالفعل. تشير بعض الحسابات إلى أنه من الممكن تمامًا، ولجميع الأغراض العملية (أي الوظيفية والبنيوية)، أن يكون فضاء تسلسل البروتينات قد تم استكشافه بالكامل خلال مسيرة تطور الحياة على الأرض. ^{[ 13 ]}

يمكن تحوير الجين الأصلي عن طريق طفرات نقطية عشوائية (باستخدام المطفرات الكيميائية أو تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ ) ^{[ 14 ] [ 15 ]} ، وعن طريق الإدخالات والحذف (باستخدام العناصر المتحركة) ^{[ 16 ]} . ويمكن محاكاة إعادة تركيب الجينات عن طريق إعادة ترتيب الحمض النووي ^{[ 17 ] [ 18 ]} لعدة تسلسلات (عادةً ما تكون نسبة تطابق التسلسل فيها أكثر من 70%) للانتقال إلى مناطق في فضاء التسلسل بين الجينات الأصلية المعاد ترتيبها. وأخيرًا، يمكن تغيير مناطق محددة من الجين بشكل عشوائي منهجي ^{[ 19 ]} لاتباع نهج أكثر تركيزًا يعتمد على معرفة البنية والوظيفة. وبحسب الطريقة المستخدمة، ستختلف المكتبة الناتجة في نسبة المتغيرات الوظيفية التي تحتويها. حتى لو تم استخدام كائن حي للتعبير عن الجين محل الاهتمام، فإن تحوير هذا الجين فقط يُبقي بقية جينوم الكائن الحي كما هو، ويمكن تجاهله في تجربة التطور (لضمان توفير بيئة جينية ثابتة).

معظم الطفرات ضارة، ولذلك تميل مكتبات الطفرات إلى احتواء أغلبها على متغيرات ذات نشاط منخفض . ^{[ 20 ]} لذا، يُعدّ التحليل عالي الإنتاجية ضروريًا لقياس النشاط واكتشاف المتغيرات النادرة ذات الطفرات المفيدة التي تُحسّن الخصائص المطلوبة. توجد فئتان رئيسيتان من الطرق لعزل المتغيرات الوظيفية. تربط أنظمة الانتقاء وظيفة البروتين مباشرةً ببقاء الجين، بينما تفحص أنظمة الفرز كل متغير على حدة، وتسمح بتحديد عتبة كمية لفرز متغير أو مجموعة من المتغيرات ذات النشاط المطلوب. يمكن إجراء كل من الانتقاء والفرز في الخلايا الحية ( التطور داخل الجسم الحي ) أو مباشرةً على البروتين أو الحمض النووي الريبي دون أي خلايا ( التطور في المختبر ). ^{[ 21 ] [ 22 ]}

أثناء التطور الحيوي ، تُحوَّل كل خلية (عادةً بكتيريا أو خميرة ) ببلازميد يحتوي على عضو مختلف من مكتبة المتغيرات. وبهذه الطريقة، يختلف الجين محل الاهتمام فقط بين الخلايا، بينما تبقى جميع الجينات الأخرى كما هي. تُعبِّر الخلايا عن البروتين إما في سيتوبلازمها أو على سطحها حيث يمكن اختبار وظيفته. يتميز هذا الأسلوب بميزة اختيار الخصائص في بيئة خلوية، وهو أمر مفيد عند استخدام البروتين أو الحمض النووي الريبوزي المُطوَّر في الكائنات الحية. عند إجرائه بدون خلايا، يتضمن التطور التفاضلي استخدام النسخ والترجمة في المختبر لإنتاج البروتينات أو الحمض النووي الريبوزي الحر في المحلول أو المُعبأ في قطرات دقيقة اصطناعية . تتميز هذه الطريقة بتعدد استخداماتها في ظروف الاختيار (مثل درجة الحرارة والمذيب)، ويمكنها التعبير عن بروتينات قد تكون سامة للخلايا. علاوة على ذلك، يمكن لتجارب التطور في المختبر توليد مكتبات أكبر بكثير (تصل إلى 10^ ¹⁵ ) لأن الحمض النووي للمكتبة لا يحتاج إلى إدخاله في الخلايا (وهي خطوة غالبًا ما تكون مُحدِّدة).

بعد عزل البروتينات الوظيفية، يصبح من الضروري عزل جيناتها أيضًا، مما يستلزم وجود ارتباط بين النمط الجيني والنمط الظاهري . ^{[ 24 ]} يمكن أن يكون هذا الارتباط تساهميًا، كما في تقنية عرض mRNA حيث يرتبط جين mRNA بالبروتين في نهاية عملية الترجمة بواسطة البوروميسين. ^{[ 12 ]} بدلاً من ذلك، يمكن تحديد موقع البروتين وجينه معًا عن طريق التجزئة الخلوية في الخلايا الحية ^{[ 26 ]} أو قطرات المستحلب. ^{[ 27 ]} تُضخّم تسلسلات الجينات المعزولة بعد ذلك بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو بواسطة بكتيريا مضيفة مُحوّلة. يمكن استخدام إما أفضل تسلسل منفرد، أو مجموعة من التسلسلات، كقالب للجولة التالية من الطفرات. تُنتج الدورات المتكررة للتنويع والاختيار والتضخيم متغيرات بروتينية مُتكيفة مع ضغوط الاختيار المُطبقة.

يعتمد التصميم العقلاني للبروتين على معرفة متعمقة ببنيته وآلية عمله التحفيزي . ^{[ 28 ] [ 29 ]} تُجرى بعد ذلك تغييرات محددة باستخدام الطفرات الموجهة للموقع في محاولة لتغيير وظيفة البروتين. ومن عيوب هذه الطريقة أنه حتى عندما تكون بنية البروتين وآلية عمله معروفة جيدًا، يظل من الصعب التنبؤ بالتغيير الناتج عن الطفرة. لذلك، تتمثل إحدى مزايا التصميم التفاضلي في عدم الحاجة إلى فهم آلية النشاط المطلوب أو كيفية تأثير الطفرات عليه. ^{[ 30 ]}

من عيوب التطور الموجه الحاجة إلى تحليل عالي الإنتاجية لقياس تأثيرات عدد كبير من الطفرات العشوائية المختلفة. وهذا يتطلب بحثًا وتطويرًا مكثفًا قبل استخدامه في التطور الموجه. إضافةً إلى ذلك، غالبًا ما تكون هذه التحليلات شديدة التخصص في رصد نشاط معين، وبالتالي لا يمكن تطبيقها على تجارب التطور الموجه الجديدة. ^{[ 31 ]}

بالإضافة إلى ذلك، فإن اختيار تحسين الوظيفة المُقاسة يُؤدي ببساطة إلى تحسينات في تلك الوظيفة. لفهم كيفية تحقيق هذه التحسينات، يجب قياس خصائص الإنزيم المُتطور. قد يعود تحسين النشاط المُقاس إلى تحسينات في النشاط التحفيزي للإنزيم أو تركيزه. كما لا يوجد ما يضمن أن التحسين على ركيزة واحدة سيُحسّن النشاط على ركيزة أخرى. يُعد هذا الأمر بالغ الأهمية عندما يتعذر فحص النشاط المطلوب أو اختياره مباشرةً، وبالتالي يتم استخدام ركيزة بديلة. قد يُؤدي التطور التفاضلي إلى تخصص تطوري للركيزة البديلة دون تحسين النشاط المطلوب. ونتيجةً لذلك، يُعد اختيار ظروف الفحص أو الاختيار المناسبة أمرًا حيويًا لنجاح التطور التفاضلي. ^{[ 32 ]}

تُشكل سرعة التطور في التجارب قيدًا على جدوى التطور الموجه. فعلى سبيل المثال، قد يحدث تطور نمط ظاهري معين، رغم جدواه النظرية، على نطاقات زمنية غير عملية. ^{[ 33 ]} وقد سعت المناهج النظرية الحديثة إلى التغلب على قيد السرعة من خلال تطبيق تقنيات القيادة المضادة للتغيرات الحرارية من الفيزياء الإحصائية، إلا أن هذا لم يُطبق بعد في تجربة تطور موجه. ^{[ 34 ]}

يجري البحث في مناهج "شبه عقلانية" مُدمجة لمعالجة قصور كلٍّ من التصميم العقلاني والتطور الموجه. ^{[ 1 ] [ 35 ]} ونظرًا لندرة الطفرات المفيدة، يتطلب الأمر فحص أعداد كبيرة من الطفرات العشوائية للعثور على متغيرات محسّنة. وتركز "المكتبات المُركّزة" على إحداث طفرات عشوائية في المناطق التي يُعتقد أنها أغنى بالطفرات المفيدة، وذلك في خطوة إحداث الطفرات في التطور الموجه. وتحتوي المكتبة المُركّزة على عدد أقل من المتغيرات مقارنةً بمكتبة الطفرات العشوائية التقليدية، وبالتالي لا تتطلب هذا النوع من الفحص عالي الإنتاجية.

يتطلب إنشاء مكتبة مُركّزة معرفةً ببعض البقايا في البنية التي يجب تحويرها. على سبيل المثال، قد تسمح معرفة الموقع النشط للإنزيم بتغيير البقايا المعروفة بتفاعلها مع الركيزة عشوائيًا. ^{[ 36 ] [ 37 ]} وبالمثل، يمكن أن توجه معرفة مناطق البروتين المتغيرة بطبيعتها عملية التحوير في تلك المناطق تحديدًا. ^{[ 38 ] [ 39 ]}

كأداة لهندسة البروتين، حققت تقنية DE نجاحًا كبيرًا في ثلاثة مجالات:

1. تحسين استقرار البروتين للاستخدام في التكنولوجيا الحيوية في درجات حرارة عالية أو في المذيبات القاسية ^{[ 42 ] [ 43 ] [ 44 ]}
2. تحسين تقارب الارتباط للأجسام المضادة العلاجية ( نضج التقارب ) ^{[ 45 ]} ونشاط الإنزيمات المصممة حديثًا ^{[ 30 ]}
3. تغيير خصوصية الركيزة للإنزيمات الموجودة، ^{[ 46 ] [ 47 ] [ 48 ] [ 49 ]} (غالبًا للاستخدام في الصناعة) ^{[ 40 ]}

تعتمد دراسة التطور الطبيعي تقليديًا على الكائنات الحية الموجودة وجيناتها. ومع ذلك، فإن البحث محدودٌ بشكلٍ أساسي بسبب نقص الأحافير (وخاصةً نقص تسلسلات الحمض النووي القديمة ) ^{[ 50 ] [ 51 ]} والمعرفة غير الكاملة بالظروف البيئية القديمة. يدرس التطور الموجه التطور في نظام مُتحكم به من الجينات للإنزيمات الفردية ^[ 52 ] ^{[ 53 ] [ 35 ] والريبوزيمات [} 54 ^{] والمُضاعِفات [} 55 ^{] [ 3 ] ( على غرار} التطور التجريبي ^{للكائنات} حقيقية النواة [ ⁵⁶ ] ^{[ 57 ]} والكائنات بدائية النواة ^{[ 58 ]} والفيروسات ^{[ 59} ] ⁾ .

تتيح خوارزمية التطور التفاضلي التحكم في ضغط الانتقاء ، ومعدل الطفرات ، والبيئة (سواء البيئة غير الحيوية كدرجة الحرارة، أو البيئة الحيوية كجينات أخرى في الكائن الحي). إضافةً إلى ذلك، يتوفر سجل كامل لجميع الجينات الوسيطة في التطور. وهذا يسمح بإجراء قياسات دقيقة للعمليات التطورية، مثل التفاعل الجيني ، وقابلية التطور ، والقيود التكيفية ^{[ 60 ] [ 61 ]} ، وخرائط اللياقة ^{[ 62 ]} ، والشبكات العصبية ^{[ 63 ]} .

يمكن تغيير التركيب الطبيعي للأحماض الأمينية في البروتينات عن طريق استبدال الأحماض الأمينية المتعارف عليها بنظائر غير متعارف عليها مناسبة، وذلك تحت ضغط انتقائي مُطبق تجريبيًا . على سبيل المثال، جُرِّبت عمليات استبدال شاملة للأحماض الأمينية الطبيعية بنظائر مفلورة في بكتيريا الإشريكية القولونية ^{[ 64 ]} والعصوية الرقيقة ^{[ 65 ]} . وفي عام 2015، أبلغ بوديسا وسول ^{[ 66 ]} عن استبدال كامل للتريبتوفان بالثينوبيرول-ألانين استجابةً لـ 20899 كودون UGG في بكتيريا الإشريكية القولونية . ومن المتوقع أن يكون التطور التجريبي للسلالات الميكروبية، مع استيعاب واضح لحمض أميني إضافي، عاملاً أساسيًا في توسيع الشفرة الوراثية تجريبيًا. ^{[ 67 ]} عادةً ما يستهدف التطور الموجه جينًا معينًا لإحداث طفرات فيه ، ثم يفحص المتغيرات الناتجة بحثًا عن نمط ظاهري مرغوب فيه، غالبًا ما يكون مستقلاً عن تأثيرات اللياقة ، بينما يختار التطور المختبري التكيفي العديد من الطفرات على مستوى الجينوم التي تساهم في لياقة المزارع النامية بنشاط. ^{[ 68 ]}